užití api při stud i Zdeněk Glatz stav bioche Přírodovědecká fakulta Masarykova univerzita OFOREZ separačních ♦ Elektroforeza je soubo , které využívají k dělení látek jejich odlišnou pohyblivost ve stejnosměrném elektrickém poli. c Reuss 8 ES S* ■Ši Elektrofore (1909) eonor Michaelis Michaelis Menten Plot w. Vmax ; [S] Km + [S] Vmax asymtote ^m Substrate concentration [S] á elektrofo selius(1902 -1971) li á elektrofo Zónová elektroforéza Zónová elektroforéza abilizace ♦ m o dia 1939 >y fap/r >0 Aaarov ♦1950 Aga ♦1955 Ski o ♦1957 A. c ♦ 1959 Polyak ♦1979 A =] r o ový gel abilizace o Kapilární elektroforéza 1967 - Hjerten 3 mm kapilára Kapilární elektroforé 1981 - Jorgenson Lukacsová m kapilára A.B U -jJl 10 15 Tim« (minutes) ram of dansyl amino acids 20 Laboratory made C 989- 2003 Projekt lid lENCEphütO LIBRARY venace DNA Base O 2' o 5' CH2—O—P—O o- o o -p—o—P—O" o~ 0~ Template strand Primer strand Tube 1 dÄTP dGTP dTTP dCTP ©dATP f rl<~TP ^ ^ ACTA ACTAGCT/1 ACTAG ACTAGCTAf; dATP dGTP dTTP dCTP +#ddCTP 1 ACT ACTAGC7 ACTAGC ACTAGCTAOCr ACTAGCTAGO Electrophoresis gel Resulting X-ray image of primer strand sequence ACTAGCTA 3' T C G A I C G A I 5' G C T Extension of primer strand -OH 3' Figure 11-30 Concepts in Biochemistry, 3/e o n sta n ta 0,23 s1 103s - katalasa 7 . 107s Katalasa Číslo přem 40 000 1 molekula enzymu přemění 40 000 000 molekul substrátu za 1 s stanovení koncentrac 3 000 bílkovin Koncentrace r talytická aktivita Substrát Stanovení aktivitv enz j yrr. Klinická du Farmakologie - vývoj leciv Biotechnologické procesy Bioanalytická chemie 5 stanovení aktivity enzymu ♦ Spektrofotometrické ♦ Spektrofluorimetrick ♦ Elektrochemicko ♦ Radiochemické ♦ Separační - H —7 GC, CE nzyme Assays R.Eisenthal and M.J. Danson APPROACH in Enzymatic Analysis Rossomando H P LC EDWARD F. ROSSOMANDO odvCE ♦ Aplikační diverzita nabité i neutráln nízkomolekulární i chirální i achirální I bakterie i viry komolekulární látky átky \ Výhody C cirka CZE, MEKC, NACE, MEEK v> \ I I I I hody CE ♦ Aplikační diverzita ♦ Jednoduchá instrumentace ♦ Vysoké rozlišení a účinnost separací ♦ Malá spotřeba vzorku (nl) ♦ Rychlost analýzy (minuty) ♦ Malá spotřeba chemikálií a malé množství odpadů (10 ml den hody CE Sri dium enzymovych reakci bi CE Hi capillary I Precapillary Postcapillary -;ri. dium enzymových reakci cí CE MM e-capillary" provedení: m dete /\ A je používaná pouze pro separaci a - nutná manipu separací 1 zi enzymovou reakcí a T \ \ \ \ Kinetické stanoven glutathion S-transferass MU 175 H -r: - '2Í -j 100 75 : 21- : /_V-CH-^Hi . GSH GSH rs &5rrin 5í n " 22 Tl ' : Ti- I. conjugate —CH-CH—3H S-CHí-CHC0NHCH2C00H I NHCO CH; C Hi CHĺ N H;} CO O H OH Y-CH-CHj Í-CHi-CHCONHCHiCOOH I NHCOCH2CH2CH(NHi}COOH II. conjugate Conjugate II Conjugate I : -r mir Šišková, Z. et al. J. Sep. Sci., 2005, 28, 1357. cytochrom P450 2C9 mAU 16- 14-12-•:>- 8- 4 ,,, 5' 1 ls^>%,4' CYP2C9 HO-C II 0 N 1 I H C 2' HO-C 0 90 minutes 120 minutes !<~*J........, ^ L 60 minutes 30 minuses Diclofenac on CI . J, IU.—- UJ —kJ 4'-hydroxydiclofenac / 1^ I I Konecny, J. et al. Electrophoresis, 2007. 28, 1229. tudium enzymových reakcí omoci -capiMary" provedení : kapilára je navíc využita i jako reakční - stanovení je a smísení, inkubace, izováno - dávkování, ce, detekce => CE roforeticky zprostředkovaná ikroanalýza ctrophoretically Mediated MicroAnalysis EMM J. Bao, RE. Regnier, J. Chromatogr. 608, 217 (1992). rozdílná elektroforetická mobilita enzymu a jeho substrátu(ů) pro vyvolaní reakce pnmo v kapiláře 1 \ ft 4 / I r- l—1 Binir«i _f _| J_> ~! junn GWYNETH! TWO Thumbs Up!" EMMA miun mm .:I!-Ti - Menši spotřeb; substrátv. inhibi 1 'X/ / x > Vyhodnocovaní A - vvhodnoce Glu-6P + NAD 6P-Glu + NADH inuální mód Zonální mód Suhjslríilc B J. Harmon et al.,J. Chromatogr. A 726,193 (1996). E.S .Kwak et al., Anal. Chim. Acta 397,183 (1999). vypnutí el. napětí: "zero potential amplification" tudium enzymových reakcí omoci st-capillary" provedení : e nejprve separován pomocí CE, na konci kapiláry je reaktor, kde probíhá enzymová reakce - uvedenou variantu nelze použít u komerčních CE zařízení A. Emmer, J. Roeraade, Chromatographia 39 (1994) 271. Studium en im (pre-capillary OCI iC n-ca On-line - on-capillary Inkubace + analyza rhodanasa - pre-capillary stanovení aktivity Vo seoa ich Dodmínek + S,0 2- 2u3- -> bCN" + SO32 v I 0.1 m M TTAB -15 mM borát pH 9.0 esi Glatz, Z. et al J. Chromatogr A, 1999, 838, 139. rhodanasa - pre-capillary stanovení aktivity Iba seoarační odmínek j + s2o32" n v CN- + SO32 100 m M ß-alanin - HCl, pH 3.5 rhodanasa - pre-capillary stanovení aktivity Analýza standardů Kapilára: křemenná, vnitřní průměr 75 um, celková délka 64.5 cm, efektivní délka 56 cm mBBSBBMB Dávkování: 50 mbar/6s Separační napětí: 18 kV (negativní polarita) Teplota kapiláry: 25 + 0,1 °C Detekce: X = 200 nm (šířka pásu 20 nm) Vzorek : 1 mM S2032", 1 mM SCISľ, 25 mM CN" v 25 mM HEPES pufru (pH 8.5) rhodanasa - pre-capillary stanovení aktivity Stanovení aktivity 45 40 10 15 20 TIME [min] 30 rhodanasa - pre-capillary stanovení aktivity Dávkování Short-end 8.5 cm Capillary i1 themtostatting Diode-array tletector Capillary cartridge Vial carousel {thermostatted) Butter replenishment rhodanasa - pre-capillary stanoveni aktivity CALIBRATION CURVES 140: 120: 40: 20: 0: "LONG END INJECTION" s2o32 ' B - "lon& end" injection SCNlmMl_ SCN- s2o32 140: 120: 40: 20: 0: "SHORTEND INJECTION" SCN- rhodanasa - pre-capillary stanovení aktivity hort end" versus „Long end injection" Short-end injection Long-end injection oba analýzy Přesnost migračních časů (n=10) Přesnost plochy píků (n=10) Linearita Korelační koeficient 50 - 5000 \jM 0.9993 mm 0.04 % 0.82 % 50 - 5000 nM 0.9998 Limit detekce 2.5 jiM 5 jiM rhodanasa - pre-capillary stanovení aktivity Stanovení aktivity mAU- 200 150 100 50 15 min 12 min 9 min 6 min 3 min 0 min s2o32 SCN 0.2 0.4 0.6 0.8 1.2 rhodanasa - EMMA stanovení kinet. parametrů Volba separačních parametrů tejný pufr použit jak pro enzymovou reakci, tak pro separaci produktů um rhodanasy: 8.5 BGE pH 8.5 - (nepokryta kapilár pokrytá kapilára) Nováková, S. et al. Electrophoresis,, 2002, 23, 1063. rhodanasa - EMMA stanovení kinet. parametrů Volba separačních parametru Separace anorganických aniontö (S2032~, SCN) robíhá nejlépe při nízkém pH základního elektrolytu => eliminace EOF Kombinace metody EMMA s ing technique" rhodanasa - EMMA stanovení kinet. parametrů Dávkovací a separační parametry Parametr Přesnost migračních časů (n = 10) Přesnost ploch píku (n = 10) 25 mM HEPES Substráty v 25 m M Rhodanasa v 25 mM 25 mM HEPES (pH 8,5) HEPES (pH 8,5) HEPES (pH 8,5) (pH 8,5) | nástřik vzorku Separační napětí 18 kV (negativní polarita) Detekce 200 n m rhodanasa - EMMA stanovení kinet. parametrů Sta n chaelisových konstant Km mAU :;o 200 i;o 100 50 0-* 15 mM ^Q; JLO inM_S1Oř 5mM S,0, 2 mM SO; tlmM S,Q,: 0.5 mM S,On mm rhodanasa - EMMA stanovení kinet. parametrů Stanovení Michaelisových konstant Km 3 "a si o o "a -0,012 0,01 -0,008 -0,006 - 1 -0,TS^^^^^2sÓ}002 f -0,004 --_n nnA 1 1 1 1 ) 0,25 0,5 0,75 1 1, 1/ [Na2S203] (1/mmoi; ♦ 1 mM KCN *2 mM KCN 5 mM KCN ♦ 10 mM KCN g U,6 0,7 -0,6 -0,5 -0,4 -1/km(cn") °'3 v 0,2 - y = 0,5839x + 0,0768 i/km(s2o£)^ i_____ u ,6 -0,4^^0,2 _0)1 4 i i i i i ) 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1 1/ [KCN] (1/mmol) rhodanasa - EMMA stanovení kinet. parametrů Inhibice rhodanasy 2-oxoglutarátem (inhibitor přidán do zóny substrátů) Nováková, S. et al J. Chromatogr. A, 2003, 990, 189. rhodanasa - EMMA stanovení kinet. parametrů I 2-OG Kj (mM) inhibice S2032 1.40 akompetitivní CN" 3.62 x 10"1 kompetitivní andehalogenasa řEC ROH + X" + H+ enovaných derivátů uhlovodíků n o Enantioselektivní organické syntézy haloalkandehalogenasa - pre-capillary stanovení Volba r + H20 -> ROH + Br + H+ 100 mM P-alanin - HC1, pH 3.5 UV 200 nm Separační napětí 18 kV (hegativní polarita) Glatz, Z., et al. J. Chromatogr. A, 2000, 895, 219. haloalkandehalogenasa - pre-capillary stanovení haloalkandehalogenasa - pre-capillary stanovení Nepřímá detekce UV light source O & — gj, O O ^ o © ^ © e © e e ^r-i s=p 7-, o © ^^řfe s> @ Q ® 3ř 5 mM chroman 0.5 mM TTAB pH 8.5 Nepřímá detekce - 315 nm / 375 nm Separační napětí 15 kV (negativní polarita) haloalkandehalogenasa - pre-capillary stanovení Stanovení aktivity ' strát 1-brombutan Přímá detekce Nepřímá detekce haloalkandehalogenasa - EMMA Dávkovací a separační 7é*\ď\?kf\wy{ o\^\ď\-wď\\\Ě\ ivKovaci a separacni parame Základní elektrolyt !0 mM (3-alanin - HCI, pH 3.5 - přímá detekce separační napětí 29,9 kV (negativní polarita) nebo 10 mM chroman 0.1 mM CTAB pH 9.2 - nepřímá detekce separační napětí 18 kV (negativní polarita) Dávkování Dávkovaní 20 mM glycinátový pufr (pH 8.6) : 50 mbar/4s Enzym ve 20 mM glycinátovém pufru (pH 8.6) : 50 mbar/4s Substrát ve 20 mM glycinátovém pufru pufru (pH 8.6) : 50 mbar/4s 20 mM glycinátový pufr (pH 8.6) : 50 mbar/4s Telnarová, M. et al. Electrophoresis, 2004, 25, 290. haloalkandehalogenasa - EMMA ichaelisovy konstanty Km bstrát 1-brombutan .11 » ic i» n IjO mM 1.0 ii M 0,7 mM (UlIlM 0.1 m\f juj t i i J * J s i wi ; i 1 J lir Přímá detekce Nepřímá detekce haloalkandehalogenasa - EMMA Stanovení Michaelisovy konstanty Km substrát 1-brombutan Přímá detekce Nepřímá detekce haloalkandehalogenasa - EMMA Stanovení inhibiční konstanty Ki substrát 1-brombutan; inhibitor 1,2-dichloethan Přímá detekce Nepřímá detekce Telnarová, M. et al. Electrophoresis, 2004, 25, 1028. haloalkandehalogenasa - EMMA Stanovení inhibiční konstanty Ki substrát 1-brombutan; inhibitor 1,2-dichloethan Michaelís-Menten AKt = 0,63 mM 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 1,8 2,0 1.2 |l-bromobutane| (mM) Lineweaver-Burkc 0 2 4 1/(1-brom o butane] (mM) Přímá detekce Michaelis-Menlen = 0,44 m • P = 0mM o 1=1 mM v l=5mM * í = 20 mM 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 1,8 2,0 2,2 [1-bromobutaneJ (mM) Uiieweaver-Burke -1.0 0,0 0,5 1,0 1,5 l/(l-bromo butane) (mM) Nepřímá detekce /s o v. i\ u c j n r ♦ Vysoké rozlišení ♦ Rychlost analýzy apillary" enzymové stanovení tudium kinetik ♦ Vysoká účinnost ♦ Vysoké rozlišení ♦ Rychlost analýzy V já vzork ♦ Automatiz ♦ Malá množství Studium kinetiky dvousubstrátové enzymové reakce (60 experimentů) * spotřeba vzorku enzymu - (1200 ul LE) * doba studie - (10 hodin LE) so u ca separacni >cytosolická - biotransformace/detoxikace xenobiotik (II fáze) >membránově vázaná - sulfatace glykoprotein sulfotransferasa - EMMA stanovení aktivity a kinetických parametrů Reako PAPS Velmi nestabilní 80 % (20 % PAP) NHn HO v o^\ o- sult1a1 O—CH2 N- \T---- 274 nm + HO \ .O OH K -o' % 4-Nitrophenol PAP 4-Nitrophenyl sulfate I Velmi silný inhibitor reakce Kx = 0-4 Vytisková, S. et al. J. Chromatogr. A, 2004, 1032, 319. aktivity a Separační odmínky: BGE: 150 mM HEPES, pH 6.5 + 20 mM kyselina cholová Kapilára: LT=31.2 cm (LE = 21cm), 75|im I.D. Napětí: + 10 kV Teplota kapiláry: 37 °C Detekce: 260 nm Dávkování: 0.3 psi/ 5 s lmM PAP nebo 115 mM PAPS N" Standa Enzymové systémy Aktivita enzymů Koncentrace substrátů a inhibitorů nj!:~uaelisovv a inhibiční konstant' > Neenzvmové svstém • GSH, HCys, Cys, D AMK Ca(ll) Gentamycin a kanamycin Kreatin Cr(VI) a Co(ll) metabolism ICvtochrome P450J i •.en ih*t Years Discovery (2-10 Years) 2 4 1 PhaseI 20-90 Healthy Volunteers Used to Determine Safety and Dosage Phase III 1.0DD-5.ÜQ0 Patient Vblunleera Used to hlflnltcir Adverse Readlüna 1ü Lung-Term Use Additional Post' Marketing Testing G 8 10 12 14 Preclinical Testing Laboratory and Animal Testing Phase II 100 300 Patient Volunteers Used Id Look Cor Efficacy and Side Effects FDA Review Approval riViMilll*Tllcllri.V:l L10 x 5,000-10,0000 Screened 250 Enter Preclinical Testing II Ceil T Approved by the FDA romy P450 (CYP) NADPH ROH + NADP+ + H2Q 50 různých CY CYP2C8/9 16% CYP1A2 11% CYP2D6 19% CYP3A4/5 36% CYP2C19 8% CYP2E1 4% CYP2B6 3% CYP2A6 3% podíl na metabolismu 80 % známých léčiv Jaterníplátky, hepatocyty, mikrosomy binantní enzymy dské iate Lidske jaterni mikrosom Malé vezikuly získané z endoplazmatického r . i r v Hepatocyt + + + + + vysoká koncentrace CYP zastoupeni vsech isoforem CYP vysoká enzymová aktivita jednoduchá příprava a použití vysoká stability při skladování a inkubaci RH + 02 + + H+ CYP ROH + A CYP3A4 + dextrometorfan x Roztok enzymu Roztok substrátu Reakční směs Produkt reakce Detektor E 6 s Time [min HLM CYP3A4 Zeisbergerová, M. et al. Electrophoresis, 2009, 30, 2378. V. Okhonin, X. Liu, S.N. Krylov, Anal. Chem. 77 (2005) 5925 R. Řemínek, M. Zeisbergerová, M. Langmajerová, Z. Glatz, Electrophoresis, 34 (2013) 2705. difúzí - CYP2C9 + diclofenac Roztok enzymu Roztok substrátu Reakční směs Produkt reakce Detektor difúzí - CYP2C9 + diclofenac R. Řemínek, M. Zeisbergerová, M. Langmajerová, Z. Glatz, Electrophoresis, 34 (2013) 2705. difúzí - CYP2C9 + diclofenac ace TDLFP s MS detekcf Here-. 1 k - - c.. - J +r^J:J!K.j;i?L. jij-jj-iv. tie Mii-i G DC 2 13 L £° H.MS _1 fill OH DC Sj-l.iJ-C-i 3L1A15 200 £20 £40 £SJ £30 300 3£0 irV'i Figure 10. Mass spectrum of DC and OHDC obtained after in-capillary incubation. Langmajerova, M., Remfnek, R. Pelcova, M., Foret, F. a Glatz, Z. Electrophoresis. 2015, 36, , s. 1365-1373. Chirální seoarace r Ketamin anestetikum a analgetikum v humánní a veterinární medicíně 50 mM TRIS-fosfátový pufr (pH 2.5) obsahující 3 % (w/v) vysoce sulfatovaný y-cyclodextrin Km ^max , "a (nmol/min/n ("M) mol) 74.22 ± 15.66 ± 5.75 0.52 Kinetická studi Michaelis-Menten S-Ketamine 79.54 ± 8.49 62.91 ± 8.02 66.45 ± 6.62 10.13 ± 0.48 8.18 ± 0.40 7.47 ± 0.31 Řemínek, R. et al. Electrophoresis, v tisku. ♦ EMMA + homogenní reakční - nutné optimalizovat ♦ TDLF rsálno - homogenita ??? Slil dium enzymových reakci Schejbal, J., Řemínek, R., Zeman, L, Mádr, A., Glatz, Z., J. Chromatogr. A 2016, 1437, 234-240. hFM03- Agilen 1 hFM03- Beckman 0.01 a- 0.016-0.014- :: I- 0.010- o.ooe- 0.006-f 0.004-0.002-0.000--0.002- '/i jaiin "in -*— Clozapine N - oxide Clozapine ■: 12 14 Minutes 22 24 Alzheimer (1906 Alois Alzheimer) tvorba ß-amyloidu, fo ce plak Co; t m Eílrcniu SřiiinkagL- u1 Ccrct ral Cortex Extreme Slwinkage of Hippocampus Severely Enlarged Ventricles Hŕ|ŕi>i>£anij]ifs Enturhiiiiil COrtei ► Neurodegenerativní onemocnění ► Příčina 60 - 70 % demence ► Více než 30 milionů pacientů Alzheimer tvorba ß-amyloidu, formace plaku, účast sekretas Inhibitory orba AJzh r eime yloidu, formace plaku, účast sekret V 1 3 fgse cleavaďe site Extracellular domain B-secretase binding site y-secretase cleavage si y-secretase cleavage sit Ľ-seeretase cleavage site -US R K V I K W ARTIC K Immobilized -enzyme reactors Integrated with capillary electrophoresis for pharmaceutical research Jan. Schejbal I ZdenekGlatz ěvek Čechů k aračním metodám ěvek Čechů k Vám pozornost! Masarykova univerzita Přírodovědecká fakulta Ústav biochemie Bioanalytická skupina Mgr. Marta Pelcová, PhD. Mgr. etMgr. Lenka Kohútová, PhD, prof. RNDr. Zdeněk Glatz, CSc. omiky The process of systems biology research Prediction and hypothesis refinement Data and hypothesis- driven modeling Data synthesis ^ Experimental design Data acquisition Gen an e Transcnptome Protecme Inttractome Sen ice: Agilent Technologies Systems biology S čím pracujeme i Vacuum interface & \ He/N?\ Discharge chambQr Hearing Moiaslabte spectrometer Ho/TJ, ľrarr uv-vis i' LEDiF H PLC S čím (nově) pracujeme MST (Termoforéza v mikroměřítku) DM (Kapičková mikrofluidika) Aktuální témata a projekty I. Studium interakcí pomocí I. Studium interakcí pomocí CE a MST ABC Tinne (seci Ligand{LjM) II. Metabolomika a biomarkery CE a H PLC v asistované reprodukci amino- a karboxylové kyseliny Uptake Glucose Amino acids Other sugars Oxygen Drop (1-10 ul) of defined culture medium Novel peptides and proteins Production Lactate Ammonium Amino acids > Enzymes, e.g. LDH sHLA-G HOXA10 regulator PAF Ubiquitin 4.8 4.6 4.4 4.2 4,0 3.8 3.6 U, mV 328 326 324 Glv His jlL Asp Hi-. A5p CI EMMA 300 - 75 - 175 - 15 mbar s NaCN - AA - NDA - AA Wait 2 min Leu lie Lys Arg Lys lla In 0 kV 6 s _15_ -2£L III. Enzymová kinetika v kapce Využití kapičkové mikrofluidiky - microfluidic Výhody DM: • Žádná disperze • Vysoká propustnost - desetitisíce vzorků za minutu Žádný kontakt se stěnami kanálu Nízká spotřeba vzorku pL-nL Rychlé míchání využití v genomice, proteomice, enzymologii a diagnostice Oil IV. Alternativní typy biologické matrice Farmakologické studie Whatman preklinické klinické toxikologické a farmakokinetické profily terapeutické monitorování léčby AZV projekt NU23-08-00229 ' N f N FTA DMPK-A Co Vás čeká S čím budu pracovat / co se naučím? • Práce s literaturou / databázemi • Běžná práce v laboratoři (příprava roztoků, vzorků, atd.) • Optimalizace metody • Práce s Excelem - pokročilé funkce jako je řešitel, atd. fll./ini^.VJJOJXÍ-TJJKv-í . --L .J.JI . .1 Lil . Cliaraclerization of polymeric biaconiposite liased ari po ly( vinyl akotrel) and poiy[vinyi pyrralidone) i I MM ] E1IM.P |3M* Fj »ijwxoiif-ieí5-tiii-i uution pistributicn l>vv J Kontakty Budova C5, 2. nadzemní podlaží Prof. Zdeněk Glatz, CSc. » glatz@chemi.muni.cz 217 Mg r. Marta Pelcová, PhD. zeisbergerova@mail.muni.cz 216 Mgr. et Mgr. Lenka Kohútová, Ph lenna@mail.muni.cz Laboratoře 227-229, 323 216?