CORE022 – Biochemie v běžném životě1 Rostlinná biochemie Ochrana proti škůdcům a chorobám. Genové manipulace. Bioremediace doc. Mgr. Jan Lochman, PhD Ústav Biochemie CORE022 – Biochemie v běžném životě2 Moderní zemědělství • v minulosti hlavní kritéria pro šlechtění – výnos, vzhled, velikost • hlavní problém zemědělství = monokulturní plodiny • rezistence nebyl bod zájmu = chemie to vyřeší Solanum habrochaites Solanum pimpinellifolium Solanum lycopersicum cv. Money maker CORE022 – Biochemie v běžném životě3 GMO plodiny • první generace orientovaná na producenty a zpracovatele • druhá generace = přídavná hodnota pro spotřebitele • v Evropě problematické (k 2020, 58 GMO plodin schváleno) • 92 Mha sója, 54 Mha kukuřice, 23 Mha bavlna, 9 Mha řepka • bt kukuřice MON810, bt lilek, Roundup Ready Sója, řepka Canola, HT vojtěška - bt = gen z Bacillus thuringiensis pro Bt protein toxický pro hmyz • Molekulární křížení – QTL (Quantitative Trait Loci) mapování - založené na křížení pomocí molekulárních markerů • Otevřená otázka dalších editačních metod - TALENs (Transcription Activator-Like Effector Nucleases) - CRISPR-Cas9 USA 38% Brazil 28% Argentina 13% Canada 7% India 6% Paraguay 2% China 2% South Africa 1% Pakistan 1% Bolivia 1% Uruguay 1% Philippine s 0% Australia 0% Myanmar 0% Sudan 0% Mexico 0% Spain 0% GMO PLODINY https://www.isaaa.org/default.asp CORE022 – Biochemie v běžném životě4 Herbicidy – Glyphosate (Round-Up) - Objeven 1970 firmou Monsanto jako derivát aminomethylphosphonové kyseliny pro změkčení vody - U dvou derivátů lehce herbicidní účinky = John E. Franz nasyntetizoval derivát se silnou herbicidní aktivitou - Vstřebání je primárně přes listy, minimálně přes kořeny - Mechanismus účinku –inhibice rostlinné EPSP syntázy – syntéza aromatických aminokyselin - Roundup ready plodiny – obsahují gen EPSP syntázy z A. tumefaciens rezistentní k inihibici Glyphosate CORE022 – Biochemie v běžném životě5 Herbicidy – Glufosinát • Mezi roky 1960 a 1970 vědci University of Tübingen a Meiji Seika Kaisha Company objevili, že bakterie rodu Streptomyces produkují tripeptid (bialaphos), který inhibuje růst bakterií. • Obsahoval dva alaniny a AK analog glutamátu, který nazvali "phosphinothricin". • Phosphinothricin inhibuje aktivity glutamin syntázy a prvně syntetizován v roce 1970 jako racemická směs • Později nazván glufosinát • Na konci 80tých let objeven u bakterií Streptomyces enzym, který inaktivuje phosphinothricin • Izolovaný gen ze Streptomyces hygroscopicus nazván “bialaphos resistance" (bar). • Izolovaný gen ze Streptomyces viridochromeogenes nazván "phosphinothricin acetyltransferase" (pat). bialaphosphosphinothricin CORE022 – Biochemie v běžném životě6 Zlatá rýže ̶ Vyvinutá nejprve v 90. letech (GR1) a poté modifikovaná v roce 2004 s transgeny z kukuřice a běžnou půdní bakterií Pantoea ananas (GR2) ̶ geneticky modifikovaná rýže produkuje betakaroten, prekurzor vitaminu A v bílém endospermu ̶ v červenci 2021 byla schválena pro pěstování na Filipínách CrtI, karoten desaturasa (Pantoea ananas);Psy, phytoene syntasa z Narcissus pseudonarcissus (GR1) nebo kukuřice (GR2); Pmi, phosphomanosa isomerasa (E. coli) pro selekci CORE022 – Biochemie v běžném životě7 Rostliny čelí celé řadě výzev BIOTICKÝ STRES Hmyz Viry Bakterie Oomycety Houby Poranění ABIOTICKÝ STRES Teplotní stres (teplo, chlad, mráz) Sucho Záplavy Zasolení Ozón Intenzivní světlo Těžké kovy • Rostliny jsou přisedlé organismy • Rostliny hostí celou řadu nepatogenních a patogenních mikroorganismů • Rostliny chrání mechanické bariéry a rozvinul se u nich mnohovrstvý imunitní systém CORE022 – Biochemie v běžném životě8 Patogen, škůdce, onemocnění • Rostlinný patogen – organismus, jehož část životního cyklu se odehrává uvnitř rostliny • Škůdce – herbivorní hmyz, nematoda savec nebo pták živící se vegetativními částmi rostliny • Původ rostlinných patogenů - předchůdce suchozemských rostlin přinesl patogeny sebou z moře - po přechodu z moře některé druhy přešly k patogennímu způsobu života - příchod suchozemských rostlin poskytl nové útočiště již existujícím patogenům • Počátky zemědělství (před cca. 10 tis. lety) - nový vztah mezi domestikovanými druhy a jejich škůdci a patogeny - objevení se geneticky identických jedinců v monokulturách - šlechtění za účelem výnosu a specifických vlastností CORE022 – Biochemie v běžném životě9 Významné choroby • Plíseň bramborová - oomyceta Phytophthora infestans - velký hladomor v Irsku (1840) • Rez travní (černání stonků) – houba Puccinia graminis - kolaps pěstitelů pšenice (1950, USA) - vyšlechtění nové rezistentní variety - v Africe (1999) se objevil nový virulentní kmen Ug99 - na Sicílii (2016) se objevil nový virulentní kmen TTTTF • Černá Sigatoka – askomyceta Mycosphaerella fijiensis - ohrožuje pěstování kultivaru Cavendish (Musa acuminata Colla a M. balbisiana Colla) - až 50% ztráta výnosu – předčasné zrání plodů a hnědnutí listů • Rez kávovníku – houba Hemileia vastatrix - zdecimovala produkci kávovníků na Srí Lance (1870) - vedla ke konzumaci čaje v Británii místo kávy CORE022 – Biochemie v běžném životě10 Strategie útoku patogenu Nekrotrofní: patogen zabijí rostlinou buňku Biotrofní: rostlinná buňka přežívá Hemibiotrofní: na počátku infekce patogen udržuje buňky živé, ale v pozdější fázi infekce je zabíjí Patogen není schopen rostlinu infikovat • Rostlina obsahuje strukturní bariéry nebo toxické látky • Aktivace obranných mechanizmů • Změna okolních podmínek Úspěšná infekce patogenu • Příznivé okolní podmínky • Rostlina není schopna patogen rozpoznat • Obranná odpověď vůči patogenu je neúčinná padlí bakteriální skvrnitost zavadání anthraknóza nádory hlístice CORE022 – Biochemie v běžném životě11 Strategie patogenů Nekrotrofie Biotrofie Hemibiotrofie Strategie útoku Sekrece enzymů degradujících buněčnou stěnu a/nebo toxinů Těsný Intracelulární kontakt s rostlinou buňkou Počáteční biotrofní fáze Specifikum interakce Zabít rostlinné pletivo a kolonizovat; výrazný rozklad patogenem Rostlinná buňka zůstává živá s minimálním poškozením V počáteční fázi infekce zůstávají rostlinné buňky živé, v pozdější fázi značné poškození pletiva Spektrum hostitelů Široké Úzké, pouze konkrétní druhy Střední Příklady Bakteriální hniloba (Erwinia spp.), houbová hniloba (Botrytis cinerea) Houbové plísně a rzi, viry, endoparazitické nematody, bakterie Pseudomonas spp. Phytophthora infestans (plíseň bramborová) CORE022 – Biochemie v běžném životě12 Cik-Cak Model roslinné imunity Jonathan Jones Jeff Dangl HR + HR MAMPs – Molekulární vzory spojené s mikroby (flagelin, chitin nebo oligogalakturonidy) PRRs – Receptory rozpoznávající molekulární vzory NBS-LRRs – intracelulární receptory obsahující nukleotid vázající místo a leucin bohaté repetice MTI/ETI – MAMPs/Efektory vyvolaná imunita CORE022 – Biochemie v běžném životě13 Hypersenzitivní reakce • Programovaná buněčná smrt • Slouží k restrikci šíření patogenu a jeho usmrcení • Klíčová role NADPH oxidázy a extracelulární peroxidázy Spóra Primární klíčící vlákno Apresoriální klíčící vlákno Buňka produkující H2O2 CORE022 – Biochemie v běžném životě14 Systémová rezistence SAR (Systémově navozená rezistence) • Slouží k obraně rostliny před biotrofními patogeny • Je spojena s dráhou kyseliny salicylové • Je spojena s akumulací SA-responzivních PR proteinů ISR (Indukovaná systémová rezistence) • Indukované symbiotickými bakteriemi a houbami kořenového systému • Je spojena s dráhou kyseliny jasmonové/ethylenu • Nedochází k akumulaci PR proteinů, ale po napadení patogenem je jejich exprese silně akcelerována • Je spojena s tzv. “Defence Priming“ fenoménem CORE022 – Biochemie v běžném životě15 SAR (Systémově navozená rezistence) • Počátek infekce musí být doprovázen nekrotickými lézemi • Silně indukována ETI a slabě PTI • Aktivace kyselých forem PR proteinů • Nutná přítomnost KYSELINY SALICYLOVÉ • V praxi se místo SA používají analoga - k. isonikotinová (INA) nebo benzothiadiazol (BTH) • Prokázána dále role glycerol-3-fosfátu a kyseliny azaleové Aspirin (1899 Bayer) Salicin (Vrba) BTH INA SA CORE022 – Biochemie v běžném životě16 ISR (Systémově indukovaná rezistence) • Indukce mechanickým poraněním nebo ožerovým hmyzem • U rajčete spojená s polypeptidem SYSTEMINEM (18 AK, účinný ve femto-molární koncentraci) - syntéza odštěpením C-konce pro-systeminu (200 AK) v místě poranění - aktivuje signální dráhy k. jasmonové a ethylenu • Při napadení syntéza proteinázových inhibitorů (PIs) - serin, cystein a aspartyl inhibitory proteináz - interagují s proteinázami v žaludku hmyzu/nematod - inhibice jejich rozvoje/smrt Larvy Manduca sexta (Lišaj) PIs - PIs + k. jasmonová ethylen k. a-linolenová Lipoxygenáza Allene oxid syntáza Allene oxid cykláza Fosfolipid Fosfolipasa A2 https://www.youtube.com/watch?v=TKQ-CIX9afA CORE022 – Biochemie v běžném životě17 Anti-mikrobiální látky Glukosinoláty Phytoalexiny • Dodávají chuť a aroma (brokolice, křen hořčice) Resveratrol – stilben pocházející z fenyl-propanoidní dráhy Capsidiol – seskviterpen z pepře a tabáku • Allicin – volatilní látka, dává chuť i aroma česneku a cibuli CORE022 – Biochemie v běžném životě18 Obranný priming • aktivace multi-genových obraných mechanismů poskytujících dlouhotrvající rezistenci • Spojen především z rezistencí indukovanou mykorrhizními houbami, poraněním nebo chemikáliemi (betaaminomáselná kyselina) • Molekulární mechanismy spojené s tímto fenoménem jsou popsány pouze z části ZÁKLADNÍ MOLEKULÁRNÍ MECHANISMY • Mitogen-aktivované protein kinázy • Obohacení plazmatické membrány receptory rozpoznávající molekulární vzory • Epigenetické změny CORE022 – Biochemie v běžném životě19 Obranný priming CORE022 – Biochemie v běžném životě20 GMO papaja ̶ Papája je druhou nejdůležitější havajskou ovocnou plodinou ̶ Papaya Ringspot Virus (PRSV) byl poprvé detekován ve 40. letech 20. století ̶ Koncem 90. let zasáhl virus každou oblast produkující papáju, což vedlo k poklesu produkce o více než 50 % mezi lety 1993 a 2006. ̶ Tyto drastické okolnosti vedly ke spolupráci mezi státními úředníky v oblasti zemědělství a pěstiteli papáji ve snaze zvládnout šíření viru (mšicemi) ̶ Součástí strategie bylo financování havajského ministerstva zemědělství na vývoj transgenní odrůdy papáje. ̶ v roce 1995 předložení regulačního povolení ke komerční produkci GMO papáje: USA schválily GMO papáju v roce 1998 Kanada schválila GMO papáju v roce 2003 Japonsko schválila GMO papáju v roce 2011 (po 12 letech) CORE022 – Biochemie v běžném životě21 GMO papaja ̶ transgenní papája byla vyvinuta prostřednictvím technologie obalového protein (CP), umlčování RNA a replikázových genů. https://youtu.be/2G-yUuiqIZ0 CORE022 – Biochemie v běžném životě22 Fixace dusíku • dusík je čtvrtým nejhojnějším prvkem na zemi • nejvíce dusíku využívaného organismy je recyklováno ze směsi dusíkatých látek vytvořených jinými organismy • hlavní zdroj dusíku pro směs využitelných dusíkatých látek je získáván procesem fixace dusíku • proces fixace dusíku je prováděn pouze prokaryoty • nejdůležitější krok asimilace anorganického dusíku na organické metabolity je katalyzován enzymem glutamin syntetasou. CORE022 – Biochemie v běžném životě23 Metabolismus dusíku Rostliny mohou přijímat dusík ve formě: • amonného iontu • dusičnanu a následné redukci na amonný ion • v případě přítomnosti bakteriálního symbionta fixujícího dusík ve formě atomárního dusíku • nedostatek dusíku byl velkým problémem na počátku 20 století - The Wheat Problem (Sir William Crookes) Rostlina bez nodulů Rostlina s noduly CORE022 – Biochemie v běžném životě24 Haber-Boschova syntéza N2 + 16ATP + 8e- 2NH3 + H2 + 16ADP + 16Pi Chemická cesta přeměny Biologická cesta přeměny (Cyanobacteria, Actinomycetes, a-proteobacteria) 1909 1913 (BASF) 1918 https://www.youtube.com/watch?v=hK4vXKaBJko CORE022 – Biochemie v běžném životě25 Symbiotická fixace dusíku • v přírodních ekosystémech pochází 80-90% rostlinami využitelného dusíku z procesu fixace. • při fixaci N2 existují tři základní typy symbiózy: i. Symbióza gram-negativních bakterií (rhizobií) s celou řadou luštěnin (hrách, fazole, sojové boby, čočka, vojtěška) ii. Symbióza gram-pozitivních bakterií actinomycet s některými dvouděložnými rostlinami (olše, myrta, přesličník) iii. Symbióza mezi cyanobakteriemi a celou řadou rostlin (kapradí, jaterník, mech) • výsledná symbióza vznikla zřejmě jako výsledek pozitivních a negativních tlaků během koevoluce symbiotického partnera a rostliny CORE022 – Biochemie v běžném životě26 Fixace N2 v nodulech • při fixaci N2 je nezbytné vytvořit mikro-aerobní redukční prostředí, ve kterém může docházet k aerobní tvorbě ATP • pro udržení nízké koncentrace kyslíku v nodulech jsou potřeba tři základní faktory: i. permeační bariéra v parenchymu nodulů ii. přítomnost leghemoglobinu vázajícího volný kyslík iii. výrazné snížení Km rhizobiální cytochrom oxidasy (50nM/8nM) Regulace pomocí hemo-protein kinasy regulované c kyslíku CORE022 – Biochemie v běžném životě27 Fytochelatiny (Bioremediace) • jsou syntetizovány jako odpověď na expozici těžkými kovy nebo vysokou koncentraci mikroprvků (Cu) • základní molekulou pro jejich syntézu je glutathion CORE022 – Biochemie v běžném životě28 Fytohormony • Fytohormony mají různé struktury a funkce - Auxiny (odvozené od indolu) stimulují buněčnou elongaci - Gibereliny (deriváty giberelanu) stimulují prodlužování internodií - Cytokininy (zeatin) stimulují buněčné dělení - Kyselina abscisová (ABA) reguluje vodní homeostázu - Brasinosteroidy – klíčová role v buněčném vývoji - Ethylen a kyselina jasmonová – potencují senescenci - Peptidické hormony regulují vývoj - Kyselina salicylová a jasmonová se účastní obranných reakcí CORE022 – Biochemie v běžném životě29 Auxin • V roce 1880 C. Darwin a syn pozorovali růst semenáčku za světlem • Předpokládali přenos signálu z růstové špičky do růstové zóny • V roce 1926 Frits Went izoloval z růstových špiček semenáčku ovsa látku, kterou nazval auxin • Později identifikována jako indol-3-octová kyselina (IAA) • Další látky mající aktivitu auxinů – fenyloctová kyselina; 2,4-dichlorooctová kyselina (2,4-D) • 2,4-D – účinný herbicid způsobující narušení morfogeneze a zvýšenou produkci ethylenu • Použit jako „agent orange“ ve Vietnamu, destruuje pouze dikoty – monokoty ho degradují • Zabraňuje opadávání listů a plodů (antagonista ethylenu) • Indukuje tvorbu plodů • Za normálních okolností produkují semena auxin pouze po oplodnění Indol-3-octová kyselina 2,4-D CORE022 – Biochemie v běžném životě30 Auxin • Během časné embryogeneze formuje polaritu (stonek/kořen) • Ovlivňuje buněčné dělení a diferenciaci • Podněcuje prodlužování buněk – nejvyšší koncentrace v růstových zónách • Primárně je tvořen v růstové špičce (nadzemní část) - Transportován polárním přenosem (vyžaduje energii) - Přenos zajišťují specifické eflux/influx přenašeče (PIN) - Polární transport = asymetrické rozložení přenašečů auxin auxin CTRL CORE022 – Biochemie v běžném životě31 Cytokininy • Prenylované deriváty adeninu • Zvyšují růst stimulací buněčného dělení a indukují laterální růst • Antagonisté auxinu • Oddalují senescenci – opak ethylenu • Maturované buňky mohou opět aktivovat k dělení a vývoji • Formace kalusu – může regenerovat zpět v rostlinu kinetin zeatin Folke K. Skoog CKX - Cytokinin oxidasa/dehydrogenasa (degradace) IPT – isopentnenyl transferasa (syntéza) BA – Benzylaminopurin (CK) NAA - 1-Naftalenoctová kyselina (Auxin) CORE022 – Biochemie v běžném životě32 Gibereliny • Infekce rýže houbou Gibberella fujikiroi vede k extrémně vysokým rostlinám bez semen • 1926 – Eiichi Kurozawa izoloval z této houby látku mající tento efekt • Nazval ji gibberellin • Gibereliny jsou směsí látek s podobnou strukturou ent-gibberellanu • Nejdůležitější giberelin je GA1 a GA • Podobně jako IAA gibereliny stimulují prodlužování stonků a rovněž regulují kvetení • Rovněž se podílí na vytváření plodů a jejich růstu • Gibereliny ukončují dormanci semen expresí enzymů ztenčujících obal semene (amylázy) • Prakticky se využívají v zemědělství: - Produkce protáhlých hroznů bez semen - Pro stimulaci amyláz u ječmene (pivovarnictví) - Inhibitory jsou používány pro zkrácení růstu stonků - V 50-letech umožnily zelenou revoluci u kukuřice (zakrslé rostliny s vyšším obsahem zrn) 2-chlorotrimethylamonium chlorid (Cycocel, BASF) CORE022 – Biochemie v běžném životě33 Fytohormony - shrnutí CORE022 – Biochemie v běžném životě34 Děkuji za pozornost Otázky?