1 Lipidy, membrány, Karel Kubíček 2021/11/23 Membrány Literatura: 1)Cotterill, R.: Biophysics: An Introduction, John Wiley & Sons, Ltd. 2002 2)Murray, R.K., Granner, D. K., Mayes, P., A., Rodwell, V., W.: Harper’s Illustrated Biochemistry, Lange Medical Books, 2003 3)Schuenemann, V.: Biophysik: Eine Einfuehrung, Springer, 2005 4)Garrett, R.H., Grisham, C.M.: Biochemistry, 2nd ed., 1999 5)Jackson, M.B.: Molecular and Cellular Biophysics, Cambridge University Press, 2006 6)Kodíček, M. & Karpenko, V.: Biofysikálni chemie, Academia 7)Cooper, G.M.: Cell – A molecular approach, ASM Press 8)Ti Tien, H. & Ottova-Leitnmannova, A.: Membrane biophysics (As viewed from experimenta bilayer lipid membranes; Planar Lipid Bilayers and Spherical Liposomes), Elsevier, 2000 9)Templer, R.H. & Leatherbarrow, R.: Biophysical Chemistry – Membranes and Proteins, Royal Society of Chemistry, 2002 10) Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K., Walter, P.: Molecular Biology of The Cell, 5th ed., Garland Science, 2008 11)Bergethon, P.R.: The Physical Basis of Biochemistry – The Foundations of Molecular Biophysics, 2nd ed. Springer, 2010 2021/11/23 Lipidy, membrány, Karel Kubíček 2 Screen Shot 2011-11-01 at 8.16.53 AM.png 1)Gorter & Grendel 2)Harvey, Danielli, Davson 3)Robertson (X-ray diffraction) 4)Benson 5)Singer & Nicolson 6) --------”---------- 7)Green 8)Sjostrand & Lucy 9)Brown (1971) 10) 2021/11/23 Lipidy, membrány, Karel Kubíček 3 Screen shot 2010-11-15 at 11.02.23 PM.png 2021/11/23 Lipidy, membrány, Karel Kubíček 4 Screen shot 2010-11-15 at 11.40.18 PM.png 2021/11/23 Lipidy, membrány, Karel Kubíček 5 Screen shot 2010-11-15 at 11.42.49 PM.png 2021/11/23 Lipidy, membrány, Karel Kubíček 6 Screen shot 2010-11-15 at 11.43.39 PM.png 2021/11/23 Lipidy, membrány, Karel Kubíček 7 Screen shot 2010-11-15 at 11.04.10 PM.png 2021/11/23 Lipidy, membrány, Karel Kubíček 8 Screen shot 2010-11-15 at 11.05.29 PM.png 2021/11/23 Lipidy, membrány, Karel Kubíček 9 Screen Shot 2011-11-01 at 8.40.15 AM.png 2021/11/23 Lipidy, membrány, Karel Kubíček 10 Stavební jednotky lipidů/membrán A)Mastné kyseliny (e=2..10) B)Glycerol; anorganický fosfát (PA) (e=80) C)Choline (PC), Ethanolamin (PE), Serin (PS), Inositol (PI – fosfatidylinositol, IP3 – inositol trifosfát, PIP2 – fosfatidylinositol-4,5-bifosfát), Galactóza, N-acetyl-neuroaminová kyselina, Organický sulfát D)Sfingosin => Sfingolipidy, Glycolipidy => sulfolipidy, steroidy, 2021/11/23 Lipidy, membrány, Karel Kubíček 11 Screen Shot 2011-11-01 at 8.38.17 AM.png 2021/11/23 Lipidy, membrány, Karel Kubíček 12 2021/11/23 Lipidy, membrány, Karel Kubíček 13 Screen Shot 2011-11-01 at 8.26.10 AM.png 1)Lipoprotein: lipid + protein, který je většinou rozpustný v H2O 2)Proteolipid: protein + lipid, ---------”------- v organice (e.g. 2:1 = CHCl3 : CH3OH) 3)Glycolipid: lipid + carbohydrate. Cukry glycolipidů jsou na vnějším povrchu a velmi pravděpodobně se účastní mezibuněčných komunikací 4)Glycoprotein: carbohydrate + protein. Podobně jako glycolipidy, cukerné zbytky glycoproteinů jsou připojeny na ne-cytoplasmické straně membrány. Membránové komponenty 2021/11/23 Lipidy, membrány, Karel Kubíček 14 Screen shot 2010-11-15 at 11.44.49 PM.png 2021/11/23 Lipidy, membrány, Karel Kubíček 15 Screen shot 2010-11-15 at 11.06.53 PM.png vacha_langmuir.jpg 2021/11/23 Lipidy, membrány, Karel Kubíček 16 2021/11/23 Lipidy, membrány, Karel Kubíček 17 Screen shot 2010-11-15 at 11.09.14 PM.png Screen shot 2010-11-15 at 11.09.33 PM.png Liposome 2021/11/23 Lipidy, membrány, Karel Kubíček 18 Screen shot 2010-11-15 at 11.10.30 PM.png 2021/11/23 Lipidy, membrány, Karel Kubíček 19 Screen shot 2010-11-15 at 11.10.53 PM.png 2021/11/23 Lipidy, membrány, Karel Kubíček 20 Screen shot 2010-11-15 at 11.15.34 PM.png 2021/11/23 Lipidy, membrány, Karel Kubíček 21 2021/11/23 Lipidy, membrány, Karel Kubíček 22 Screen shot 2010-11-15 at 11.28.44 PM.png 2021/11/23 Lipidy, membrány, Karel Kubíček 23 Screen shot 2010-11-15 at 11.38.52 PM.png 2021/11/23 Lipidy, membrány, Karel Kubíček 24 Screen shot 2010-11-15 at 11.46.55 PM.png vacha_langmuir_obruc.jpg 2021/11/23 Lipidy, membrány, Karel Kubíček 25 2021/11/23 Lipidy, membrány, Karel Kubíček 26 Membrány oddělují různé útvary buněk a selektivním transportem látek umožňují komunikaci mezi kapalnými fázemi. Transport hmoty přes membránu A] Pasivní transport (ve směru gradientu elektrochemického potenciálu) 1)Volná difúze 2)Exo-/endocytoza 3)(Ne) specifickýmí póry/kanály – gramicidin A 1) Screen shot 2010-11-16 at 9.32.19 AM.png vacha_langmuir_endocyt.jpg 2021/11/23 Lipidy, membrány, Karel Kubíček 27 2021/11/23 Lipidy, membrány, Karel Kubíček 28 4) Přenašeče – např. Valinomycin i) saturační kinetika ii) vysoká specificita ii) transport může být inhibován Screen shot 2010-11-16 at 9.37.09 AM.png difúze pomocí přenašeče KM=2mM, Vlim=7mmol/min volná difúze 2021/11/23 Lipidy, membrány, Karel Kubíček 29 Efektivita transportu pomocí specifických přenašečů může být ovlivněna: a)Koncentračním spádem b)Elektrické řízení c)Chemické řízení d)Řízení mechanickými podněty 5) Aktivní transport (viz. tabulka) 6) Skupinová translokace 2021/11/23 Lipidy, membrány, Karel Kubíček 30 Screen shot 2010-11-15 at 11.54.14 PM.png 2021/11/23 Lipidy, membrány, Karel Kubíček 31 http://www.youtube.com/watch?v=ULR79TiUj80 http://www.youtube.com/watch?v=moPJkCbKjBs&feature=related http://www.youtube.com/watch?v=LKN5sq5dtW4&feature=related http://www.youtube.com/watch?v=IzuKhespz20&feature=related Vizualizace membrán, např.: 2021/11/23 Lipidy, membrány, Karel Kubíček 32 Osmóza z řeckého tlak/tlačit P– velké řecké pí Síla, kterou je třeba aplikovat na roztok k zastavení přítoku rozpouštědla Osmotický tlak roztoku je úměrný koncentraci rozuštěné látky Osmóza umožňuje buňkám držet jejich tvar van’t Hoffova rovnice Screen shot 2010-11-23 at 12.50.33 AM.png Screen shot 2010-11-23 at 12.50.22 AM.png Screen shot 2010-11-23 at 12.50.03 AM.png 2021/11/23 Lipidy, membrány, Karel Kubíček 33 Screen shot 2010-11-23 at 12.47.30 AM.png Screen shot 2010-11-23 at 12.26.12 AM.png 2021/11/23 Lipidy, membrány, Karel Kubíček 34 Screen shot 2010-11-23 at 12.43.52 AM.png hemolýza 2021/11/23 Lipidy, membrány, Karel Kubíček 35 Screen shot 2010-11-23 at 8.52.08 AM.png Screen shot 2010-11-23 at 8.55.52 AM.png Screen shot 2010-11-23 at 8.55.31 AM.png Screen shot 2010-11-23 at 8.55.17 AM.png Osmotický tlak a biomolekuly/molekulová hmotnost Screen shot 2010-11-23 at 9.39.38 AM.png 2021/11/23 Lipidy, membrány, Karel Kubíček 36 Screen shot 2010-11-23 at 8.51.31 AM.png Screen shot 2010-11-23 at 8.50.52 AM.png Screen shot 2010-11-23 at 8.49.47 AM.png Screen shot 2010-11-23 at 8.50.12 AM.png Screen shot 2010-11-23 at 8.50.00 AM.png ; 2021/11/23 Lipidy, membrány, Karel Kubíček 37 Screen shot 2010-11-23 at 8.51.48 AM.png Screen shot 2010-11-23 at 8.52.55 AM.png Screen shot 2010-11-23 at 8.53.08 AM.png Screen shot 2010-11-23 at 8.52.23 AM.png Screen shot 2010-11-23 at 8.52.42 AM.png 2021/11/23 Lipidy, membrány, Karel Kubíček 38 Screen shot 2010-11-23 at 2.19.47 PM.png Screen shot 2010-11-23 at 2.20.19 PM.png Screen shot 2010-11-23 at 2.20.38 PM.png Screen shot 2010-11-23 at 2.20.57 PM.png Řešení příkladu pomocí programu excel s grafem a bez grafu výpočet směrnice výpočet průsečíku výpočet regresního koeficientu n – počet měření/bodů SB – suma sloupce hodnot X SC – suma sloupce hodnot Y SD – suma sloupce součinu X.Y SE – suma druhých mocnin hodnot X SF – suma druhých mocnin hodnot Y 529=23^2; 730=27.02^2 Screen shot 2010-11-23 at 2.22.04 PM.png 2021/11/23 Lipidy, membrány, Karel Kubíček 39 Screen shot 2010-11-23 at 2.21.13 PM.png =125019,111 Porovnání vypočítaných hodnot s hodnotami získanými grafu; finální výpočet MW 2021/11/23 Lipidy, membrány, Karel Kubíček 40 Screen shot 2010-11-23 at 8.53.29 AM.png Jaká je mol. hmotnost (MW) proteinu v roztoku, jehož osmotický tlak je: •Membrána - nevodivá tenká ~6nm dvojvrstva fosfolipidů • • •Membrána může být přerušena transmembrálními proteiny, které obstarávají transportní mechanizmy a fungují v nich jako (iontové) kanály a přenašeče. Biologické membrány 2021/11/23 Lipidy, membrány, Karel Kubíček 41 Bio-elektrický jev -Elektrické signály zprpostředkovávají rychlý přenos informací v organismu. - -Šíří se buňkami nervového systému i svalovými buňkami - -Jsou zahrnuty v základních mechanizmech funkce smyslových a jiných orgánů. 2021/11/23 Lipidy, membrány, Karel Kubíček 42 Membránové kanály Výměna iontů mezi vnitřním a vnějším prostředím buňky je uskutečňována membránovými kanály. Kanály se liší od přenašečů mají pevná vazebná místa pro ionty a v membráně vytvářejí póry propustné pro vodu. Otevírání/uzavírání těchto pórů/kanálů (vrátkování/gating) se může dít několika mechanismy. Vedle elektrického je vrátkování některých kanálů ovládáno jinými podněty (chemickou vazbou látek, mechanickým napětím aj.). Průchod iontů celým kanálem nelze považovat za volnou difuzi. Většina kanálů je totiž charakterizována větší či menší mírou selektivity v propustnosti iontů. V tomto smyslu hovoříme o sodíkových, draslíkových, vápníkových nebo chloridových kanálech. Transport iontů kanály nevyžaduje dodání energie. 2021/11/23 Lipidy, membrány, Karel Kubíček 43 Otevírání/zavírání kanálů (gating/vrátkování) ion_channel.jpg 2021/11/23 Lipidy, membrány, Karel Kubíček 44 Otevírání/zavírání kanálů (gating/vrátkování) ion_channel_vg_ig_mg.jpg 2021/11/23 Lipidy, membrány, Karel Kubíček 45 Screen Shot 2011-11-07 at 9.16.43 PM.png Screen Shot 2011-11-07 at 9.17.07 PM.png © The McGraw-Hill Companies, Inc. Na+/K+ pumpa 2021/11/23 Lipidy, membrány, Karel Kubíček 46 Screen Shot 2011-11-07 at 9.17.54 PM.png Screen Shot 2011-11-07 at 9.17.35 PM.png © The McGraw-Hill Companies, Inc. Na+/K+ pumpa 2021/11/23 Lipidy, membrány, Karel Kubíček 47 Screen Shot 2011-11-07 at 9.19.45 PM.png Screen Shot 2011-11-07 at 9.19.11 PM.png © The McGraw-Hill Companies, Inc. Na+/K+ pumpa 2021/11/23 Lipidy, membrány, Karel Kubíček 48 Screen Shot 2011-11-07 at 9.20.57 PM.png Screen Shot 2011-11-07 at 9.21.23 PM.png © The McGraw-Hill Companies, Inc. Na+/K+ pumpa 2021/11/23 Lipidy, membrány, Karel Kubíček 49 Screen Shot 2011-11-07 at 9.22.10 PM.png Screen Shot 2011-11-07 at 9.22.39 PM.png © The McGraw-Hill Companies, Inc. Na+/K+ pumpa 2021/11/23 Lipidy, membrány, Karel Kubíček 50 Screen Shot 2011-11-07 at 9.23.07 PM.png Screen Shot 2011-11-07 at 9.25.18 PM.png © The McGraw-Hill Companies, Inc. Na+/K+ pumpa 2021/11/23 Lipidy, membrány, Karel Kubíček 51 Sodno-draselná pumpa -Objevena cca v 1957 Jensem Christianem Skou, který za ni v r. 1997 dostal ½ NC za chemii za “objev iontového přenašeče Na+/K+ ATPázy” -Poskytuje 1/3 energetického výdaje (některých) buněk a až 2/3 energetického výdaje neuronů -Kontroluje mj. objem buňky (zabraňuje prasknutí buňky vlivem osmózy) -Udržuje klidový (resting) potenciál buňky 3Na+ à (out); 2K+ ß(in); z toho tedy=> 1+ à -Export Na+ poskytuje hnací sílu pro další sekundární aktivní membránové přenašeče (např. import glukózy, amino kys. a dalších živin) - - 2021/11/23 Lipidy, membrány, Karel Kubíček 52 Na+/K+; H+; Ca2+ - pumpy Screen Shot 2011-11-07 at 10.45.56 PM.png Screen Shot 2011-11-07 at 10.46.27 PM.png 2021/11/23 Lipidy, membrány, Karel Kubíček 53 Screen Shot 2011-11-07 at 10.48.00 PM.png 2021/11/23 Lipidy, membrány, Karel Kubíček 54 Screen Shot 2011-11-07 at 10.56.59 PM.png H+ - pumpa 2021/11/23 Lipidy, membrány, Karel Kubíček 55 Screen Shot 2011-11-07 at 10.56.59 PM.png H+ - pumpa 2021/11/23 Lipidy, membrány, Karel Kubíček 56 Screen Shot 2011-11-07 at 10.56.59 PM.png H+ - pumpa 2021/11/23 Lipidy, membrány, Karel Kubíček 57 Screen Shot 2011-11-07 at 10.56.59 PM.png H+ - pumpa 2021/11/23 Lipidy, membrány, Karel Kubíček 58 Screen Shot 2011-11-07 at 10.59.46 PM.png Screen Shot 2011-11-07 at 11.29.18 PM.png 90° 2021/11/23 Lipidy, membrány, Karel Kubíček 59 Screen Shot 2011-11-07 at 10.59.46 PM.png Screen Shot 2011-11-07 at 11.29.18 PM.png 90° Integrální část 2021/11/23 Lipidy, membrány, Karel Kubíček 60 Screen Shot 2011-11-07 at 10.59.46 PM.png Screen Shot 2011-11-07 at 11.29.18 PM.png 90° Integrální část 2021/11/23 Lipidy, membrány, Karel Kubíček 61 Funkce biologických membrán •Tvoří rozhraní mezi buňkami i uvnitř buněk. •Udržují stálé chemické složení uvnitř ohraničených prostorů, a to selektivními transportními mechanismy. •Jsou prostředím pro rychlou biochemickou transformaci pomocí enzymových systémů. •Specifická struktura a selektivní iontová propustnost je základem bioelektrických jevů 2021/11/23 Lipidy, membrány, Karel Kubíček 62 membrána nitrobuněčný prostor mimobuněčnýprostor Klidové membránové napětí (1) membránové napětí představuje potenciálový rozdíl mezi mikroelektrodou zavedenou do buňky (negativní potenciál) a povrchovou elektrodou mimo buňku (nulový potenciál) Používají se nepolarizovatelné elektrody membrána mimobuněčný prostor 2021/11/23 Lipidy, membrány, Karel Kubíček 63 Klidové membránové napětí (2) Jeho hodnoty závisí na: •typu buňky •druhu živočicha, z něhož buňka pochází •u identických buněk – na skladbě a koncentraci iontových složek roztoků obklopujících buňky •Hodnota klidového membránového napětí při normálním iontové skladbě IC a EC tekutiny: (-100 mV; -50 mV) tloušťka membrány ~ 6 nm intenzita elektrického pole v membráně ~ 107 V/m intenzita elektrického pole na povrchu Země ~ 102 V/m 2021/11/23 Lipidy, membrány, Karel Kubíček 64 Modely klidového membránového potenciálu (1):elektrodifuzní: - popisují procesy fenomenologicky na základě termodynamiky - spojují vznik napětí s difuzí iontů přes membránu - Nernstův a Donnanův model, model transportu iontů (2): fyzikální na bázi chování pevných látek nebo tekutých krystalů: - popisují pohyb iontů přes membránu a jeho blokování - uvažují charakteristické vlastnosti strukturních prvků membrány (lipidy, proteiny) (3): na bázi ekvivalentních elektrických obvodů: - popisují chování buněk v klidu a při jejich excitaci - využívají elektrické vlastnosti buněk v souladu s elektrodifuzními a pevnolátkovými modely 2021/11/23 Lipidy, membrány, Karel Kubíček 65 115 Difuzní napětí (1) vzniká při difuzi nabitých částic Difuzní napětí v neživých systémech - roztoky jsou oddělené membránou permeabilní pro Na+ a Cl- [1] 0.5 mol NaCl [2] 0.1 mol NaCl Kompartmenty jsou elektricky neutrální, ale je přítomen koncentrační gradient Þ difuze iontů z [1] do [2] koncentrační gradient Þ vznikne dočasné napětí mezi oběma kompartmenty Þ difuzní napětí 2021/11/23 Lipidy, membrány, Karel Kubíček 66 116 Difuzní napětí (2) [2] 0.1 mol NaCl [1] 0.1 mol KCl Difuzní napětí v živých systémech - roztoky oddělené membránou selektivně propustnou pro K+ (vpravo) V takovém systému nastává rovnováha, když tam není žádný výsledný tok jednotlivých iontů 116 Þ difuze K+ po jeho koncentračním spádu, dokud nevznikne stejně velký, avšak opačně orientovaný elektrický gradient Þ vznikne rovnovážné napětí je-li výsledný difuzní tok nulový 2021/11/23 Lipidy, membrány, Karel Kubíček 67 2021/11/23 Lipidy, membrány, Karel Kubíček 68 Nernstova rovnice a (Gibbsova -) Donnanova rovnováha Screen shot 2010-11-22 at 10.59.21 PM.png Screen shot 2010-11-22 at 10.59.34 PM.png Screen shot 2010-11-22 at 11.43.48 PM.png 2021/11/23 Lipidy, membrány, Karel Kubíček 69 Screen shot 2010-11-22 at 11.17.36 PM.png Screen shot 2010-11-22 at 11.34.59 PM.png Screen shot 2010-11-22 at 11.19.13 PM.png membrána Elektrolyt I Anionty cAII Kationty cKI Jednoduchý případ membránové rovnováhy (1) Elektrolyt II Kationty cKII Anionty cAI Týž elektrolyt na obou stranách membrány, ale v různých koncentracích (cI > cII), membrána je permeabilní jen pro kationty Výsledek: elektrická dvojvrstva vytvoří se na membráně vrstva 1: anionty zastaveny na straně I vrstva 2: kationty přitahovány k aniontům (II) 2021/11/23 Lipidy, membrány, Karel Kubíček 70 membrána Elektrolyt I Anionty cAII Kationty cKI Jednoduchý případ membránové rovnováhy (2) Elektrolyt II Kationty cKII Anionty cAI Koncentrační rozdíl ”pohání” kationty, elektrické pole dvojvrstvy je “tlačí zpět” V rovnováze: vznikne potenciálový rozdíl U: jI jII - - - - - - - - - + + + + + + + + + (Nernstova rovnice) 2021/11/23 Lipidy, membrány, Karel Kubíček 71 Donnan equilibrium The equilibrium characterized by an unequal distribution of diffusible ions between two ionic solutions (one or both of the solutions may be gelled) separated by a membrane which is impermeable to at least one of the ionic species present, e.g. because they are too large to pass through the pores of the membrane. The membrane may be replaced by other kinds of restraint, such as gelation, the field of gravity, etc., which prevent some ionic components from moving from one phase to the other, but allow other components to do so. 1972, 31, 619 IUPAC Compendium of Chemical Terminology 2nd Edition (1997) 2021/11/23 Lipidy, membrány, Karel Kubíček 72 membrána Elektrolyt I anionty R- Anionty cAII Kationty cKI Elektrolyt II Kationty cKII Anionty cAI Donnanova rovnováha (1) Stejný elektrolyt na obou stranách, různé koncentrace (cI > cII), membrána permeabilní pro malé jednomocné ionty K+ a A-, nepermeabilní pro R- difuzibilní ionty: K+, A- volně difundují nedifuzibilní ionty: R- přítomnost R-: nevznikne rovnoměrné rozdělení K+ i A- Þ speciální případ rovnováhy - Donnanova rovnováha 2021/11/23 Lipidy, membrány, Karel Kubíček 73 membrána Elektrolyt I anionty R- Anionty cAII Kationty cKI Elektrolyt II Kationty cKII Anionty cAI Donnanova rovnováha (2) Rovnovážné koncentrace: Donnanův poměr: 2021/11/23 Lipidy, membrány, Karel Kubíček 74 membrána Elektrolyt I anionty R- Anionty cAII Kationty cKI Elektrolyt II Kationty cKII Anionty cAI Donnanova rovnováha (3) - - - - - - - - - - - + + + + + + + + + + + Donnanův poměr: Donnanovo napětí: 2021/11/23 Lipidy, membrány, Karel Kubíček 75 buněčná membrána intra extra fosfátové anionty proteinové anionty Na+ Cl- K+ K+ Cl- Donnanův model v živé buňce (1) difuzibilní: K+, Cl- nedifuzibilní: Na+, anionty též bílkoviny a nukleové kyseliny Koncentrace: [K+] in > [K+] ex [Cl-] in < [Cl-] ex 2021/11/23 Lipidy, membrány, Karel Kubíček 76 buněčná membrána intra extra fosfátové anionty proteinové anionty Na+ Cl- K+ K+ Cl- Donnanův poměr: Donnanovo napětí: - - - - - - - - - - - + + + + + + + + + + + Donnanův model v živé buňce (2) 2021/11/23 Lipidy, membrány, Karel Kubíček 77