Prof. Jiří Kozelka, Biofyzikální Laboratoř, Ústav fyziky kondenzovaných látek, PřF MU, Kotlářská 2, kozelka.jiri@gmail.com Vitamín A, biofyzika vidění 1.12.2023 F5351 Základy molekulární biofyziky Masarykova Univerzita Podzimní semestr 2023 OPVK_MU_min Vitamin A Vitamín A je výchozí látkou pro syntézu 11-cis-retinalu, chromoforu, který používají téměř všechny organizmy k zachycování zrakových vjemů. 11-cis-retinal je chromoforem, který používají jak tyčinky, tak čípky lidského oka k zachycení světelných vjemů. Pří absorpci fotonu dojde k izomerizaci na trans-izomer. Tato reakce je sama o sobě energeticky výhodná (DG0 = -4 kcal/mol), avšak retinal je zakotven v proteinu zvaném opsin, který konformaci all-trans znevýhodňuje. Výhodná konformační změna retinalu je tedy spojena s energeticky nevýhodnou změnou konformace proteinu (výsledná DG0 je přibližně +35 kcal/mol, proto je zapotřebí energie fotonu).1 Relaxace této napjaté struktury nastartuje řadu signálních procesů, které vedou k elektrickému signálu v mozku. V dnešní přednášce se pokusíme objasnit tři problémy: 1. Jak probíhají první fáze přenosu světelného vzruchu? 2. Odkud pochází energie k syntéze energeticky nevýhodné konformace 11-cis-retinalu? Oxidací vitaminu A vzniká retinol ve své konformaci all-trans. 3. Jak je možné, že tentýž chromofor, 11-cis-retinal, který sám absorbuje v oblasti UV, slouží jako čidlo pro viditelné světlo, a to různých barev? 1 Nakanishi, K. Pure Appl. Chem. 1991, 63, 161-170. 12 V tyčinkách i čípcích je 11-cis-retinal zakotven v proteinu zvaném opsin. Konformační změna vyvolaná absorpcí fotonu umožní připojení opsinu na G-protein transducin. To je první fáze signální kaskády. upraveno podle http://www.sas.upenn.edu/~tareilaj/retinalandrhodopsin.html all-trans retinol (vitamine A) enzym: all-trans retinol dehydrogenase šíření vzruchu jak? (1) odkud? (2) Opsin + 11-cis-retinal = „oční pigment“ („visual pigment“) Lidská sítnice obsahuje 4 různé oční pigmenty: Rhodopsin v tyčinkách, lmax= 500 nm(krystalová struktura známa) Jodopsin v čípcích Červený, lmax= 557 nm Zelený, lmax= 530 nm Modrý, lmax= 425 nm (struktura jodopsinů je podobná struktuře rhodopsinu, ale zatím přesně neurčena) Většina studií mechanismu byla zatím věnována rhodopsinu. Jakým způsobem reguluje opsin vlnovou délku absorpce retinalu? (3) Rodopsin a jodopsiny jsou membránové proteiny. V tyčinkách je rodopsin zakotven v membráně disků, v čípcích jsou jodopsiny zakotveny v průchozí plazmové membráně Oko2.gif Rodopsin a jodopsiny jsou membránové proteiny Konformační změna rodopsinu umožní vazbu s transducinem a jeho aktivaci. Fotoizomerizace retinalu Fotoizomerizace retinalu způsobí konformační změnu rodopsinu. Tou se obnaží smyčka spojující šroubovice, na kterou se může vázat G-protein transducin. Nakanishi, K. Pure Appl. Chem. 1991, 63, 161-170. Membrána Konformační změna rodopsinu umožní vazbu s transducinem a jeho aktivaci. zesílení signálu Jako všechny G-proteiny obsahuje transducin vazebné místo pro GDP nebo GTP. V neaktivní formě je vázán na GDP. Vazba na aktivovanou formu rodopsinu („Meta II“) umožní výměnu GDP za GTP. Takto aktivovaný transducin se odpojí a na obnaženou smyčku se může navázat další molekula neaktivního transducinu. GDP GTP Nakanishi, K. Pure Appl. Chem. 1991, 63, 161-170. > Konformační změna rodopsinu umožní vazbu s transducinem a jeho aktivaci. GDP GTP RK Nakanishi, K. Pure Appl. Chem. 1991, 63, 161-170. Konformační změna rodopsinu vytvoří na carboxylovém terminálu vazebné místo pro rodopsin-kinázu (RK), která tam forsforyluje aminokyseliny serin a threonin. fosforylace Konformační změna rodopsinu umožní vazbu s transducinem a jeho aktivaci. RK Nakanishi, K. Pure Appl. Chem. 1991, 63, 161-170. Konformační změna rodopsinu vytvoří na carboxylovém terminálu vazebné místo pro rodopsin-kinázu (RK), která tam forsforyluje aminokyseliny serin a threonin. GDP GTP fosforylace Konformační změna rodopsinu umožní vazbu s transducinem a jeho aktivaci. RK Nakanishi, K. Pure Appl. Chem. 1991, 63, 161-170. Konformační změna rodopsinu vytvoří na carboxylovém terminálu vazebné místo pro rodopsin-kinázu (RK), která tam forsforyluje aminokyseliny serin a threonin. Fosforylovaná forma Meta II má vysokou afinitu pro protein arrestin, tento inhibitor zablokuje přístup dalším molekulám transducinu. Mezitím se ale stačilo ~100 molekul transducinu aktivovat (=zesílení signálu). GDP GTP arrestin fosforylace Meta II Rhodopsin-Meta II váže Transducin. Na něm se touto vazbou zvýhodní výměna GDP za GTP, výměnou se transducin aktivuje a získá vazebné místo pro PDE. PDE aktivovaný transducinem hydrolyzuje cGMP na GMP. R.H.Kramer, E. Molokanova, J. Exp. Biol. 204, 2921 (2001) cGMP 5’-GMP 5’ 3’ 5’ 3’ Meta II Rhodopsin-Meta II váže Transducin. Na něm se touto vazbou zvýhodní výměna GDP za GTP, výměnou se transducin aktivuje a získá vazebné místo pro PDE. PDE aktivovaný transducinem hydrolyzuje cGMP na GMP. R.H.Kramer, E. Molokanova, J. Exp. Biol. 204, 2921 (2001) Při nedostatku cGMP ( ) se uzavře „Cyclic nucleotide-gated channel“ (CNG channel) a stane neprůchodným pro kationty (Na+/K+/Ca2+), membrána se hyperpolarizuje. To je signál, který se dále vede do mozku. Ochuzení ionty Ca2+ má další efekt: Ca2+ přestane bránit GCAP (Guanylate Cyclase-Activating Protein) v aktivaci enzymu Guanylate Cyclase (GC), ten tak znovu začne produkovat cGMP, což světelný vzruch ukončí. Jak je tvořen cis-11-retinal z vitamínu A? Oxidací vitamínu A vzniká all-trans-retinal. Izomerizace all-trans-retinalu na cis-11-retinal je ale energeticky nevýhodná (DG0 = +4 kcal/mol). Jak buňka syntetizuje energeticky nevýhodnou konfiguraci? DG0 = +4 kcal/mol Biosynthesis of 11-cis-retinal, the chromophore of visual pigments Hydrolysis: DG0 » -5 kcal/mol exergonic Isomerization: DG0 = +4 kcal/mol endergonic Total : DG0 » -1 kcal/mol exergonic Energy source The energy for the unfavorable isomerization of all-trans-retinol to 11-cis-retinol comes from phospholipid esters of the retinal membrane See: R. R. Rando, The Chemistry of Vitamin A and Vision, Angew.Chem.Int.Ed. 29, 461-480 (1990) 1. Hydrolýza esteru 2. Izomerace na vazbě 11 Jak je možné, že 11-cis-retinal, který absorbuje v oblasti UV, slouží jako čidlo pro viditelné světlo, a to různých barev? 11-cis-retinal: lmax= 380 nm Rodopsin v tyčinkách: lmax= 498 nm Jodopsin v čípcích Červený: lmax= 564nm Zelený: lmax= 534 nm Modrý: lmax= 420 nm 410px-Cone-response M Č Z 1. část odpovědi: 11-cis-retinal je k opsinu vázán přes amino-skupinu lysinu 296 tvorbou tzv. Schiffovy báze: pKa protonované Schiffovy báze silně závisí na okolí v molekule. V rodopsinu a jodopsinech je Schiffova báze protonovaná. Vytvořením Schiffovy báze se podstatně změní absorpční spektrum 11-cis-retinalu. Jednoduchý model pro rodopsin/jodopsiny: Schiffova báze z reakce 11-cis-retinalu s n-butylaminem: lmax= 440 nm lmax= 380 nm 2. část odpovědi: elektronové přechody v protonované Schiffově bázi budou záviset na elektrostatických interakcích s okolím. Výpočty skupiny B. Honiga ukázaly, že batochromní posun absorpce Schiffovy báze v rodopsinu může pocházet z interakce s negativně nabitou skupinou v okolí chromoforu. Pokusy s deriváty 11-cis-retinalu a 9-cis-retinalu, kde konjugovaný systém dvojných vazeb byl na různých místech přerušen, umožnily předpovědět, kde se negativní náboj musí nacházet. lmax(R = n-butyl) lmax(R = opsin) Dn (cm-1) „opsin shift“ ~ 15 14 11 11 Honig, B, Nakanishi, K., et al.,. J. Am. Chem. Soc. 1979, 101, 7084. Největší „opsin shifts“ jsou pozorovány pro deriváty, kde chromofor je omezen na fragment mezi C13 a N+. Negativní náboj v opsinu, který způsobuje „opsin shift“, se tedy musí nacházet v blízkosti tohoto fragmentu. B. Honig a K. Nakanishi pomocí výpočtů vyvinuli tzv. „External point-charge model“, kde se nachází náboj -1 e ~3 Å od atomu C12. lmax(R = n-butyl) lmax(R = opsin) Dn (cm-1) „opsin shift“ ~ 15 14 11 11 Honig, B, Nakanishi, K., et al.,. J. Am. Chem. Soc. 1979, 101, 7084. Největší „opsin shifts“ jsou pozorovány pro deriváty, kde chromofor je omezen na fragment C14-N+. Negativní náboj v opsinu, který způsobuje „opsin shift“, se tedy musí nacházet v blízkosti tohoto fragmentu. B. Honig a K. Nakanishi pomocí výpočtů vyvinuli tzv. „External point-charge model“, kde se nachází náboj -1 e ~3 Å od atomu C12. Honig, B, Nakanishi, K., et al.,. J. Am. Chem. Soc. 1979, 101, 7084. Podle modelu optimalizovaného pro hovězí rodopsin 11-cis-retinal nemůže být planární (jak by vyžadovala optimalizace p-systému), ale musí ležet zhruba ve dvou rovinách vzájemně pootočených kolem vazby C12-C13. Krystalová struktura hovězího rodopsinu byla zjištěna o 20 let později... metyl metyl 1F88_detail X-ray structure of bovine rhodopsin,Palczewski et al., Science 289: 739-745 (2000) 11-cis-retinal bound to K296 NZ atom of lysine K296 Glutamate E113 C12 6Å Umístění negativně nabité skupiny (E113) zhruba odpovídá strukturnímu modelu předpovězenému Honigem & Nakanishim, i když vzdálenost od C12 je delší, než předpovězeno. Molekula 11-cis-retinalu leží zhruba ve dvou rovinách, jak předpovězeno výpočty Honiga a Nakanishiho. Obě roviny jsou ale vůči sobě pootočeny rotací kolem vazby C11-C12, a ne kolem vazby C12-C13, jak předpovězeno. C11 Cvičení Jak uvedeno na začátku prezentace, konformační změna rodopsinu po absorpci fotonu a izomerizaci retinalu je spojená s DG0 přibližně +35 kcal/mol. Stačí energie fotonu na nabuzení této energeticky nevýhodné konformace? Vypočtěte energii fotonu pro vlnovou délku 500 nm v jednotkách kcal/mol.