Část  3  &  4:     Opakování:  Helikální  parametry   9  rotačních  helikálních  parametrů   Vzhledem  k  helikální  ose   Báze  vůčí  sobě   Páry  bazí  vůči  sobě   9  tranlačních  helikálních  parametrů   Vzhledem  k  helikální  ose   Báze  vůčí  sobě   Páry  bazí  vůči  sobě   Helikální  osa   Přehled  základních  strukturních   motivů  NK   Přehled  základních  strukturních   motivů  NK    i-­‐mo&f   H-­‐DNA   Přehled  metod    strukturní  analýzy   Vysoké  rozlišení    (atomární  struktura)   Nízké  rozlišení    (strukturní  vlastnos&)   Difrakce:   a)  Elektronová   b)  Neutronová   c)  Roentgenová   Nukleární  magne&cká   resonance   Elektronová  microskopie   IČ/Ramanova  spektroskopie   Spektroskopie:   a)  Cirkulární  dichroismus   b)  Fluorescenční  (FRET)   c)  Elektronová   paramagne&cká  resonance   Metody  vysokého  rozlišení:  statistika   Nukleární  magnetická  rezonance   Nukleární  –  protože  využívá  vlastnos1  atomových  jader  některých   izotopů  majících  nenulový  rotační  moment  (spin)  a  s  ním  spojený   magne1cký  moment.     Magne&cká  –  protože  magne1cké  momenty  těchto  jader  zaujmou   v  homogením  magne1ckém  poli  2I+1  orientací  lišící  se  svojí  energií.   Příčemž  magne1cký  moment  vykonává  kolem  směru  mg.  pole   precesní  pohyb.     Rezonanční  –  protože  jádra  na  nižší  energe1cké  hladině  jsou   schopna  absorbova  energy  z  vysokofrekvenčního  pole,  jestliže   frekvence  precesního  pohybu  jejich  mg.  momentu  a  kruhová   frekvence  pole  je  stejná.   Stern-­‐Gerlachův  experiment   Kvantové  číslo  jaderného  spinu  I   I  =  0  -­‐  sudé  hmotnostní  a  atomové  číslo  -­‐  12C,  16O   I  =    celočíselné  -­‐    sudé  hmotnostní  a  liché                                  atomové  číslo  -­‐  14N,  10B,  2H   I  =    polovinové  -­‐  liché  hmotnostní  číslo  -­‐  1H,  13C,   15N,  19F,  29Si,  31P   Z  interpretačních  důvodů  máme  radi  jádra  s  I  =  ½  (1H,  13C,  15N,  31P).   Podmínka  resonance   2πν =γB ΔE = hν Citlivost  NMR   Typický  biomolekulární  NMR  vzorek:   a)  Koncetrace  –  250  μM  –  3  mM   b)  Vodný  roztok   c)  pH  =  5  –  8,  iontová  síla  25  –  300  mM   d)  Teplota  1-­‐35  oC   Charakteristiky  NMR  spekter   Charakteristiky  NMR  spekter   1)  Počet  signálů  –  počet  strukturně  neekvivalentních  atomů                                                                    sledovaného  isotopu  v  molekule   2)  Poloha  signálů  –  odráží  vliv  elektronického  okolí  zkoumaného  jádra   3)  Intenzita  signálů  –  odráží  rela&vní  zastoupení  magne&cky                                                                                ekvivalentních  atomů   4)  Štepení  signálů–  charakterizuje  ovlivnění  lokálního  magne&ckého                                                                        pole  působící  na  studované  jádro  magne&ckými                                                                          momentyjader  vázaných  v  okolí   Počet  signálů–  symetrická   (ne)ekvivalence   Ad  1)  Počet  signálů  ve  spektru  =  počtu  symetricky  neekvivalentních                          atomů  daného  isotopu  ve  zkoumané    molekule   Symetricky  ekvivalentní  jadra/skupiny  =  jádra/skupiny  zaměnitelné                                                                                                                                                      libovolnou  operací  symetrie.   1  signál   3  signály  (6:2:1)   Počet  signálů–  symetrická   (ne)ekvivalence   Vzorový  příklad  ke  zkoušce:   Jakou  strukturu  má  sloučenina  vzorce  C3H8O,  sestává-­‐li  její   vodíkově  NMR  spektrum  ze  tří  signálů  s  poměrem  intenzit  1:1:6?   Počet  signálů  a  prochiralita   Je  vyznačená  CH2  prochirální?  Pokud  ano,  je  tato  skupina   enan&otopní  nebo  diastereotopní?   Pokud  existuje  pomyslná  rovina  půlící  úhel  3-­‐C-­‐3,  která  je  zároveň   rovinou  symetrie  celé  molekuly  je  prochirální  centrum  enan&otopní.     Pokud  tomu  tak  není,  klasifikujeme  prochirální  skupinu  jako     diastereotopní.                                                                                                                                                           Počet  signálů–  prochiralita   Kolik  signálů  lze  očekávat  v  NMR  spektru?   Pokud  je  prochirální  centrum  enan&otopní  =>  chemicky  stejné     subs&tuenty  dávají  pouze  jeden  signál  ve  spektru.     Pokud  je  prochirální  centrum  diastereotopní  =>    chemicky  stejné     subs&tuenty  dávají  dva  signály  ve  spektru.       Pomůcka:  prochirální  subs&tuenty  v  chirální  (dissymetrické)  molekule   Jsou  vždy  diastereotopní.       Diastereotopní,  2  signály  (1:1)   Počet  signálů–  prochiralita   Vzorový  příklad  ke  zkoušce:   Najděte  prochirální  centra  v  molekule  a  určete  možný  počet  signálu   v  1H  NMR  spektru.   Počet  signálů–  prochiralita   Vzorový  příklad  ke  zkoušce:   Najděte  prochirální  centra  v  molekule  a  určete  možný  počet  signálu   v  1H  NMR  spektru.  Stanovte  rela&vní  poměr  jejich  intezit.   1   2   1   1   Poloha  signálů  -­‐  chemické  stínění   Elektrony  v  okolí  sledovaného  jádra  vytvářejí  pod  vlivem  vloženého   magne&ckého  pole  B0  sekundární  magne&cké  pole  (Beff).   2πν =γBeff Beff = B0 ⋅ 1−σ( ) Srnící  konstanta  (σ)  charakterizuje  polohu  jádra  v  molekule  (odráží   jeho  chemické  okolí).   Poloha  signálů  -­‐  chemický  posun   Chemický  posun  –  ustálený  způsob  zapisu  polohy  signálu  ve  NMR   spektrech.  Jednotky  ppm.   δ = ν −νs ν0 Pracovní  frekvence  spektrometru   Rezonanční  frekvence     referenční  sloučeniny.   Chemický  posun  –  závislost  na   chemickém  okolí   Hyper-­‐jemná  struktura  NMR  spekter:   Skalární  interakční  konstanta   frekvence   B0   fa=f+1/2J   fb=f-­‐1/2J  f   fa-­‐fb=J   Nepřímá  spin-­‐spinová  interakce  magne&ckých  momentů    jader   prostřednictvím  polarizace  orbitálních  pohybů  valenčních  elektronů    (J  [Hz]).   Strukturní  interpretace  J   Způsob  zapisu:  nJX-­‐Y,  např.  3JH-­‐H  =  spin-­‐spinová  interakční  konstanta   popisující  interakci    mezi  dvěma  atomy  vodíku  vzdálených  jeden  od   druhého  přes  tří  kovalentní  vazby.   Karplusova  rovnice:     kvan1ta1vní  popis  vztahu  mezi  torzním  úhlem  a  J.   Nukleární  Overhauserův  efekt  (NOE)   Porucha  energe&ckého  stavu  jednoho  z  jader    může  způsobit  zvýšení  intenzit  signálů   jader  stejného  druhu,  které  jsou  prostorově  blízko.  NOE  závisí  na  prostorové  blízkos&   mezi  jádry  (nejčastěji  vodíků).   Jedinečný  zdroj  informace  o  meziprotonových  vzdálenostech  (  <  6  A).  Jeden  z  hlavních   zdrojů  strukturní  informace  v  biomolekulární  NMR.       NMR  v  biomolekulární  strukturní   analýze   Strukturní  analýza  pomocí  NMR  =  konformační  analýza     (NMR  neposkytuje  žádnou  informaci  o  vazebných  delkách     a  vazebných  úhlech).   Experimentální  data  NMR  (mezi-­‐protonové  vzdálenos&,  torzní  uhly,   rela&vní  orientace  vazebných  vektorů,  …)     +   Externí  informace  o  topologii  studované  molekuly,  idealizovaných   vazebných  délkách  a  vazebných  úhlech.   NMR  v  biomolekulární  strukturní   analýze:  procedura   NMR  v  biomolekulární  strukturní   analýze:  procedura   V  prostoru  torzních  úhlů,  který  je  omezen  experimentálními  daty,   hledáme  stav  s  nejnižší  energií.     NMR  v  biomolekulární  strukturní   analýze   Etotal= Ebond+ Eangle+ Edihedr+ EvdW+ Ecoulomb+ ENMR KNOE(rij-rij 1)2 if rijrij u 0 if rij l