LOSCHMIDT LABORATORIES SPEKTROSKOPIE CIRKULARNIHO DICHROISMU PROTEINŮ RADKA CHALOUPKOVÁ Loschmidtovy laboratoře Ústav experimentální biologie Masarykova Universita, Brno 1/39 Osnova I □ struktura proteinů □ analýza sekundární s terciární struktury protei □ chiroptické techniky □ spektroskopie cirkulárního dichroismu - fyzikální podstata - spektra cirkulárního dichroismu proteinů - príprava vzorku proteinu pro mereni - příklady využití - výhody a limitace Spektroskopie cirkulárního dichroismu proteinů 2/39 Struktura proteinů Spektroskopie cirkulárního dichroismu proteinů 3/39 Analýza struktury proteinů □ spektroskopie cirkulárního dichroismu □ infračervená spektroskopie □ Ramanova spektroskopie □ fluorescenční spektroskopie □ NMR spektroskopie □ rentgenová krystalografie □ neutronová krystalografie Spektroskopie cirkulárního dichroismu proteinů 4/39 Chiroptické techniky Metoda Definice Vlnové délky Optická rotační Závislost úhlu stočení roviny lineárně 180-800 nm disperse ORD polarizovaného světla na vlnové délce procházejícího záření. Cirkulární dichroismus CD Závislost rozdílu absorbance pro vlevo a vpravo kruhově polarizované světlo na vlnové délce absorbovaného záření. 180-1000 nm Spektroskopie cirkulárního dichroismu proteinů 5/39 Chirální molekuly □ neztotožnitelné se svým zrcadlovým obrazem □ příčiny chirality - přítomnost stereogenního centra - vnitřní chiralita - kovalentní interakce achirální molekuly s chirální molekulou - inherentní chiralita struktury celé molekuly Spektroskopie cirkulárního dichroismu proteinů 6/39 Lineárně polarizované světlo □ konstantní směr (orientace), modulovaná amplituda □ úsečka o délce 2 A max Kruhově polarizované světlo □ konstantní amplituda, modulovaná orientace □ kruh s průměrem 2Amax Spektroskopie cirkulárního dichroismu proteinů 8/39 Fyzikální podstata Spektroskopie cirkulárního dichroismu proteinů 9/39 Fyzikální podstata Spektroskopie cirkulárního dichroismu proteinů 10/39 Fyzikální podstata Spektroskopie cirkulárního dichroismu proteinů 11/39 Fyzikální podstata - shrnutí □ lineárně polarizovaný paprsek je vektorovým součtem dvou opačných kruhově polarizovaných paprsků (R a L) □ při průchodu opticky aktivním chromoforem jsou R a L paprsky rozdílně absorbovány □ výsledné záření je elipticky polarizované Equal proportions of right and left circular polarizations Right polarization preferentially absorbed Spektroskopie cirkulárního dichroismu proteinů 13/39 Jednotky cirkulárního dichroismu □ CD data prezentována elipticitou nebo absorbancí □ CD data normalizována na molární koncentraci chromoforu a počet opakujících se jednotek (peptidová vazba) Název Symbol Definice Jednotka rozdíl molárních extinčních koeficientů elipticita molární elipticita As 6 obs LA as = £L - £R = — M-i.cm-1 tan 6>obs = 4 = 5L . 5R deg a £L + £, R e m _(6>obs.100) c./ deg.cm2.dmoľ1 molární reziduálni elipticita 6 MRE = (<9ote.Mw.l00) deg.cmldmoľ1 Spektroskopie cirkulárního dichroismu proteinů 14/39 Proteinové chromofory □ daleká UV oblast 180-250 nm chromoforem je peptidová vazba infromace o sekundární struktuře proteinu □ blízká UV oblast 260-320 nm chromofory jsou aromatické aminokyseliny a disulfidické můstky informace o průměrných změnách v terciální struktuře proteinů Spektroskopie cirkulárního dichroismu proteinů 15/39 Daleká UV oblast 190 200 210 220 230 240 vlnová délka (nm) Spektroskopie cirkulárního dichroismu proteinů 16/39 -1-1-1-1—^-r~ 200 220 240 260 280 300 vlnová délka (nm) Spektroskopie cirkulárního dichroismu proteinů 17/39 Příprava vzorků pro CD měření □ vysoká čistota ~ 95% (kontrola na SDS gelu) □ homogenní vzorek bez proteinových agregátů (filtrace proteinu) □ odstranění oligonukleotidových fragmentů (přídavek nukleasy před purifikací proteinu) □ odstranění imidazolu/NaCI po purifikaci (dialýza, gelová filtrace) □ odstranění stabilizačních látek (EDTA, dithiotheitol) □ volba vhodného pufru pro měření v daleké UV oblasti □ množství proteinu pro měření v daleké UV oblasti 50-500 [jg Spektroskopie cirkulárního dichroismu proteinů 18/39 Volba pufru pro CD měření Složka pufru Nulová absorbance nad: Absorbance (10 mM roztok v 0.1 cm kyvetě) 210 nm 200 nm 190 nm 180 nm NaCI 205 nm 0 0.02 > 0.5 > 0.5 NaF, KF 170 nm 0 0 0 0 NaCI04 170 nm 0 0 0 0 Na2HP04 210 nm 0 0.05 0.3 > 0.5 NaH2P04 195 nm 0 0 0.01 0.15 NaOH 230 nm > 0.5 > 2 > 2 > 2 Boric acid 180 nm 0 0 0 0 Borate/Na+ (pH 9) 200 nm 0 0 0.09 0.3 Glycine 220 nm 0.03 0.1 > 0.5 > 0.5 Tris/H2S04 (pH 8) 220 nm 0.02 0.13 0.24 > 0.5 Acetate/Na+ 220 nm 0.03 0.17 > 0.5 > 0.5 Spektroskopie cirkulárního dichroismu proteinů 19/39 Využití CD spektroskopie □ analýza sekundární struktury proteinů □ sledování konformačních změn - teplotní a pH stabilita, stabilita vůči denaturačním činidlům - porovnání struktury mutantních variant s divokým typem - vliv aditiv (solventy, soli) na strukturu a stabilitu proteinů □ kinetika „foldingu" a „refodingu" proteinů □ design nových peptidů a proteinů □ studium protein-ligandových interakcí, design léčiv (inhibitorů) □ studium protein-proteinových a protein-DNA interakcí Spektroskopie cirkulárního dichroismu proteinů 20/39 180 195 210 225 240 255 vlnová délka (nm) Analýza sekundární struktury 21/39 Příklady využití CD spektroskopi Home Input Data User Guide Background Information FAQ References Links Contact Us Terms and Conditions Cookies On-line analysis for protein Circular Dichroism spectra Apply for a user-account Analyse data (registered users only) Citing DichroWeb: If you use DichroWeb for your analysis you agree to cite the publications detailing the original methods and reference data used, as well as one of the specific DichroWeb papers: Whitmore, L. and Wallace, B.A. (2008) Biopolymers 89: 392-400. (PDF) Whitmore. L. and Wallace. B.A. (2004) Nucleic Acids Research 32: W668-673. (PDF) DichroWeb News Analyses now possible using Membrane Protein data set SMP180. Abdul-Gader A, Miles AJ, Wallace BA. Biomforrnatics (2011) 27 1630-6. Video guide for Cleaning and Loading Circular Dichroism Cells Related Projects 2Struc: The Secondary Structure Server and the Protein Circular Dichroism Data Bank are now open for use. DichroWeb currently has 3600+ registered users and has performed over 375,000 deconvolutions. DichroWeb is produced by Dr. L. Whitmore, in the lab of Professor B.A. Wallace at the Department of Crystallography, Institute of Structural and Molecular Biology, Birkbeck College, Onversity of London, OK. © 2012. We are supported by a grant from the BBSRC. Analýza sekundární struktury 22/39 Příklady využití CD spektroskopi Protein a-helix (%) (3-list (%) smyčky(%) nepravidelná (%) DbeA 49 13 11 27 DbjA 48 13 10 29 DhaA 39 16 16 39 LinB 40 14 15 31 DmbA 42 15 12 31 DhlA 41 15 14 30 Analýza sekundární struktury 23/39 -20 -\-1-1-1-r- 195 210 225 240 255 vlnová délka (nm) Sledování konformačních změn: pH stabilita 24/39 vlnová délka (nm) Sledování konformačních změn: pH stabilita 25/39 180 195 210 225 240 255 vlnová délka (nm) Sledování konformačních změn: wt x mutant 26/39 20 40 60 T(°C) Sledování konformačních změn: teplotní stabilita 27/39 -16 20 40 60 80 T(°C) Sledování konformačních změn: teplotní stabilita 28/39 0,0 5,0 10,0 15,0 20,0 25,0 čas (h) Sledování konformačních změn: teplotní stabilita 29/39 Příklady využití CD spektroskopi -12 -I-1-1-1 H-1-1-1 -I-1-r 200 220 240 260 200 220 240 260 200 220 240 260 vlnová délka (nm) Sledování konformačních změn: stabilita v přítomnosti organických rozpouštědel 30/39 12 -I-1-■-1 H-1-1-1 H-1-1-1 200 220 240 260 200 220 240 260 200 220 240 260 vlnová délka (nm) -12 H-,-,-1 H-1-1-1 H-1-1-1 200 220 240 260 200 220 240 260 200 220 240 260 vlnová délka (nm) 190 215 240 265 290 315 340 vlnová délka (nm) Sledování konformačních změn: protein-DNA interakce 33/39 vlnová délka (nm) Sledování konformačních změn: protein-DNA interakce 34/39 Výhody a limitace CD spektroskopie □ snadnost a rychlost měření □ malé množství a nízká koncentrace vzorku □ nevyžaduje přítomnost značených molekul □ komplementární strukturní informace z různých oblastí spektra □ nedestruktivní technika □ strukturní informace s relativně nízkým rozlišením □ žádná informace o kvartérní struktuře proteinů Spektroskopie cirkulárního dichroismu proteinů 35/39 Výhody a limitace CD spektroskopie Spektroskopická Požadavky na vzorek Merici cas Analýza dat Strukturní informace technika c [mg/ml] need daleká-UV CD 0.1-1.0 - 15-50 min 1-2 dny 2D struktura, konformační změny blízká-UV CD 0.5-5.0 - 15-50 min 2-4 hod 3D „otisk prstu" IR, Raman 10-20 2H 10-20 hod 1-2 dny 2D struktura fluorescence 0.005-0.5 - 10-30 min 2-4 hod změny ve 3D NMR 10-40 13C, 15N 1-3 týdny 2-6 měsíců 3D atomární úroveň, dynamika rentgenová krystalografie 5-50 krystal 10-30 min měsíce-roky 3D atomární úroveň, statická struktura neutronová krystalografie 5-50 krystal, 2H 1-4 týdny měsíce-roky 3D atomární úroveň, protonové interakce Spektroskopie cirkulárního dichroismu proteinů 36/39 Výhody a limitace CD spektroskopii Spektroskopie cirkulárního dichroismu proteinů 37/39 Užitečné reference □ Fasman, G.D. (1996) Circular Dichroism and the Conformational Analysis of Biomolecules, Springer US □ Kelly, S.M. et al. (2005) How to Study Proteins by Circular Dichroism, Biochim. Biophys. Acta 1751: 119-139 □ Harding, S.E., Chowdhry, B.Z. (2001) Protein-Ligand Interactions: Structure and Spectroscopy, Oxford University Press □ DOTAZY? 38/39 V LOSCHMIDT LABORATORIES f If