Caernorhabditis elegans 0,01 mm 0,01 mm 0,5 mm dospělec oplozené vajíčko rýhování embryogeneze vylíhnutí hodiny po oplození Nobelova cena 2002 za fyziologii a lékařství za objevy genetické regulace orgánového vývoje a programované buněčné smrti … na modelu Caenorhabditis elegans Sydney Brenner (1927, JAR) Robert Horvitz (1947, USA) John Sulston (1942, UK) g – gonáda h – hypodermis i – střevo m – svaly nc – nervová trubice Anatomie C. elegans 1. malá, snadno se kultivuje (živí se E. coli) 2. jednoduché tělo: 959 tělních buněk , 1031 u 3. dobře diferencované tkáně včetně nervové soustavy 4. průhledné tělo po celý životní cyklus 5. krátká generační doba: 3,5 dne při 20oC 6. invariantní vývoj a anatomie 7. samooplození (a částečně křižitelná) 8. malý, již sekvencovaný genom ( ~108 bp = 100 Mb = 0,1 pg ) C. elegans – model mozaikového vývoje Buněčná genealogie C-elegans tkáně jsou polyklonálního ůvodu hypodermis hltan nervové buňky (389) hltan střevo hypodermis svaly (20) svaly žlázy nervové buňky nervové buňky (47) (80) zárodečné buňky svaly (20) hypodermis hltan nervové buňky (389) hltan střevo hypodermis svaly (20) svaly žlázy nervové buňky nervové buňky (47) (80) zárodečné buňky svaly (20) ➢ základní životní cyklus je diploidní ➢ 6 vazebných skupin, odpovídá to 6 chromosomům v haploidní sadě: 5 autosomů a 1 pohlavní chromosom X ➢ hermafrodit má dva chromosomy X v diploidní buňce ➢ hermafrodit tvoří ~ 300 spermií, pak tvoří oocyty ➢ meiosa u hermafrodita vytváří gamety s jednou sadou autosomů a jedním X ➢ samooplození obvykle dává vznik embryu 2 X : 2 A = hermafroditu Základní genetická characteristika C. elegans Caenorhabditis elegans : vznik a dědičnost pohlaví XX XX XO XX XO Pro genetiku jsou potřební samečci ➢ Příležitostná ztráta chromosomu X v průběhu meiosy u hermafrodita dává gamety bez X. Frekvence asi 1 na 500 meios. Když je gameta oplozena, výsledkem je diploidní živočich pouze s 1 X. ➢ Jedinec červa pouze s jedním chromosomem X v diploidní buňce se vyvíjí jako sameček. ➢ Žádný chromosom Y u C. elegans není, samečka značíme XO. ➢ V meiose u samečka segreguje jediný chromosom X a tvoří se dva druhy spermií: s jedním chromosomem X resp. žádným: ➢ Křížení samečka s hermafroditem dává v potomstvu stejné počty samečků a hermafroditů. male sperm oocyte 1X, 1A 1A 1X, 1A X0, AA XX, AA male hermaphrodite oocyty hermafrodita spermie samečka Mutageneza C. elegans + / + + / m m / m+ / m+ / + Po F1 F2 mutagen: chemický, př. EMS fyzikální, př.  - záření aplikace na Po když zárodečná linie má mnoho mitotických buněk: larva ve stádiu L4 1/4 samooplození dává vznik homozygotům v F2 Mutageneza C. elegans Jaké typy mutantů můžeme mít ? ➢ morfologické př. Dumpy (Dpy) – krátké, tlusté tělo Long (Lon) – delší než WT ➢ chování (pohyb) př. Uncoordinated (Unc) Roller (Rol) ➢ heterochronní př. Cell Lineage Abnormal (Lin) ➢ letální př. Lethal (Let) ➢ sexuální transformace př. Masculinizing (Tra) Feminizing (Fem) Účinek genů řídících programovanou buněčnou smrt u hlístice : geny cell death ced-3 a ced-4 (produkující cytotoxiny) jsou řízeny (inhibovány) genem ced-9 - jestliže je tento gen aktivní, buňka se nepodrobí apoptóze buňka určená k zániku indukce apoptózy pohlcení fagocytózou, degradace buňky i jádra buňka „hrobník“ nukleáza larva anterior posterior Buněčný osud hlístice podél antero-posteriorní osy je určován jediným (kolineárním) shlukem Hox genů - s homologiemi ke čtyřem homeotickým genům z komplexu Antennapedia mouchy nemá článkované tělo! Časování vývojových procesů, zapínání a vypínání genů v závislosti na koncentraci a čase, prahové hodnoty HETEROCHRONNÍ GENY HETEROCHRONNÍ MUTACE model řízení časového vývoje larvy C-elegans specifická stádia larválního vývoje jsou určována hladinou proteinu lin-14 koncentrace lin-14 vysoká střední nízká časový gradient lin-14 je výsledkem transkripční represe lin-14 proteinem lin-4, začínající při časném vývoji larvy standardní typ represe lin-4 lin-14 mutace, „získání“ funkce, nebo „ztráta“ lin-4 funkce lin-14 mutace, „ztráta“ funkce Buněčná genealogie u WT a heterochronních mutantů C-elegans standardní typ „předčasný“ mutant „opožděný“ mutant lin-14 (lf) ln-14 (gf ) mutace „ztráta funkce“ mutace „získání“ funkce klíč : buněčná smrt larvální stádia (1-4) předčasná tvorba specifických linií retardace vývoje linií, opakování vývojových typů (i) RNA-dependentní RNA polymeráza ss RNA ds RNA (ii) Dicer : ribonukleáza ds RNA malé ds RNA ( ~ 22 nt ) (iii) Argonaut (RISC) - proteiny ribonukleázového komplexu : štěpení (endogenní homologní) mRNA Craig Mello, Andrew Fire (Carnegie Institution 1998) 2006: NOBELOVA CENA ZA FYSIOLOGII A LÉKAŘSTVÍ SELEKTIVNÍ UMLČOVÁNÍ GENŮ PROSTŘEDNICTVÍM RNA INTERFERENCE (1)(2) (3)