Chromosomy Drosophila •3 páry autosomů •samečci a samičky • se liší v pohlavních • chromosomech • •samečci XY • •samičky XX Drosophila | insect genus | Britannica Drosophila melanogaster 0,1 mm Drosophila melanogaster : životní cyklus dospělec metamorfóza oplozené vajíčko rýhování gastrulace vylíhnutí 3. 2. 1. larvy 1.- 3. instaru kukla minut po oplození hodin po oplození dny 6 Chromosomy Drosophila •3 páry autosomů •samečci a samičky • se liší v pohlavních • chromosomech • •samečci XY • •samičky XX Vývoj drosofily •srovnání larvální • a adultní segmentace •plán těla zahrnuje hlavovou oblast, • hrudní články • a zadečkové •prothorax (T1) má jen nohy •mesothorax (T2) má nohy a křídla •metathorax (T3) má nohy a kyvadélka Developmental Biology 3230 geny maternální velkých mezer párového pravidla polarity segmentů Indiduální vývin octomilky je kaskádou řízenou maternálními a zygotickými geny fúzí parentálních gamet vzniká diploidní zygota 9 cyklů dělení jader vytváří mnohojaderné cyncytium jádra migrují k povrchu vajíčka – jaderný blastoderm jádra migrují k povrchu vajíčka – jaderný blastoderm pólové buňky tvoří posteriorní pól 4 další cykly dělení jader u buněčného povrchu zárodečné buňky tvorba jednobuněčné vrstvy – buněčný blastoderm Krok 1: Oplozené vajíčko obsahuje dvě haploidní (n) jádra, jedno od samečka a jedno od samičky. Krok 2: Obě haploidní jádra se jednou rozdělí a výsledná samčí a samičí jádra fúzují za vzniku dvou diploidních (2n) zygotických jader. Krok 3: Zygotická jádra se rychle dělí a vytvářejí jedinou buňku (syncytium) a mnoha jádry. Krok 4: Po devíti jaderných děleních migrují jádra do periferie syncytia a vytvářejí syncytiální blastoderm. Na periferii vajíčka se jádra ještě čtyřikrát rozdělí. Několik jader migruje do pólové cytoplazmy, kde vytvoří pólové buňky, základy zárodečné linie dospělce. Krok 5: Kolem jader se vytvářejí buněčné membrány a vzniká buněčný blastoderm, složený z přibližně 4000 buněk. Časný embryonální vývoj octomilky Specifikace hlavní tělní osy •anterior-posteriorní polarita • •geny s maternálním účinkem •geny velkých mezer •geny párového pravidla •geny polarity segmentů •homeotické geney A P Fig 20-6 Geny s maternálním účinkem zygotické geny anteriorní posteriorní terminální velkých mezer párového pravidla polarity segmentů homeotické Embrya drosofily mají anteriorně-posteriorní a dorzo-ventrální osy, které jsou založeny prezygoticky maternálními genovými produkty. Výživové buňky mateřského folikulu normální vývoj abnormální vývoj Dědičnost genů s maternálním účinkem Distribuce maternální mRNA genu bicoid ve vajíčku a proteinu bicoid po fertilizaci 0,1 mm jedna kopie genu bicoid šest kopií genu bicoid anterior - posterior anterior - posterior koncentrace bicoid koncentrace bicoid prahová hodnota prahová hodnota Hladina maternálního proteinu bicoid řídí expresi zygotického genu hunchback zvýšený počet funkčních maternálních kopií genu bicoid vede ke zvýšení koncentrace proteinu ve vajíčku i rozšíření účinku směrem k posterioru A P vajíčko wt normální larva mutant vajíčko mutantní larva bicoid bicoid vajíčko wt vajíčko bicoid částečný anteriorní vývoj vajíčko wt vajíčko bicoid protein bicoid protein bicoid články hlava články hrudi hrudi Úloha produktu maternálního genu bicoid rozhoduje o tvorbě anteriorních struktur embrya drosofily Transplantace pólové cytoplasmy může indukovat tvorbu zárodečné linie … primordiální zárodečné buňky jsou prvními odlišnými, na posteriorním konci … u drosofily, hlístice (granule P) a žab ink ellow ellow reen cytoplasma posterioru oplozeného vajíčka přenesena do anterioru jiného anteriorní buňky (s pólovou plasmou) přeneseny do jiného posterioru moucha G vytváří zárodečné buňky s genotypem G a Y migrace do gonád syncycium celularizace hunchback nanos hunchback nanos anterior posterior anterior posterior distribuce maternální mRNA distribuce proteinu Maternální podstata A – P gradientu proteinu hunchback - po fertilizaci je nanos mRNA translatována a protein brání translaci hunchback mRNA v posterioru Gradient maternální bicoid RNA v oocytu drosofily spouští transkripci zygotického genu velkých mezer Exprese zygotického genu hunchback je řízena maternálním proteinem bicoid chimérický reportérový gen hunchback normální promotor „částečný“ promotor delece promotoru promotor genu hunchback má vazebné místo k proteinu bicoid řez syncytiálním blastodermem žloutková cytoplasma D D V V V protein Dorsal v cytoplasmě jádra receptorový protein Toll je aktivován ventrálně koncentrace proteinu Dorsal v jádrech protein Dorsal v jádře aktivace receptoru Toll na ventrální straně maternálně získaným ligandem receptorový protein Toll ligand ( Spaetzle ) Dorso-ventrální orientace embrya je určována maternálním faktorem kaskáda vede od ventrální posttranslační úpravy maternálního proteinu Spaetzle uloženého v membráně membrána SPAETZLE TOLL DORSAL Geny s maternálním účinkem •translace mRNA bicoid a nanos po fertilizaci •gradient proteinu Bicoid aktivuje více transkripci genu hunchback v anterioru •současně protein Bicoid inhibuje translaci caudal mRNA •gradient proteinu Nanos v posterioru inhibuje translaci mRNA Hunchback, zatímco protein Caudal se tvoří v posterioru •proteiny Bicoid a Hunchback aktivují geny odpovědné za specifikaci anteriorní části těla •protein Caudal aktivuje geny odpovědné za posteriorní vývin •nesegmentované anteriorní a posteriorní póly jsou regulovány aktivací proteinu Torso v anterior- a posterior-pólech Determinace anterio-posteriorní osy octomilky maternálně poskytovanými RNA. Tyto RNA pocházejí z genů hunchback, caudal, bicoid a nanos. Krok 1: Hunchback a caudal RNA jsou uniformně distribuovány v celém oocytu. Krok 2: Bicoid a nanos RNA se akumulují na opačných koncích oocytu – bicoid RNA na anteriorním a nanos na posteriorním. Krok 3: Bicoid a nanos RNA jsou v embryu translatovány lokálně. Výsledné proteiny difundují a vytvářejí gradienty, bicoid protein je koncentrován v anteriorní oblasti a nanos protein v posteriorní oblasti. Krok 4: Protein bicoid brání translaci RNA caudal v anterioru embrya; protein nanos brání translaci RNA hunchback v posterioru. Krok 5: Hunchback RNA je translatován v protein v anteriorní části embrya; caudal RNA je translatován v protein v posteriorní části. Krok 6: Hunchback (a bicoid) proteiny působí jako transkripční faktory, které regulují funkci genů k diferenciaci anteriorní části embrya; protein caudal působí jako transkripční faktor, který reguluje geny k diferenciaci posteriorní části embrya. Diferenciace dorzo-ventrální osy embrya octomilky. Příčný řez ukazuje interakci mezi membránovým receptorovým proteinem Toll a proteinem spaetzle, která indukuje diferenciaci podél dorzo-ventrální osy. Ke tvorbě interagujícího polypeptidu dochází v prostoru mezi plazmatickou membránou a žloutkovou membránou na ventrální straně embrya. Krok 1: Receptorový protein Toll je uniformně distribuován na povrchu plazmatické membrány embrya. Protein spaetzle se nachází v prostoru mezi žloutkovou a plazmatickou membránou. Krok 2: Proteáza easter štěpí protein spaetzle a vytváří tak aktivní polypetid spaetzle. Krok 3: Aktivní polypeptid spaetzle interaguje s receptorovým proteinem Toll. Krok 4: Aktivní polypeptidový komplex Toll/spaetzle vpouští protein dorsal do jader (indikováno oranžově) na ventrální straně embrya (tmavočerveně). Vývojová kaskáda tvorby tělního plánu drosofily SEGMENTAČNÍ GENY : - geny velkých mezer - geny párového účinku - geny orientace tělních článků Pair-Rule Gene - an overview | ScienceDirect Topics Geny velkých mezer (gap genes) •gradienty maternálních trans- kripčních faktorů Bicoid, Caudal a Hunchback regulují transcripci genů „gap“ •vysoká hladina proteinu Hunchback indukuje expresi • genů Giant, zatímco inhibuje transkripci Knirps •transkript Kruppel se objeví v oblasti, kde klesá Hunchback •exprese genů Giant je také regulována posteriorně produktem genu Caudal 0,1 mm Geny párového účinku - parasegmenty (před celularizací) jsou určovány expresí „sudě-skákajících“ a „liše-skákajích“ párových genů even-skipped fushi tarazu Segmentační geny (zygotické) • vývojové určení buněk nastává ve dvou stádiích : •specifikace – osud buňky je určován vnějšími vlivy, • specifikace buněčného osudu je flexibilní a může být měněna signály z jiných buněk •determinace – buňka se nakonec podrobuje přechodu (transition) z „volného určení“ (loose commitment) na „konečný osud“ (fixed determination) •tranzice ze specifikace na determinaci je u drozofily zprostředkována segmentačními geny •tyto geny dělí embryo na opakující se sérii segmentů podél A-P osy •segmentační geny rozdělí embryo na 14 parasegmentů •Geny párového pravidla jsou exprimovány v průběhu 13. buněčného dělení, dělí embryo na 15 částí. Jeden vertikální proužek jader exprimuje „párový“ gen, další nikoli, následující opět ano. •Je známo 8 genů párového pravidla. Ne všechna jádra exprimují stejné „párové“ geny. Uvnitř každého parasegmentu každá řada jader má svůj „pattern“ exprese „párových“ genů. •„Pattern“ exprese „párových“ genů je určován distribucí produktů genů velkých mezer. fly 3.jpg 000487C4Macintosh HD ABA78158: Geny párového účinku : eve ftz eve ftz en wg en wg en wg en Časově-místní souslednost exprese segmentačních genů v embryu : geny párového účinku geny polarity segmentů eve = even skipped en = engrailed ftz = fushi tarazu wg = wingless hladiny proteinů kódované geny párového účinku A ….. P hladiny proteinů kódované geny polarity článků May | 2012 | biobabel Homeóza a homeotické geny „přední“ komplex Antennapaedia „zadní“ komplex Bithorax Expresní domény homeotických genů podél předozadní osy embrya hlava hruď zadeček Chromosomální lokalizace homeotických genů Homeóza je … Homeotická mutace je … Homeotický gen je … Homeobox je … Homeodoména je … Edward Lewis (1963) : pravidlo spacio-temporální kolinearity HOMEOTICKÉ GENY - jeden z klíčů specifikace embryo dospělec moucha myš Antennapedia Bithorax komplex komplex (anterior) (posterior) BITHORAX specifikuje třetí článek hrudi a zadeček: při ztrátě funkce – místo kyvadélek se tvoří druhý pár křídel ( more anterior phenotype ) Homeotické geny řídí anteriorně - posteriorní specifikaci těla : WT ztráta funkce genu C - „více anteriorní“ fenotyp ektopická exprese genu B – „více posteriorní“ fenotyp standardní typ mutant bithorax T2 T2 T3 T3 křídlo kyvadélko A P transformace anterioru úplná transformace A P Homeotická transformace kyvadélek mutacemi komplexu bithorax mutace bithorax mění anteriorní kompartment haltery ve tvar polo-křídla mutace bithorax + postbithorax působí aditivně a vytvářejí dokonalé křídlo - dva páry křídel, atavismus ANTENNAPEDIA specifikuje mesothorax (T2): jeho ektopická „dominantní“ exprese vyvolává tvorbu nohou na hlavě ( more posterior phenotype ) Antennapedia wt mutant zadeček hruď hlava Bithorax Evoluce homeotických (selektorových) genů •vysoký stupeň podobnosti mezi geny skupin Antennapedia a Bithorax, duplikace •všechny obsahují homeobox, 180 bp •kódují 60-amino-kyselinovou homeodoménu, která se váže k DNA •příbuzné geny nalezeny i u všech jiných živočichů, člověka i rostlin Hox genes and kidney development | Pediatric Nephrology gen Antennapedia protein Antennapedia homeodoména homeobox Strukturní organizace genu Antennapedia a jím kódovaného proteinu - vysoce konzervativní je zejména homeodoména, u všech eukaryot - homeobox má 180 nukleotidů, lokalizován v exonu 8 - homeodoména se nachází u karboxyterminálního konce moucha myš žába Model vazby homeodomény (transkripčního faktoru) na úsek DNA (obvykle promotor) I, II, III – alfa-šroubovice 1 – 60 aminokyseliny Kaskáda genové exprese vedoucí k segmentaci embrya octomilky Krok 1: Počáteční anterio-posteriorní polarita embrya je založena produkty genů s maternálním účinkem, jako jsou bicoid či nanos. Krok 2: Exprese genů velkých mezer rozdělí embryo do širokých zón. Krok 3: Geny párového pravidla, jako například fushi tarazu na tomto obrázku, jsou exprimovány v sedmi pruzích, dále dělící embryo podél anterio-posteriorní osy. Krok 4: Geny polarity segmentů, jako engrailed na tomto obrázku, jsou exprimovány ve 14 uzkých proužcích podél anterior-posteriorní osy. Krok 5: Homeotické geny, jako je například Ultrabithorax (na obrázku oranžově), jsou exprimovány ve specifických oblastech podél anterio-posteriorní osy. Tyto geny, společně s geny párového pravidla a polarity segmentů, determinují identity jednotlivých tělních článků ve vyvíjejícím se embryu. Proteiny POLYCOMB a TRITHORAX - klíčové regulátory struktury chromatinu a exprese (homeotických) genů Polycomb and Trithorax Group Proteins Mediate the Function of a Chromatin Insulator - ScienceDirect Polycomb and Trithorax Group Proteins Mediate the Function of a Chromatin Insulator - ScienceDirect Polycomb and Trithorax Group Proteins Mediate the Function of a Chromatin Insulator - ScienceDirect Model buněčné paměti: zárodečné terčky larva metamorfóza dospělec proximal distal jednotlivé vrstvy terčku mají odlišný vývojový i regenerační potenciál coxa femur tibia tarsal Vývojová mapa nožního terčku drosofily regenerace duplikace rovina řezu regenerace duplikace Imaginální terčky obsahují gradient vývojových schopností klesající od centra A směrem k periferii B Sériové transplantace (přenosy) buněk imaginálního terčku jako testovací systém ke studiu vývojového osudu a determinace larva extirpace a rozdělení genitálního terčku test determinace test determinace testy determinace sériové extirpace, rozdělení terčku a přenosy do dospělců Determinace demonstrována kultivací zárodečných terčků larva terček metamorfóza část terčku přenesena do abdominální dutiny zbytek terčku přenesen do jiné larvy struktury těla dospělce se vyvíjejí z terčků buňky terčku proliferují uvnitř těla, sériové transplantace vzorek terčku implantován do jiné larvy stejné struktury těla jako z původního terčku TRANSDETERMINACE je unikátním případem ztráty buněčné (vývojové) paměti vlivem mnohočetného (ektopického) přenosu zárodečného terčku možné případy změn : křídla genitál tykadla oči kyvadélka hruď ústní ústroje nohy Gen eyeless •Mutantní mušky nevytvářejí oči. • •Wild-type gen eyeless kóduje homeodoménový transcripční faktor, který aktivuje dráhu zahrnující tisíce genů. pol2e_ch14 Eyeless : homolog myšího genu Pax je odpovědný za tvorbu oka – monofyletický původ složených očí hmyzu a jednoduchého oka savců tvorba ektopických očí u transgenní mouchy Drosophila.Gehring.jpg 00000010 Ovum Novum ABA78158: Savčí homology genu eyeless •Myší homolog genu eyeless, Pax6, pokud je přenesen do octomilky, vytváří přídatné oči. • •U myši vedou mutace homologa genu eyeless k reduci velikosti očí. • •Mutace homologního genu u člověka způsobují aniridii (chybění duhovky). Savčí homology genu eyeless •Myší homolog genu eyeless, Pax6, pokud je přenesen do octomilky, vytváří přídatné oči. • •U myši vedou mutace homologa genu eyeless k reduci velikosti očí. • •Mutace homologního genu u člověka způsobují aniridii (chybění duhovky). Drosofila nemá pohlavní hormony: bilaterální gyandromorfie FG09_014 samčí XO část: bílé oko, miniaturní křídlo samičí XX část: heterozygotní pro oba markery (ztráta jednoho chromosomu X-wt při prvním mitotickém dělení) Drosophila: poziční efekt (PEV) PEV efekt : Lokus white je standardně umístěn v euchromatinu, po inverzi pouze 25kb od pericentromerického heterochromatinu (Muller 1930), odtud se šíří restrukturace a umlčování euchromatinu. Ztráta umlčení v některých buňkách oka v procesu diferenci- ace vede k variegovanému fenotypu. euchromatin heterochromatin excize a inverze po X-ozáření U much vykazujících PEV lze izolovat sekundární mutace, které buď suprimují fenotyp (Su(var) = ztráta umlčení, či zesilují fenotyp (E(var) = zvyšují umlčování. červené oko (WT) mozaikové oko mozaikové oko červené oko (jako WT) bílé oko enhancer suppressor Účinek modifikátorů na variegaci projevu mutace white je dávkově závislý Modifikátory (~30) jsou strukturní proteiny heterochromatinu. mozaikový fenotyp se projeví, pokud jsou přítomny dvě kopie wt-modifikátorového genu přítomnost tří wt-kopií modifikátorového genu vede k rozsáhlejší heterochromatinizaci a zvýšení umlčovacího účinku (bílé oko) přítomnost pouze jediné wt-kopie modifikátorového genu vede ke snížení tvorby heterochromatinu a vyšší expresi white genu (červené oko) euchromatin hetrochromatin Přechod euchromatického stavu na heterochromatický vyžaduje sérii změn v histonových modifikacích Aktivní geny jsou značeny H3K4metyl2 a metyl3, tato značka musí být odstraněna komplexem LSD1. V euchromatinu je H3K9 acetylován, tato značka je odstraněna histon deacetylázou HDAC1. Fosforylace H3S10 může interferovat s metylací H3K9; defosforylace nastává účinkem fosfatázy směrované interakcí C-konce JIL-kinázy nukleosom Lyzin v pozici H3K9 musí být deacetylován.