u Twins med cat Mutant plant Barr body Epigenetic biology Vývojová genetika 2023 hü «. v* 1 Polytene chromosomes Blood smear Epigenetika - definice Studium dědičných mitotických (a meiotických) změn v genové expresi, která se vyskytuje beze změny v primární struktuře DNA M book Epigenetic mechanisms of gene regulation it Robert A Martienssen, Arthur D Riggs, Vincenzo Ettore Aldo Russo H Published in 1996 in Cold Spring Harbor NY) by Cold Spring Harbor laboratory • Ostatní definice nezahrnují nutně epigenetickou dědičnost mitotickým dělením GENETICS mutations inherited germ line species EPIGENETICS I alterations mod remodeler stable? soma variability Epigenetika jako „vědecký jazyk" • Termín epigenetika představuje vědní obor, studující změny v genové expresi a studující informaci nad DNA, která je nutná pro uskutečnění vývoje a bun. diferenciace Každý buněčný typ je definován aktivitou specifické sady genů, které jsou v čase a prostoru exprimovány Definice základních pojmů 1 genome stored ! mod remodeler chromatin organized S UÍM W< B \llk information ncRNAs _- i íTTTTlŤlTtTrmTTP epigenomes • Genom -veškerá genetická informace uložena v DNA (u některých virů v RNA) konkrétního jedince • Epigenom-souhrn (záznam) chemických modifikací DNA a histonů, nebo dalších proteinů (methylace, acetylace, sumoylace...), konkrétního organismu (modifikace jsou dedicne) • Epimutace - změna v chemické struktuře DNA, která nezahrnuje změnu v primární struktuře (mC, caC, fC.) Význam epigenetiky na bunečné úrovni • „c-value paradox" - velikost genomu se nezvyšuje s komplexitou a složitostí organismů • Regulace genové exprese a její realizace je uskutečňována na několika úrovních, každá buňka dostává specifickou informaci z okolí a z předchozího buněčného dělení (epigenetická dědičnost) Význam epigenetiky na buněčné úrovni Meruňka japonská < < < • Epigenetická dědičnost zajišťuje: • Expresi stejných genů v dceřiných buňkách • Tkáňovou homogenitu < < Taylo Absence epigenetické dědičnosti tkáňová heterogenita (exprese různých genů, tkáňová chiméra-nezaměňovat s genetickou chimérou) Rozdílnost jednobuněčných dvojčat -mechanismus? • Jednobuněčná dvojčata vznikají během ranného vývoje embrya (jeho rozdělením), jsou tvořeny tedy stejným genetickým materiálem (spermie i vajíčko) • Často rozdíly ve vzhledu a vlastnostech (např. 30% výšky) • Jak? Genotyp x Fenotyp? • Proč? Prostředí? • Conrad Waddington, 1942 - epigenetika (asimilace, krajinný model), vznik fenotypu(ů) na základě jednoho genotypu • Robin Holliday, 1990 - časová a prostorová kontrola genové aktivity během vývoje komplexního organismu enetika jako „vědecký jazyk" HUMAN EMBRYO AND FETAL DEVELOPMENT Ľ > DNA GENOVA EXPRESE > RNA i > protein NEURON Hemoglobin Dopamin + Myoglobin - o o ČERVENE KRVINKY Hemoglobin + Dopamin -Myoglobin - SVALOVÉ BUŇKY y~s^»^> Hemoglobin -^—^ <^^> Dopamin - Myoglobin + Epigenetika jako „vědecký jazyk" HUMAN EMBRYO AND FETAL DEVELOPMENT C > DNA GENOVÁ EXPRESE > RNA i > protein • Aktivita specifických transkripčních faktorů • Epigenetické modifikace na úrovni DNA a histonů Čeština využívá 42 písmen (26 latinka), epigenetika v přeneseném slova smyslu funguje stejným principem jako znaménka a formátování textu. Epigenetika jako „vědecký jazyk" a znaménka v cestine? Epigentickemodifikacemohoubytpovazovanyzaznamenkaneboznackyvg enomuaneznalostvyznamutohotojazykajevyzvyvajiciprovsechynzacinaji civedce • Epigenetický kód slouží jako: • Formátování/styl textu (=aktivita nebo represe genu) • definuje mezery mezi slovy (=vyznačuje začátek nebo konec genu) • Definuje znaménka a tedy i význam slov (=jak a kdy mají být geny čteny) • Definuje kapitoly a odstavce (=struktura chromatinu a potažmo celého chromozomu) JNEURON SVALOVÉ BUŇKY Hemoglobin = epigenetický umlčen /-^^^ Hemoglobin = epigenetický umlčen Dopamin = epigenetický aktivní ^—^ <^^>- Dopamin = epigenetický inaktivní Myoglobin =epigeneticky umlčen Myoglobin = epigenetický aktivní Epigenetická informace jako „epigenetický" krajinný model Geno specifi Modely ke studiu epigenetických jevů Umlčení X chromozomů mammals Poziční efekt (PEV) Polycomb Drosophila Epigenetická regulace zárodečné linie C. elegans I Imprinting Paramutace TE genové umlčování S.cerevisiae Epigenetická kontrola chromatinu f ^\ S.pombe Genové umlčování epigenetic model organisms Neurospora Epigenetické obranné mechanismy Meiotické umlčování RNAi DNA a histonová methylace Chromatin v somatických a Tetrahymena generativních buňkách RNAi DNA a histonové epigenetické regulace maize Arabidopsis EPIGENETICKE JEVY PŘEDSTAVUJI VÝJIMKY Z M EN DELOVÝCH ZÁKONŮ Samostatnost alel. Genotyp je soubor samostatných genů určujících znaky. Každý je znak je určen dvojicí samostatných alel. Segregace alel. Princip NEZÁVISLÉ SEGREGACE ALEL : dvojice samostatných alel se při meióze rozcházejí a každá gameta dostává jednu z obou alel Nezávislá kombinace alel. (s výjimkou alel ve vazbě) IDENTITA RECIPROKÝCH KŘÍŽENÍ, (při vzájemném křížení homozygotních rodičů (P) vzniká první filiální generace (Fl) potomků, kteří jsou genotypově i fenotypově jednotní. Zákon o štěpení v potomstvu hybridů. EPIGENETICKÉ JEVY PŘEDSTAVUJÍ VÝJIMKY Z M EN DELOVÝCH ZÁKONŮ Alely se mohou podrobovat vzájemným interakcím, které mají za následek dědičnou změnu jejich exprese : PARA MUTACE, TRANSVEKCE Některé genomy, chromosomy či lokusy jsou v průběhu gametogeneze sex-specificky reverzibilně modifikovány, což vede k jejich umlčení ve filiální generaci : PARENTÁLNÍ IMPRINTING Para mutace a její funkce Paramutabilní alela - alela, která je exprimována paramutable paramutagenic (1) Paramutagenní alela -umlčená alela, která je schopna ovlivnit (umlčet) druhou alelu Paramutace a její demonstrace u různých modelových organismů Akumulace anthocyaninu v obilce kukuřice v případě rl lokusu (paramutabilní R-r a paramutagenní R-st) nebo v případě celé rostliny lokusu bl (paramutabilní B-l a paramutagenní B') R-st/R-st I R-r/R-r I I li r/r R-st/r R-r*/r X Ki,lml,\lf/+ I +/+ puramutalion Kiťm,A'f/+ Kil* (+/+) B Spontaneously ^Jg ->T, (0.1-10%) ^J^- * ~JL. B-l B' \ B-l B/B- B-l B VB'* Kil* X +/+ sulf/sulf sector +A«// plant Kit lokus (tyrosine kináza receptor) - paramutabilní + a paramutegenní KittmlAlf Sulf lokus způsobující nedostatek chlorofylu (paramutabilní + a paramutagenní sulf) Pilu 2011 Transvekce - funkce a definice • Edward Butts Lewis • získal Nobelovu cena 1995 za práci na modelu Drosophila a objevení transvekce na bithorax komplexu "Operationally, transvection is occurring if the phenotype of a given genotype can be altered solely by disruption of somatic (or meiotic) pairing. Such disruption can generally be accomplished by introduction of a heterozygous rearrangement that disrupts pairing in the relevant region but has no position effect of its own on the phenotype" • Popsána u lidí, myší, rostlin, nematod, hmyzu a hub Viets et al. 2019 Transvekce - molekulární mechanismus Step 1: Pairing Physical proximity Constitutive pairing Cell-type-specific pairing Strong vs. weak pairing cell types Cell type 1 Cell type 2 Button regions drive homologous chromosome pairing in Drosophila insulator ^^luster TADs and insulators are associated with buttons Strong pairing cell type Weak pairing cell type Transgene: 1 button Chromosome: i Many buttons t PAIRING NO PAIRING PAIRING PAIRING Viets et al. 2019 Regulace genové exprese epigenetickými mechanismy DNA methylace RNA intprfprpnrp Methylace DNA • CH3 skupiny jsou umístěny na velké jamce dsDNA • Proteiny jako transkripční faktory, které se mohou vázat na DNA mají často kontakt právě ve velké jamce DNA Prokhortchouk a Defossez 2008 Mechanismus DNA methylace - de novo methylace a udrzovaci methylace cytos ine DNA Methyltransferase (ÖNMTs) SAM SAH ISJH2 ^ o N I Methyl cytos ine t 0 N CH3 5-methylcytosine Glycosylase Lyase (öemethylase) SAM: S Adenosyl methionine SAH: S Adenosyl Homocysteine TTCGCCGA TAA A .ob NO o -0 0 M A sä DNA replication u IT1 G G C ^-In if3 DNA G melhylation Hemimethylated template DNA replication [ G I_ G =0= - G G ■■ nJl— -IL, TT G "TT3 G DNA melhylation Active siRNA ,=jp' or chromatin (2 signal G * G G Chen et al. 2005 De novo methylace, u zivocichü DNMT3a Udrzovaci methylace, DNMT1 Přímý vztah mezi metabolismem a DNA methylací (metabolom x epigenom) Eíasti-a Kyselina listová Acidum folicum Pro zdfavý průběh téhotcnstvi S.10CH, THF NADP' KADPH NATXH) MctSo NAO(P)M ROS.NO sam ^ u,^r^r^ mmy* mo -^HKMT * u, SAH \ X * f • SAM je prekurzor všech epigenetických modifikací vyžadující methylovou skupinu • DNA methylace • Methylace lysinových residuí • Methylace argininových residuí SAM cyklus - cyklus produkující, „konzumující" a regenerující SAM molekuly Folátový cyklus - produkce vitamínu B, regenerace DNA a genetického materiálu Důkaz vztahu mezi DNA methylací a metabolismem - Agouti variable methylation region Agouti gene |- female yellow mouse (agouti gene unmethylated and active) diet supplement during pregnancy and nursing with additional methyl groups methylated agouti mftNA briefly mad* during development agouti 9*0» a . . producing ir KNA egoutigene remainder 0*movieMe. eoouthemousefeeipan. heeWiy mouse with brown hr mouse with yelow fur. develops obatity and diabetes during ad Jlhood Offspring mostly brown and healthy; agouti gene methylated and silenced Offipring mostly yellow and unhealthy; agouti gene unmethylated and active Rozdíly DNA methylace koreluje se strukturou genomů a jejich velikostí a Mouk DNA methylation (fungi for example. Neurospora crassa) b Mosaic DNA methylation (plants, for example. Arabidopsis tMiono) C Mosaic DNA methylation (animals, for example. Gono mteitmola) d Global DNA methylation (animals, for example. Horno ioperis) • Global DNA methylation (plants, for example. Zca mays) Množství repetic Genomově specifická methylace (např. X inaktivace) 999999 9 CpC island CH i- gene íntergenk region repetitive [íltwi.nt CpG ostrůvky - většinou nemethylovány (u rostlin v malé míře) Mezigenové oblasti - většinou methylovány Repetitivní oblasti - většinou methylovány Rozdíly DNA methylace koreluje se strukturou enomů a jejich velikostí LT) C\l O m O LT) fN LT) 100 80 60 40 ' 20 0 Arabidopsisthaliana Danio rerio Arabidopsis thaliana O o LT) o LT) LT) upstream ^^enej downstream 100 90 ,-^ 80 70 GO 1 50 upstream 1 repeat 1 downstream a; CD 100 so 60 40 70 0 Populustrichocarpa Populus tricbocarpa Mus musculus Mus musculus upstream | ^^enej downstream - upstream ^^peaj downstream Feng et al. 2010 Rozdíly DNA methylace koreluje se strukturou genomů a jejich velikostí, ale existují i druhově-specifické rozdíly! • Včela medonosná má 5 - 8% TEs v genomu, s relativně větším počtem LIR bez protein-kódujících sekvencí (přesto tyto LIR jsou stále zachovalé), podobně i Chlamydomonas obsahuje pouze 15 - 20% TEs v celém genomu • Včela rovněž má i nižší procento genů s imunitní odpovědí, které jsou naopak kompenzovány velmi uspořádaným sociálním životem a hierarchií Coelomata Chordata EuteleQstomi Viridiplantae Magnoliophyta Rosids CG CHG CHH Apis meíiifera 0.93% 0.26% 0.17% C tona intestinalis 31.1% 0.17% 0.12% Mus musculus 74.2% 0.30% 0.29% Danio rerio 80.3% 1.22% 0.91% Chlamydomonas reinhardtii 5.38% 2.59% 2.49% Oryza sativa 59.4% 20.7% 2.18% Arabidopsis thaiiana 22.3% 5.92% 1.51% Popuius trichocarpa 41.9% 20.9% 3.25% Feng et al. 2010 DNA methylace se I is f mezi geny a transpozony (H = T. A or C) Arabidopsis leaves 5' CHG 3' GHC^ T 5' CHH 3' 3' GHH 5' @ Transposable elements and repeats 100 Je so 60 40 20 Chromosome 2 CG CHG CHH $ Q t centromere 10 15 Mb Adapted from Cokus et al . Nature 20O8 Rozdíly DNA methylace koreluje se strukturou genomů a jejich velikostí, u rostlin však odpovídá i množství TEs ■ Genomic landscapes in plants ISOOOMb Trén«pui itilir «4»»»rnt« • •« comiimwI by MlKfton M0MM G«n« number remains constant in plants .v.omii I HiMti 2SH II* AfjbtdopUt Sorghum Iff Umlčení repetic = stabilita genomu a potlačení škodlivých inzercí human maize arabidopsis 33 TEs : 45% : 85% 17% TES Ratrotransposons DNA transposons Non transposora [ • S větší procentem repetitivní DNA roste úměrně množství inaktivního chromatinu (dříve fakultativní heterochromatin) a tím se mění i chromozomální distribuce epigenetických značek gbM kontroverze a vliv na genovou expresi Negative Positive gbM je hypotetický pozitivní regulátor genové exprese = pokud není methylace rozmístěna mezi promotory a cis-regulačními oblastmi • Může regulovat pre-mRNA splicing • Ovlivňuje pool aberantní mRNA • Může chránit geny před TE inzercí Muyle et al. 2022 Unmethylated gene (a) >■ - r < 1 ■z. \ cc JZ £ 00 (c) Species 1 Species 2 Species 3 p (d) Abefranl TSS TSS Aberrant TTS TTS c O < Aberrant antisense TSS Normal pre-mRNA 1 Aberr rpre-ml Aberrant iRNA (e) TSS I 5 UTR Exon 1 i-, 3'UTR Exon 2 I— Gene — i/l O. & l/l >" Normal mRNA Aberrant mRNA ' Exon 1 Exon 2 Exon 1 Retained Exon 2 . intron = o (f) O) c INJ C w — OJ ,<1) Deleterious TE insertion Gene body methylated gene TS5 juvvuv CG methylation TTT TTT TT TT T T ♦ TT f T TT n Species 2 I T M AfW Species 3 T f T TM TT M T » M» TT M T « -j— Gene Normal pre-mRNA I Inuon "b 5 UTR ,t TM *iMTMMT* TM T 3' UTR I -1- Exon 1 "TT ■ TTT Exon 2 '- | Gene Exon 1 Exon 2 ,T TTT T........T TTT T ^ Exonl ""*" *'* Exon 2 \ Specifita DNA methyltransferáz - divergence rostlin a živočichů Plant DRM2 Mouse DIMMT3B Plant MET1 Mouse DIMMT1 [ DMAP Binding Plant DNMT2 Mouse DNMT2 CMTS (pi ant-specific) ■ UBA2 III V ii mum.....ii UBA1 UBA3 VI IX X I II IV III V X DDD0DEZZH1 P'vVVVP C-RICH III IV VI IX If.V- BAH ZF BAH BAH BAH N-terminal domains HR IV VI VIII JTWTT J mír i Melhyllransferase dtimain Chen et al. 2005 • DOMAINS REARRANGED METHYL TRANSFERASE (DRM) -methylace CHH • METHYLTRANSFERASE 1 (MET)-methylace CG • CHROMOMETHYLASE (CMT) - methylace CG • DNA methyl transferase (DNMT) - methylace CG(?) =Specifická pouze pro rostliny Evoluce DNA methyltransferáz u rostlin a V • V • I o živočichu DNMT1MET1 I # * 1 I Ji. M > |t ^ ^* CMt ■ :.mi.' ■/ RlD 4r 4r * Animals Mostly CG Plants CG, CHG, CHH Eukaryotes □ TE Methylation (CG) □ TE Methylation (CG, CHG; CHH) □ Gene Body Methylation (CG) Ueda 2020 Evoluce a divergence DNA methyláz u rostlin • Komplexita 5mC regulace a exprese se liší mezi vyššími a nižšími rostlinami • Ztráta DNMT3 a duplikace CMT a DRM genů pro CG methylaci až u vyšších rostlin Zelené řasy Mechorosty Plavuně Kapraďorosty Nahosemenné Krytosemenné k Green Algae Bryophytes Lycophytes Monilophytes Gymnosperms Angiosperms Yaari etal. 2019 Proč je DNA methylace dědičná? • DNA methylace je dědičná, protože DNMT1 rozpoznává hemi-methylovanou DNA na obou řetězcích • TET enzymy jsou specificky demethylovány pouze během specifického období během vývoje X inaktivace jako příklad mitotické dědičnosti DNA methylace • X inaktivace je epigenetický mechanismus dávkové kompenzace u savců (samci a i samice mají stejnou dávku genové exprese X chromozomu) • Během vývoje dochází k náhodné X inaktivaci v období gastrulace v embryu, tento jev je posléze předáván do dceřiných buněk The Walter and Elizabeth Hall Institute of Medical Research DNA demethylace aktivní vs. pasivní cesta (TET - methylcytosin dioxygenáza) Pasivní DNA demethylace Rozvolnění „hustoty" methylace s každým buněčným dělením (nizká aktivita DNMT1) Aktivní DNA demethylace -C-C vazba je velmi silná, odstranění přes intermediáty, používající různé systémy (TET enzymy - rodina 10 enzymů) Především ve vyvíjejících se embryích a zárodečných buňkách, rakovinné buňky, mozkové buňky 5hmC 5fC(->BER) 5caC(->BER) U rostlin MEDEA, ROSÍ (TET orthology prozatím neposány, ALE! Modifikace se v genomu vyskytují-jiné enzymatické dráhy?) Reduced TET enzyme processivily Oxi-mC -facilitated passive DNA dcmcthylation f NH, DNMT TET OH NH2 TET N O Fa(ll), 2QG, Ož N O Fe(ll). 20G, Oj TET N N O Ffl(ll). 2OG, Oj HO' NH2 N N^O sugur sugar sugar sugar sugar Cytokine SmC 5hmC 1 5fC 1 5caC Hydroxylace oxidace oxidace TDG \ / TDG B ER-me dialed active DNA de methylation OH I sugar BER - „base excision repeair" TDG - ^thymine DNA glycosylase" AID - ^activation induced deaminase" nebo APOBEC (5mC -> T+thymine glycosylase MB4 -> BER) Abasie sile An et al. 2017 Udržení genomové integrity • Dnmtl linie vykazují vysokou genomovou instabilitu • Umlčení nejenom repetitivních elementů, ale i kryptických promotorů a alternativních míst sestřihu • Mutace v místě repetic (meC = T) jako prevence transpozice • Umlčení repetic a jejich transkripční interference • Potlačení ilegitimní rekombinace normal karyotypg abnormal karyotypg due to genomic instability Deletions Insertions Reciprocal translocations Ér. "ü gag protein - Ctural pnjtelni 0 LTR lofig lermirwi repeat pol protein -neuer« _A trsn}crlptiierliitegrafie.prü™ie 7 I? T*P -H- LTR „Genome defence model" - DNA methylace je mutagenní, proto musí mít pozitivní vliv na stabilitu (prof. Timothy Bestro) gbM slouží jako evoluční klíčový element a rr relativně silný adaptivní potenciál Mettiylakiori Gene switched "ON' Gen e switc hed ''O FF" o Rate of change per generation SNPs ~io-9 Gene duplication -in-6 Genie CG methylation ~10"3 - io-4 slower Original sequence Adaptive potential Genetic adaptation via changes in DNA sequence ..... " ■ Point mutation Genetic adaptation via changes in gene copy number Epigenetic adaptation via shift in gbM allelic state Genie CHG or CHH methylation 99 faster Epigenetic acclimation or short-term adaptation via environmental orTE-induced shift in CHG or CHH methylation Muyle et al. 2022 Úloha DNA methylace ve významných procesech a rozdílná úloha v podobných orgánech u rostlin (a) Methylation Demethylation Balanced before ripening je o) c i. [f I \ I \ (b) Tomato # Methylation Demethylation ^^^^ DML2 upregulated Whole-genome hypomethylation (c) Strawberry Methylation Demethylation RdDM downregulated Whole-genome hypomethylation (d) Sweet orange Methylation Demethylation Demethylase downregulated Whole-genome hypermethylation Tang et al. 2020 Regulace genové exprese epigenetickými mechanismy DNA methylace RNA interference Histonové modifikace RNAi 11 n 11 ni .....o m Výskyt a diverzita malých RNA protein-coding RNA 2% non-coding RNA 98% Housekeeping ncRNAs tRNAs 50-200nt rRNAs snRNAs 50-200nt ncRNAs snoRNAs 50-200nt Regulatory ncRNAs miRNAs 20-24nt " 21-22- I piRNAs 24-32nt (absent in plants^ siRNAs 20-24nt IncRNAs >200nt Figure 1. Classification of non-Coding RNAs (ncRNAs). Housekeeping; ikRXAs include; tRNAs-transfer RNAs, snRNAs-small nuclear RNAs, rRNAs-rilx»omal RNAs, snoRNAs-small nucleolar RN'Av The regulatory ncRNAs M>n^ist ol miKNAs-microKXAs, siKXAx-short interfering RXW, piRNAs-pivvi-interacting RNAs, and IncRNAs-long non-coding RNAs. Waititu et al. 2020 Klíčové momenty RNAi a genového umlčování • Prekurzor - dsRNA • Štěpení proteinovým komplexem DICER nebo DICER-like • Sestavení RISC komplexu, vazba sRNA ARGONAUTE proteiny • Vazba RISC na základě homologie • Umlčení Repeat-associated transcripts (centromeres, transposons) Viral RNAs Hairpin RNAs Environmentally, experimentally, or clinically introduced dsRNAs Convergent transcripts and other sense-antisense pairs Gene/pseudogene duplexes Transgene transcripts Tasi RNAs Ago RISC • siRNA amplification ' by RdRP Gene silencing RISC komplex • PAZ • PIWI • AGO • sRNA slicer active site Carthew, Sontheimer 2009 Původ a rozdíl siRNA vs. miRNA • siRNA • Deriváty nezávislé na genomu (obsaženy vzácně)-mRNA, transponovatelné elementy, viry • Vznik z dlouhých molekul RNA a jejich prodloužených sekund. RNA struktur • Nespecifická produkce siRNA molekul (nespecifický prekurzor) • Konzervativní oblasti poměrně vzácné, siRNA „auto-silecing" efekt • miRNA • Deriváty genomické RNA (obsaženy v genomu) • Vznik z lokálních transkribovaných sekund. RNA struktur (vlásenka) • Syntéza miRNA:miRNA duplexů • Konzervativní genové oblasti příbuzných organismů • miRNA „hetero-silencing" efekt Biogeneze miRNA • Autonomní miRNA zahrnují ve svých produktech elementy potřebné pro regulaci a iniciaci transkripce • Ostatní miRNA jsou závislé na svých pri-mRNA, u kterých probíhá „parazitický" proces • Syntézy nových krátkých úseků katalyzovány RNA polymerázou II a III • Většina miRNA katalyzovaných pol RNA II a rovněž většina živočišných miRNA nemá typický signál pro polyadenylaci Základní rozdíl syntézy miRNA u rostlin a živočichů miRNA gene ^toiiiiniiii^H..............i >\Uj. /ť^ Pri-miRNA 101........" . juhmi iii ...... ni"i'p Pre-míRNA ii'iiiiiinn i'ir'V III M 1 'TfV Pre-miRNA miRNA:miRNA* duplex Nucleus Cytoplasm oj® liiii'iiiiiiin^S i rt •I Mature miRNA within RISC I miRNA gene .....im" fliii.....i""ii" Pri-miRNA 'llllllllll'r ľHr V-^iiiiiiimi f Pre-miRNA Nucleus Cytq IHM lllllllllll III ............'r miRNA:miRNA* duplex n Mature miRNA within RISC Target mRNAs from loci unrelated to miRNA gene Exogenous dsRNA, transposon, virus, ... Jiiiiiiiiiiiiiiiiniiihiiiiiiiiiiniiiiiiiiiiiiin/ f"......."".........'"'.............1.........y Long dsRNA ©^ Olfítt niiiiiiiiiiimiiiiii "".....1.....1.....r pi siRNA duplexes i pnnnTnTnTTf^gt*^H lllllllllililllll^JMMi^^^j^ Allllllllmllllll ^""ii".......i ^^^^^^ Mature siRNAs within RISC Bartel 2004 Diverzita funkce sRNA Živočichové A u U U G ca-ua u \ u u a C C U-G UÍ:K 1 Gi i G-C u-A u-a u-a '.. l5 AG_CC < C-G I E A-U u-G g-C -a Tc c S A-U G"u U-a G-U -U A-U G-C J°-gU UC-G C-G :í ,.C-Gu ., a G-C A-U UG-cC u-a c-g C-G G a G C - U U-a •í-í C-g 0 - Q U-a c-g C; ii-5- „ g- Si; - : :8 -°>fc Rostliny a-u u-g a-u a-u u-g g-c a-u u-a g-u a a-u Va<^ u-a a-u g-c g-c a-u g-c c-u-g a a g-c g-c s B 5 u-g 01 g-c ■ g-C g-C g-' g-C a c g-c u-a u-a c-g a a c-g A-u u-g m u-a c-g g-c a — c g < ,-c a -u <■-,-<; c-g g-c c-g c-g u-a" u-a a-u a-u c-g u-g u-a a-u g- c u- c-g c" : u-g g-c a-u g-c Bartel 2004 • Funkce v různých vývojových procesech, „micromanagement" exprese Table 2. MicroRNAs and Their Functions: Examples for which Strong Evidence for the Validity of the Regulatory Target Has Been Reported but the Phenotypic Consequences of Disrupted or Ectopic miRNA Regulation Are Not Yet Known nuRNA Target Gene(s) Biological Role of Target Gene(s) Refs Insects miR-7 Dm HLHm3 basic HLH transcriptional repressor Dm hairy basic HLH transcriptional repressor Dm m4 Brd family protein miR-14 family Dm grim antagonist of caspase inhibitor Dm reaper antagonist of caspase inhibitor Dm sickle antagonist of caspase inhibitor Mammals miR-1 Hs Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) Hs Glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PD) miR-19a Hs Ptdlns(3,4,5)P3 phosphatase (PTEN) miR-23a Hs Stromal cell-derived factor 1 (SDF-1) Hs BRN-3b POU-domain transcription factor miR-26a Hs SMAD-1 transcriptional co-modulator miR-34 Hs Deltal transmembrane protein Hs Notchl transmembrane receptor for Delta miR-101 Hs ENX-1 polycomb gene Hs N-MYC basic HLH transcription factor miR-130 Hs Macrophage colony stimulating factor-1 (MCSF) Plants miR170/171 At SCL6-III, -IV & related transcription factors miR156/157 At SPL2 & related transcription factors miR160 At ARF10. AP.F17 & related transcription factors miR167 At ARF8 & ARF6 transcription factors miR164 At CUC1, CUC2 & related transcription factors miR169 At CBF-HAP2 DNA-binding proteins miR162 At DCL1 Dicer-like RNase III Interprets Notch-mediated decisions in neuronal development 1,2 Interprets Notch-mediated decisions in neuronal development 2 Interprets Notch-mediated decisions in neuronal development 2 Promotes apoptosis 2 Promotes apoptosis 2 Promotes apoptosis 2 Growth factor; neuronal development 3 Oxidative stress resistance 3 Tumor suppressor gene 3 Growth & localization of hematopoietic progenitor cells 3 Nueronal development 3 Regulates TGF-dependent gene expression 3 Activates Notch during cell-fate decisions 3 Cell-fate decisions during development 3 Proliferation of hemotpoeitic cells and other gene regulation 3 Proto-oncogene; cell differentiation & proliferation 3 Mononuclear phagocytic lineage regulation 3 Related to genes for root radial patterning 4-7 Related to genes for floral meristem identity 6,8 Related to genes for auxin response & development 6,8 Related to genes for auxin response & development 6,8,9 Shoot apical meristem formation & organ separation 6,8 unknown 6 miRNA biogenesis 10,11 The metazoan regulatory targets listed were predicted computationally then supported experimentally. The plant regulatory targets listed were predicted computationally then supported with independent phylogenetic and/or experimental evidence. Species abbreviations: Drosophila melanoqaster, Dm; human, Hs; Arabidopsis thaliana. At. Specifikace exprese miRNA • Různé hladiny regulace genové exprese miRNA zajišťující dokonalý systém kontroly de-novo vzniklých transkripčních jednotek • Závislá na druhu buňky, momentální úlohy a vývojového stádia • Počet jednotlivých miRNA v daném stavu buňky ovlivněn mírou exprese daného lokusu a tvorby pri-/pre-mRNA (50 000 molekul miR-2, miR-52 x 800 molekul miR-124) • Vysoká x nízká úroveň exprese na počet buněk (vysoká exprese důsledkem specializace pouze několika málo buněk, nízká produkce na úrovni např. celého organismu) Molekulární mechanismus funkce RISC - dvě cesty regulace genové exprese • Na úrovni mRNA - RISC komplex a štěpení RNA nebo regulace na úrovni translace (neúplná komplementarita) • Na úrovni DNA - methylace DNA, inaktivace chromatinu Extensive complementarity in Q Short complementary segments in 3'-UTR Q Interaction with DNA coding region or UTR ______ Cap""^^^^^^^^]^^ ^£An Active chromatin Cap- Cap mRNA specifické štěpení regulace na úrovni translace An ^ Histone methylation ***** Silent chromatin vazba na DNA (methylace) Bartel 2004 Regulace genové exprese epigenetickými mechanismy DNA methylace RNA interference DNA Accessible, Gene Active Historie Tail ••■ DNA Inaccessible, Gene Inactive Historie Tail Methyl Group • Histonové modifikace Histonové modifikace Chromatin a DNA - struktura • DNA+histony (H2A, H2B, DNA H3, H4)= chromatin • Chromatin umožňuje svinutí DNA do jádra • Vyšší organizace chromatinu ovlivňuje regulaci genové exprese a přístupnost transkripčních nebo DNA reparačních N-aminokyselinový konec proteinů Vyšší organizace chromatinu Vyšší organizace chromozomu záleží kromě dalších faktorů na kontaktech Hl Struktura chromatinu ovlivňuje transckripci • Více sbalený chromatin - DNA je méně přístupná transkripčním faktorům • Volný chromatin - DNA je dostupná pro transkripční faktory = genová exprese Heterochromatin vs. euchromatin • Euchromatin - otevřený, méně kondenzovaný ^™ • Heterochromatin - kondenzovaný, nízká nebo žádná genová exprese • Fakultativní - liší se na typu buňky nebo časové organizace (X inaktivace, specifické geny aj.) • Konstitutivní - kondenzovaný chromatin ve všech buňkách • Centromery, telomery, část Y chromozomu I • Genové umlčování, udržení integrity genomu (5mC, represivní histonové modifikace) • Centromery, telomery, část Y chromozomu -> Nedostatečná nomenklatura z hlediska epigenetiky a významu jednotlivých modifikací! Synapse epigenetických modifikací a organizace chromatinu • Thomas a Christoph Cremer - 2020 „ functional nuclear organization depends on still unexplored movements of genes and regulatory sequences between ANC and INC" law ANC - aktivní jaderné komponenty INC - inaktivní jaderné komponenty Cremer et al. 2020 Vztah mezi organizací chromatinu a epigenetickými modifikacemi • 3D rekonstrukce DAPI barvených jader a intenzita ve vztahu k aktivním a represivním modifikacím Úloha histonových modifikací • Většina modifikací na N-terminálních koncích • Více než 50 AA může být modifikováno, více než jedním typem modifikace (mel/me2/me3) • Nejvíce prostudovány H3, H4, méně H2A a H2B • Kombinace umocněny kombinatoriální komplexitou = histonový kód The Walter and Elizabeth Hall Institute of Medical Research Histonové modifikace tvoří významnou část genové regulační dráhy ac ac ac ac ac ac ph me me me me me ^^WSl N ac ac ac ac ac me ac K5 K 121 ub ac Active marks Histone acetylations, H2Bub H3K4me3, H3K36me2/3 Repressive marks H3K9me2/3, H3K27me3, H3T3ph, H2Aub, symmetric H4R3 N ac K6> Druhově specifická funkce a distribuce Ueada and Seki 2020 H,C CH, I CH, Histone (lysine) methylation Lys (Km.O) V Kniel Km«2 Km»3 Decreasing hydrogen bonding capacity Increasing hydrophobic!ly H3K4me • aktivní modifikace • Promotorova oblast a exony H3K9me • Inaktivující modifikace • v genových oblastech nebo konstitutivní heterochromatin H3K27me • Inaktivující modifikace, • V genových oblastech nebo konstitutivní heterochromatin • H3K27me3 důležitá pro regulace vývojových genů u rostlin i živočichů Methylace H3 závisí na velikosti genomu a druhové diverzitě H3K4me =všechny kombinace mají u rostlin i živočichů většinově aktivující charakter H3K9mel, H3K9me2, H3K27mel =značky inaktivního chromatinu H3K27me2/me3 =druhově specifické, spíše inaktivující charakter DAPI Met{K9)H3 merge Cardamine amara (a) m 1C=290 Mbp Triticum aestivum (b) 1C=16 6640 Mbp Ricinus communis (Cl ■ *. lC=515Mbp L Orzya sativa (d) 1C=490 Mbp Houban eí. o/. 2003 hetrochromatin euchromatin © H3K9me 1 •Velikost genomu>500 Mb vede ke změně distribuce aktivních a represivních modifikací! Acetylace lysinových reziduí NH, Bromodomain l protein lysine • O NH actyllysine on Histone deacetylase (HDAC) Histone z mm mm mm off Koreluje spíše s genovou aktivitou (např. H3K9ac) Redukuje pozitivní náboj histonových aminokyselin = DNA je více dostupná pro další enzymy Spekulativní jako epigenetická modifikace, spíše chromatinová modifikace Některé ac-skupiny postrádají mitotickou dědičnost, závislé na např. na cirkadiánní rytmu Velice proměnlivé Fosforylace sehnu, threoninu a tyrosinu plmsphosťrine • Nejvíce prostudovaná modifikace, z hlediska centromer • V závislosti na umístění=rozličná funkce • Závislá na buněčné cyklu, důležitá pro kondenzaci chromatinu threonine phosphothreonine CenH3-1 CenH3-2 H3T3ph H3S28ph H2AT120ph tubulin phosphotyrosine • H3S10ph(+H3S28ph) • V oblasti pericentromer (opak u živočichů - H3T3ph and H3Tllph) • H3Atl08(120)ph • Vnitřní část centromery Neumann et. al. 2016 H3Sl0pri H3T110T1 Fuchs et. al. 2012 Diverzita histonovych modifikaci a jejich funkce Historie modification Which residues? Functions Methylation (me, mono, di or tri me) Lysines (K) and Arginines (R) Transcription, Repair (K) Acetylation (ac) K Transcription, Repair, Replication, Condensation Ubiquitination (ub) Transcription Sumoylation (su) K Transcription ADP-ribosylation Glutamate (E) Transcription Phosphorylation (Ph) Serine (S) and Threonine (T) Transcription, Repair, Condensation Citrullination (Cit) R converts to Cit Transcription Molekulární evidence kombinatoriální komplexity A - H3K4me3 B - H3K16Ac Nízký afinita Nízká exprese Vysoká afinita Vysoká exprese A - H3K9me3 B - H3S10ph Vysoká afinita Nízká exprese Nízký afinita Vysoká exprese BPTF („Nucleosome-remodeling factor subunit") HPl (heterochromatin protein, důležitý pro vazbu DNMT1) Rando 2012 U Arabidopsis, CMT3 (CHH methylace) se preferenčně váže k dimeru H3K9me3H3K27m3. H i sto n-rozpozn á va j íc í domény histon-methylace, -acetylace a -fosforylace • Příklady proteinů obsahující chromodoménu • CHDl - ATP-chromatinový remodeler • HP1 - protein typický pro inaktivní heterochromatin, vazba DNMT1 • CBX2 - část PrC proteinu, ubiquitinace H2AK119 Neznámá hierarchie jednotlivých faktorů • HPl vazba na H3K9me3 • HPl vazba s DNMT • HPl vazba HMT a šíření H3K9me3 • DNMT může vázat HDAC =není jasné, které elementy jsou na vyšší regulační úrovni (a) Udržení gbM probíhá skrz interakci mezi CMT3 methylázou a H3K9me2 modifikací • CMT3 methyluje CHG místa v oblastech sousedících s inaktivním chromatinem - CHG methylace je signálem pro H3K9me2 CHG H3K9me2 • DNA replikace vede ke snížení CHG/CHH methylace, CGm jsou udržovány MET1 Muyle et al. 2022 tu o ro OJ E o > 0 c 1 CL) Cl u ro > O ro >m „v; ±- >u T3 >. O E ro in ro oj = <-> -ro ro r- ~ .§> Q. v) clí ro i- +-> < s2 (b) (c) i (d) LI (f) L CMT3 de novo CHG methylation 1 CHG - H3K9me Self-reinforcing feedback loop LA 1 CMT3 CHH and CG de novo methylation IBMl transcription coupled histone demethylation (e) LI. 1)^?T?3-?t DNA replication and MET1 mCG maintenance 1 DNA methylation | CG f CHG O CHH • H3K9me2 Histonové modifikace jsou odlišně distribuovány mezi geny a TEs ni nu in ■inn i 111 III II ■i i in Gene mRNA H3K4me H3K4me is associated with actively transcribed genes and mRNA. H3K9me [J ■III ■i mi mu i mi in Me-C Transposon J H3K9me is associated with methylated DNA (Me-C) and transposons. Red = high correlation Green = low correlation Distribuce histonových modifikací v genových oblastech • H3K27me3 - modifikace typická pro genovou inaktivitu (vývojové důležité geny) • H3K4me2/me3 a H3K9ac - značky typické pro genovou expresi a aktivitu (promotor) • H3K36me3 - značka typická pro genovou expresi (exony) 5' Promotér 3' t,bs Diverzita histonových variant a změna struktury chromatinu • Různé varianty H2A, H3, H4 • Každá varianta obsahuje specifické AA, měnící jejich funkci • Zvýšená stabilita • Výskyt AA, které mohou být modifikovány • Úloha v reparačních mechanismech, funkce centromer aj. Telomere H3.3 Pericentromeric heterochromatin canonical H2A, H2A.X H2A.W, H3.1 CenH3 Centromere canonical H2A, H2A.X H2A.Z, H3.1, H3.3 Euchromatin vs. Heterochromatin vs. centromere Euchromatin TSS TE body H2A.W, H3.1 TTS 11 i TEs TSS gene body TTS H2A.Z Canonical H2A H3.3 H2A.X, H3.1, H3.3 Genes with high expression TSS gene body TTS H2A.Z, H3.1, H3.3 Genes with low expression Rozdíl genů a repetic Histonové varianty jsou životně nezbytné • Buněčná regulace cyklu (DNA reparacem formace „sex body" a MSCI) • Regulace genové exprese (ANC vs INC) • Chromatinové skládání a členění (X chromozom inaktivace) • Buněčná dědičnost (pluripotence a dozrávání buněčných linií) • Úloha v lidských chorobách a imunitě • Úloha při stárnutí Fernandez et al. 2020 Identita centromery je definována cent-specifickým histonem • Pro většinu eukaryotických genomů je centromera definována chromatinovými a epigenetickými značkami • Aktivita centromery definována zejména H3-specifickou variantou (CENH3, Cse4, CENP-A) • Historicky definována jako konstitutivní heterochromatin, dnes zejména aktivní a represivní modifikace s jasnou hierarchií =centromerické satelity částečně nutné pro vazbu histonové varianty druhově specifická DNA sekvence (speciace?) H!K'.i\-ic.S H3K9Me3/H3A-Z HJK9We2 CENP-A HíWMel HJK4M