Epigenetika 11 Metody Obsah • METODY Obecné rozdělení • DNA methylační analýza • Bisulfitové sekvenování, MSAP…. • DNA-protein interakce • Imunolokalizace, Chip-seq • Chromatinová analýza • ATAC-seq, MNase-seq • Chemická genetika • 3D modelování Bisulfitové sekvenování • Působení hydrogensiřičitanu na cytosin=konverze na U (methylované C zůstávájí stejné) • Nutné porovnání proti referenční sekvenci, kterou analyzujeme • Nutnost referenčního genomu • Pro detekci ostatních modifikací (hmC, caC, fC) jsou nutné specifické reakce-konvenční bisulfitové sekvenování nerozlišuje mC a hmC a caC/fC od nemethylovaného C Výstup bisulfitového sekvenování Frekvence methylanovaných bp na celkový počet všech contigů Výpočet úrovně methylace na jenotky bp Vytváření methylomových map Průměrná úroveň methylace na chromozom Průměrná methyla na TEs, gen, kb, Mbp atd. MSAP • Restrikce pomocí methylačně sensitivních enzymů • MspI a HpaII neštěpí sekvenci, pokud první C methylován • Pre-selektivní PCR amplifikace • Ligace se specifickými primery • Selektivní PCR amplifikace • Amplifikace specifických produktů • PCR produkt screening • PAA nebo kapilárová elektroforéza • Případně další sonikace a příprava NGS knihovny • Výsledek • Získání DNA methylace analyzovaných vzorků, v případě NGS nutní reference MSAP+NGS technologie • Identifikace regionů s odlišnou methylací (DMRs) • Nutnost specifických softwarů • Po specifické PCR-preamplifikaci • Tvorba NGS knihovny • Sekvenování • Analýza produktů Obecné rozdělení • DNA methylační analýza • Bisulfitové sekvenování, MSAP…. • DNA-protein interakce • Imunolokalizace, Chip-seq • Chromatinová analýza • ATAC-seq, MNase-seq • Chemická genetika • 3D modelování BSA, případný enzymatický treatment Příprava vzorku Fixace Permeabilizace membrány Blokace aj. Inkubace protilátky Vizualizace Pletivo/tkáň, buněčné útvary aj. PFAM, Glutaraldehyd, EtOH… Detergent Monoklonální vs. polyklonální Mikroskopie Princip imunolokalizace Přímé a nepřímé barvení • Dražší • Nižší citlivost • Nižší pozadí • Levnější • Vyšší citlivost • Nižší i vyšší pozadí Becheva et al. 2018 Monoklonální protilátky • Ve srovnání s pAbs dražší • Rozpoznají jeden epitop (váže se na specifické místo) • Tvořeno jednou protilátkou Polyklonální protilátky • Levné pro produkci • Mix různých protilátek • Váží se na různé oblasti jedné molekuly • Tolerantní na malé změny v epitopu cílené molekuly Bártová et al. 2019 Chip-seq analýza Nakato et al. 2014 Koncentrační řada pro Mnasové štěpení Obecné rozdělení • DNA methylační analýza • Bisulfitové sekvenování, MSAP…. • DNA-protein interakce • Imunolokalizace, Chip-seq • Chromatinová analýza • ATAC-seq, MNase-seq • Chemická genetika • 3D modelování ATAC-seq („assay for transposase-accessible chromatin“ • Nukleozomové mapování • Vazba transkripčních faktorů • Detekce faktorů související s nemocemi • Komparativní epigenomika • Regulace buněčné specifikace gDNA je exponována vysoce aktivní transposáze → fragmentace DNA v otevřených oblastech → tagování se sekvenčními primery Illumina official website MNase-seq („micrococcal nuclease digestion“) Wikipedia commons Obecné rozdělení • DNA methylační analýza • Bisulfitové sekvenování, MSAP…. • DNA-protein interakce • Imunolokalizace, Chip-seq • Chromatinová analýza • ATAC-seq, MNase-seq • Chemická genetika • 3D modelování Chemická genetika • Aplikace chemických látek pro studium fenotypu nebo genové regulační dráhy • Chemická epigenetika neinterferuje s DNA (ne primárně) Kawasumi 2007 Chemické látky ovlivňující DNA Liu 2014 Chemické látky ovlivňující chromatin a DNA methylaci Liu 2014 Analýza nových genů regulujících epigenetické procesy u myší • Analýza X-chromozomové inaktivace • Existence 4 XCE alel (a, b, c, d) s různou expresí=pravděpodobností X chromozom inaktivace (d=nejsilnější alela, slabá IC) • Analýza ENU ovlivněných myší ukázala změnu v první X inaktivaci (E6.5 – 7.5) a změnu v maternální selekci X • Nalezené mutace umožnili nalézt 3 autozomální oblasti, které nepřímo ovlivňují X-vázané geny s neúplnou inaktivací nebo geny odpovědné za volbu parentálního X • Momme ENU • vysoce toxický mutagen působící 1 mutaci/700 různých oblastí • Účinky hlavně ve spermatocytech Momme – hledání genů odpovědných za epigenetické reprogramování • Vystavení specifický GFP linií ENU chemické mutagenezi v pozadí variabilní exprese (úroveň exprese je nižší v důsledku metastabilní epigenetické variability=podobné pozičnímu efektu u octomilky) • Objev 30 možných kandidátů regulujících různé úrovně epigenetických změn, dominantní mutace Momme – genetické mapování kauzálních mutací • Mutantní potomstvo s různou úrovní transgenní exprese je použito pro genetické mapování • Bodová mutace je analyzována pomocí exomového čtení (myší DNA exonové sekvence jako proby pro odhalení lokusu v kombinaci s NGS) Blewitt et al. 2013 Výsledek Momme mutantní linie Seznam kandidátních mutací Wild-type varianty jsou aktivující Wild-type varianty jsou represivní Obecné rozdělení • DNA methylační analýza • Bisulfitové sekvenování, MSAP…. • DNA-protein interakce • Imunolokalizace, Chip-seq • Chromatinová analýza • ATAC-seq, MNase-seq • Chemická genetika • 3D modelování Epigenetické in silico modelování a 3D rekonstrukce jádra • Analýza genomu • ChIP-seq • Hi-C • Simulační analýza • Model biopolymeru • Jednotlivé chromozomy • 3D modelování • Celý genom • Validace dat • Hi-C data • Mikroskopie • TADs • Jedná se o propojení všech uvedených metod a jejich in silico vizualizace, možné u modelových organismů! Stefano et al. 2021 Doporučená literatura/online kurzy