VÝVOJOVÁ GENETIKA Přednášky: Vojta Hudzieczek, Václav Bačovský Zygota – jedna buňka – základ celého organismu VÝVOJOVÁ BIOLOGIE SYLABUS 1 Obecné zákonitosti vývoje organizmů 1. Historie vývojové biologie, Základní procesyvývoje, Epigenetická tvorba tvarů 2. Modely tvorby biologických tvarů, Vznik uspořádání 3. Homeóza a homeotické geny 4. Modelové organizmy vývojové biologie a genetiky Okruhy na zkoušku: Mozaikový a regulativní typ vývoje, vývojové mapy buněčného osudu Modely tvorby tvarů: poziční informace, reaktivně-difúzní modely Lewis Wolpert: model francouzské a americké vlajky Homeóza, homeotické geny, proteiny buněčné paměti Jonathan Slack: zootyp a florityp, evoluce homeoboxových genů Pravidlo kolinearity, homeodoména, geny řídící tvorbu celých orgánů Regulační úlohy proteinů s chromodoménami: transkripční represory a aktivátory Homeotická transdeterminace, buněčná paměť Proteinyskupiny Polycomb a trithorax: buněčná paměť Heterochronní geny Vztahy evoluce a ontogeneze 2 Živočišné modely 1. Dictyostelium, Hydra 2. Caenorhabditis elegans 3. Drosophila melanogaster 4. Lytechinus,Amphibia 5. Mammalia Okruhy na zkoušku: Genetická kaskáda řízení embryogenezedrozofily Gastrulace: úloha, funkce, mechanismy Protostomia: modely vývojové genetiky Deuterostomia: modely vývojové biologie Jednobuněčnémodely vývojovébiologie a genetiky Charakteristika modelusociálního prvoka: hlenka Caenorhabditis: buněčnélinie, heterochronní genya apoptóza Homeotické mutace u drosofily: bithorax a antennapedia Systém zárodečných terčků drosofily, transdeterminace, regenerace Embryogeneze drosofily: buněčné procesy Charakteristika modelů obojživelníků: žáby a čolci Klasické modely vývojovébiologie: Echinodermata a Amphibia Tvorba základního plánu končetiny u obratlovců Savčí modelyvývojovébiologie 3 Rostlinné modely 1. Nižší rostliny 2. Krytosemenné rostliny, Angiospermophyta 3. Oplození, embryogenezea tvorba semene 4. Geny řídící meristém, stonek, list a květy Okruhy na zkoušku: Charakteristika a evoluce volvocinních systémů Model post-transkripční regulace: Acetabularia Rostlinné modely: Volvox, Acetabularia, Fucus, Marchantia, Physcomitrella, Ceratopteris Arabidopsis thaliana: model molekulární genetiky rostlin Krytosemenné rostliny: genetické řízení embryogeneze Vývoj rostlinné zygoty: vliv sporofytu, gametofytu a endospermu Charakteristika pohlavního rozmnožování, gametofyt a sporofyt Úloha gametofytu ve vývoji rostlin: gametofytické mutace Fytomery,mapování osudu buněk vegetativního meristému Genetická kaskáda květní indukce, řízení procesů kvetení Úloha genů s MADS-boxem ve vývinu květů, kvartetový model Homeoboxové geny u rostlin: struktura a funkce 4 ​Determinace a vývoj pohlavnosti 1. Zárodečná dráha a tvorba pohlavních buněk 2. Mechanizmy determinace pohlaví 3. Kompenzace dávky genů Okruhy na zkoušku: Hlavní genetické dráhy pohlavní determinace u modelových živočichů Molekulární mechanismy pohlavní determinace: drosofila a hlístice Drosofila jako model determinace a realizace pohlavnosti Mechanismy kompenzace dávky genů vázaných na chromosom X Environmentální a epigenetická determinace pohlaví, arrhenotokie, pseudoarrhenotokie Determinace a evoluce pohlavnosti rostlin, pohlavní chromosomy Zárodečná dráha a tvorba pohlavních buněk, úloha meristémů u rostlin Pohlavní determinace u člověka, struktura a evoluce sex chromozomů 5 Epigenetické procesy 1. Úloha metylací DNA 2. Struktura chromatinu a acetylace histonů 3. Genomový imprinting, Jiné epigenetické jevy Okruhy na zkoušku: Epigenetika: definice, projevy, nemendelovská dědičnost Mechanismy epigenetických procesů Mechanismy genomového imprintingu Modifikace nukleozomálních histonů a jejich úloha v řízení genové exprese Metylace DNA a jejich biologické úlohy Lidské choroby s epigenetickými aspekty Teorie parentálního konfliktu Apomixe, dvojí oplození, genomový imprinting u rostlin Conrad Waddington: epigenetická krajina, kanalizace, asimilace NeoLamarckismus: epigenetický přenos získané informace „Epigenetické“ syndromy: Rettův, Russel-Silverův, Martin- Bellův Úloha maternálních genů, ooplasmatická segregace Imprinting: Prader-Williův a Angelmanův syndrom Modulace rostlinného vývoje transgenozí, úloha růstových regulátorů Beckwith-Wiedemannův syndrom (Wilmsův tumor) a úloha genu Medea u rostlin Charakteristika rostlinného genu Medea Epigenetická nestabilita: umlčování transpozonů Nukleolární dominance, paramutace,poziční efekt, fakultativní heterochromatin Přehled vývojové biologie a genetiky Boris Vyskot Vydal Ústav molekulární genetiky AV ČR v Praze, 1999 ISBN 80-902588-1-6 • Úvod • Historie vývojové biologie • Obecné zákonitosti vývojových procesů Program přednášky VÝVOJOVÁ BIOLOGIE • je multidisciplinárním přístupem ke studiu individuálního vývoje (ontogeneze) jako integrace embryologie s cytologií a chronologicky později i s genetikou, molekulární biologií a bioinformatikou • Embryologie je definována jako popisné (deskriptivní) studium embryonálního vývoje • Cytologie studuje buněčnou strukturu a funkci • Genetika je vědou o dědičnosti • Molekulární biologie a bioinformatika představuje především analytický přístup myšlenkový i metodický Historické pozadí embryologie • Deskriptivní embryologie - detailní analýzy vývojových událostí (4. st. př.n.l. Aristoteles, mikroskopicky od 17. st. M. Malpighi, A. van Leewenhoek) • Komparativní embryologie – studium anatomických změn v průběhu vývoje odlišných organismů (od 19. st. – E. von Baer, W. Haeckel, T. Boveri) • Experimentální embryologie – studium kauzálních faktorů či mechanismů vývoje postavením hypotéz a jejich testováním manipulací s embryi (od 19. st. - W. Roux, H. Driesch, H. Spemann) • Molekulární embryologie – studium embryonálních procesů na molekulárně-genetické bázi (od 2. pol. 20. st. – S. Brenner aj.) Modelové organismy Modelové organismy https://www.menti.com/alp2z4ignakn menti.com -> "6520 8800" Jaké modelové organismy vývojové biologie znáte? Modelové organismy https://www.menti.com/alp2z4ignakn menti.com -> "6520 8800" Jaké vlastnosti by modelový organismus měl mít? Modelové organismy Historie vývojové biologie Preformismus nebo epigeneze ? vysvětluje princip individuálního vývoje : výsledný organismus není preformován, nýbrž vzniká kreativně na základě zděděné informace a vnitřních i vnějších vlivů Aristoteles (384-322 př.Kr.) - první pozorování vývojové biologie (kuřecí vejce) - napsal první učebnici reprodukční biologie - otec teorií vitalismu a epigeneze - představy o vzniku nových organismů : ze substrátu, pučením, hermafroditismem a bisexuální reprodukcí EPIGENEZE vysvětluje princip individuálního vývoje : výsledný organismus není preformován, nýbrž vzniká kreativně na základě zděděné informace a vnitřních i vnějších vlivů Aristoteles (384-322 př.Kr.) - první pozorování vývojové biologie (kuřecí vejce) - napsal první učebnici reprodukční biologie - otec teorií vitalismu a epigeneze - představy o vzniku nových organismů : ze substrátu, pučením, hermafroditismem a bisexuální reprodukcí EPIGENEZE Preformismus a mechanicismus : Marcello Malpighi (1 628 - 1 694) … ovismus Antoni van Leewenhoek (1 632 – 1 723) … animalculismus … lidský zárodek je již vybaven všemi orgány … EPIGENEZE … je kreativní syntéza nových tvarů s využitím zděděné informace a struktur Pierre-Louis Moreau de Maupertuis (1698-1759) genealogickou analýzou polydaktylie vyvrátil teorii preformismu Joseph Koelreuter (2. pol. 18. století) : hybridizací dvou druhů tabáku prokázal význam obou rodičů v potomstvu Theodor Boveri (1862-1915) Ascaris SOMATICKÁ A ZÁRODEČNÁ DRÁHA jaderné determinanty 1. rýhování 2. rýhování Augustin Weizmann (1834-1914) William Bateson (1861-1926) Materials for the Study of Variation (1894) … HOMEOSIS is a particular type of variation, in which one member of a repeating series assumes features that are normally associated with a different number … Edward Lewis (1963) : pravidlo spacio-temporální kolinearity HOMEOTICKÉ GENY jeden z klíčů specifikace a diferenciace embryo dospělec moucha myš Antennapedia komplex (anterior) Bithorax komplex (posterior) BITHORAX specifikuje třetí článek hrudi a zadeček: ztráta funkce – místo kyvadélek se tvoří druhý pár křídel ( more anterior phenotype ) HOMEOTICKÉ GENY jeden z klíčů specifikace a diferenciace Antennapedia komplex (anterior) Edward Lewis (1963) : pravidlo spacio-temporální kolinearity Objev homeoboxu (1982) Walter Gehring (Basel) Matthew Scott (Stanford) vazba homeodomény Antennapedia na DNA Mořská ježovka : historický model fertilizace, embryologie a buněčného klonování Oscar Hertwig Hans Driesch (1849-1922) (1876-1941) dauerblastula pluteus HISTORICKÉ KOŘENY VÝVOJOVÉ BIOLOGIE : Hans Spemann a Hilde Mangoldová (1924) Nobelova cena 2002 za fyziologii a lékařství za objevy genetické regulace orgánového vývoje a programované buněčné smrti … na modelu Caenorhabditis elegans Sydney Brenner (1927, JAR) John Sulston (1942, UK) Robert Horvitz (1947, USA) Přehled vývojových procesů gamety zygota růst buněčné dělení diferenciace tvorba tvarů morfogeneze vzrůst vzrůst diverzifikace organizace tvorba velikosti počtu buněk buněčných typů struktur dospělec gamety OBECNÉ VÝVOJOVÉ PRINCIPY - buněčná proliferace, tj. opakovaná buněčná dělení - buněčná diferenciace, vyskytující se v definovaném prostorovém pořádku - tvorba tvarů, různé buněčné typy se vyskytují v definovaných tvarech - vývoj je určován i buněčnými pohyby a buněčnou migrací - programovaná buněčná smrt je také důležitým ontogenickým faktorem Lewis Wolpert (*1929, London) TEORIE POZIČNÍ INFORMACE : MODELY VLAJEK hodnotykonc. morfo- genu potenciál buněk je stejný nová poziční informace konc. morfo- genu 1 2 3 4 5 6 diferenciace dle pozice prahové TEORIE POZIČNÍ INFORMACE : MODELY VLAJEK Modely diferenciace a vytváření tvarů Alan Mathison Turing (London, 1912-1954) The Chemical Basis of Morphogenesis (1952) Jak vznikají barevné skvrny na zvířatech ? modelování procesů morfogeneze Alan Turing, 1952 Morfogeny : aktivátor a inhibitor, reakce a difúze Osudy kanibalů (pozitivní aktivátor) a misionářů na bicyklech (negativní inhibitor) – v omezeném prostoru vznikají enklávy kanibalů či misionářů, vznik uspořádání tvarů z původně homogenního pole ostrov: pobřeží obydleno reakce a difúze vznik smíšeně kanibaly uspořádání a misionáři APOPTÓZA programovaná buněčná smrt jako morfogenní nástroj tvorby tvarů (pattern formation) morfologie listu Monstera deliciosa buněčná smrt vývoj končetiny obratlovců a separace prstů Princip zákonitosti a nahodilosti ve vývojové biologii Mají růstové pohyby zákonitý nebo náhodný směr ? Je levo-pravo-stranná asymetrie dána pouze environmentálně ? ( Ne ) náhodná asymetrie vývinu listů a květů směr otáčivosti je náhodný ! brčál (L, anticlockwise ) oleandr ( R, clockwise ) směr otáčivosti není náhodný ! Směr otáčivosti ulity měkkýšů odpovídá maternálně determinovanému rýhování pravotočivé (R) levotočivé (L) - směr otáčení je způsoben posunem čtyř animálních (1 a-d ) blastomer vůči čtyřem vegetálním blastomerám ( 1 A-D ) - pravotočivost je dominantní nad levotočivostí - injekce cytoplazmy R-formy do rýhujícího se vajíčka L-formy vede ke změně otáčení L R Alfred Sturtevant ( Limnaea : 1923 ) Cytoplazma oocytu rozhoduje o směru otáčení ulity měkkýšů: „pravotočivý“ faktor je dominantní PRAVÁ MATKA x LEVÝ OTEC LEVÁ MATKA x PRAVÝ OTEC LP D/D d/d L P d/d L D/DP D/d D/d D/d D/d d/d 3 P : 1 L stejně ! 3 P : 1 L rodiče (křížení) generace F1 samo- oplození F2 samo- oplození F3 všichni P ! D/D D/d D/d d/d D/D Úlohy genů s maternálním účinkem • geny odpovědné za iniciaci antero-posteriorní a dorsoventrální polarizaci ambrya • Bicoid mRNA je rozpoznávána v cytoskeletu svou 3` UTR v „budoucí“ anterorní oblasti vajíčka • Nanos mRNA je rozpoznávána svou 3` UTR v „budoucí“ posteriorní oblasti vajíčka • Hunchback a caudal mRNA jsou rozpoznávány v různých oblastech embrya vajíčko drosofily s gradientem mRNA normální vývoj abnormální vývoj Dědičnost genů s maternálním účinkem Klíčová stádia časné embryogeneze živočišných druhů fertlizace vajíčka rýhování, tvorba blastomer, blastula gastrulace tvorba zárodečných listů endoderm ektoderm animální pól vegetální pól osudová mapa blastuly neurální destička : nervový systém notochord blastopor endoderm : střevo, játra, plíce ektoderm : pokožka mezoderm : svaly, vazivo, ledviny, krev, gonády Základní stádia ontogeneze obojživelníků (De Robertis et al. 1990) 2-buněčné stádium midblastula časná gastrula pozdní gastrula (90 min) oplozené vajíčko animální pól (4tis. buněk, 7 h) (20tis. buněk, 9h) (12h) blastocoel vegetální pól blastopor blastopor ektoderm mesoderm endoderm časná neurula časná neurula pozdní neurula vylíhnutý pulec (150tis. buněk, 20h) (500tis. buněk, 3d) dospělá žába (12 měsíců) střevo střevo neurální destička neurální destička uzavírající se neurální destička Epigenetická tvorba tvarů v průběhu vývoje (i) úloha vnějších (fyzikálních) faktorů (ii) pozice maternálních determinant mozaikový vývoj - asymetrický transport cytoplazmatických determinant z maternálního vaječníku - ooplazmatická segregace (proces třídění a vnitřní strukturalizace po oplození) (iii) buněčné interakce (concerted behaviour) regulativní vývoj komunikace buněk s okolními buňkami vede ke koordinované tvorbě struktur a tvarů Mozaikový vývoj nastává, když se organismus vyvíjí, jako kdyby jeho blastomery tvořily prvky skládačky (puzzle), každý s prederminovaným osudem. Mozaikový vývoj se uskutečňuje prostřednictvím asymetricky lokalizovaných cytoplazmatických determinant. asymetrická lokace dělení buňky odlišné dceřinné buňky Regulativní vývoj osud blastomer je flexibilní, závisí na lokaci buněk, organizmus je schopen kompenzovat ztrátu či dislokaci blastomer. Mezibuněčná komunikace je základem embryonální indukce : jedna buňka dává instrukce jiné buňce k dosažení určitého vývojového osudu. Komunikace mezi buňkami může být dosaženo difúzibilními signály, přímým kontaktem mezi membránovými proteiny nebo tranzientními póry. buněčné signály difúze signál druhý posel přímý kontakt buněčné spoje Mozaikový vývoj se odehrává buněčně-autonomně; regulativní vývoj je buněčně-interaktivní. Prakticky všechny organismy se vyvíjejí za kombinace mozaikového a regulativního typu vývoje. Typ determinace : buněčně autonomní buněčně interaktivní Mechanismus : morfogenní determinanty indukce Typ vývoje : mozaikový regulativní Invariantní schéma buněčného dělení: dospělec má vždy 959 buněk. Savčí embryonální buňky vykazují flexibilitu ve výběru osudu (buněčného fenotypu) podle potřeb embrya. Tvorba chimér a monozygotických dvojčat je jasnou demonstrací regulativního typu vývoje. ES buňky s žádanou mutací injekce do blastocysty … je také finálním krokem při konstrukci geneticky modifikované myši. chiméra může předávat mutaci Vývojový osud, schopnosti a určení ( fate, potency, and determination ) Buněčný osud se vztahuje ke strukturám, které se „normálně“ vytvoří z embryonální buňky. Schopnost jsou všechny možné vývojové osudy určité buňky ve specifickém stádiu vývoje organismu. Schopnost je totožná s osudem pro buněčně autonomní mechanismus determinace (tj. mozaikový vývoj). Schopnost „překonává“ osud u buněčně intaktivních mechanismů determinace (tj. regulativní vývoj). Vývojový osud, schopnosti a určení ( fate, potency, and determination ) „Osudové“ mapy mají (alespoň) určitý stupeň přesnosti pouze u organismů, které vykazují mozaikový typ vývoje. „Osudová“ mapa ukazuje pozice (locations) a výsledné tkáně (derivatives) embryonálních buněk. laterální pohled dorzální pohled Blastomera Xenopus C3 dává vznik mezodermálním buňkám podél jedné strany pozdního embrya (tailbud stage). Schopnost je v průběhu vývoje stále omezována. Když se schopnost buňky již rovná jejímu osudu, buňka je vývojově určena (determinována). Základní typy vývojových schopností : totipotentence, pluripotence a determinace (unipotence). Pochopení vývojových schopností a určení má zásadní význam pro klonování savců. progresívní determinace v embryogenezi obojživelníků stav již determinován VEMI ČASNÉ GASTRULY recipient neurální destička donor stav nedeterminován POZDĚJŠÍ GASTRULY druhá neurální destička epidermis časné stádium není determinované donor : genotyp A recipient : genotyp B osudová mapa n o r m á l n í v ý v o j Syncyciální blastoderm: Buněčný blastoderm : pozdější stádium je determinované ablace buněk způsobí defekt v A5 ektopická exprese „genů A5“ na hlavě Buněčná paměť je schopnost buňky “pamatovat si” svou vývojovou (ontogenetickou) historii. Buněčná paměť je základem k založení stabilních „vzorců“ genové exprese příslušné pro daný buněčný typ. Buněčná paměť je stabilní. Buněčná paměť se podrobuje determinaci. Mechanismy buněčné paměti (metylace DNA, modifikace histonů, modelování chromatinu) nejsou zcela objasněny. Osud Schopnost Buněčná paměť Epigenetická krajina – model diferenciace buňek (kanalizace) Epigenetická krajina – model diferenciace buňek (kanalizace) Protein A vstupuje do jádra a zpětnovazebně aktivuje sám sebe. Protein A také potlačuje gen B a aktivuje gen C. transkripce genu A, po buněčném dělení A vstupuje do jádra a represe B, aktivace C není žádný gen aktivní vznikne původní stav Determinace (určení vývojového osudu) buňky je řízena strukturními změnami chromatinu Stabilní změny chromatinové struktury jsou generovány kovalentními modifikacemi histonů a DNA (a nekovalentní vazbou řady proteinů k chromatinu) : klíčový mechanismus determinace. Modifikace zahrnují především (enzymaticky řízené) metylace, acetylace a fosforylace. Postreplikativní „udržovací“ metylace DNAnabízí optimální variantu přenosu epigenetické informace (o genové expresi) při buněčném dělení.