Rychlá cytologická metoda ROZTLAKOVÉ PREPARÁTY MATERIÁL: KOŘENOVÉ ŠPIČKY ROSTLIN Cíle u připravit roztlakový preparát kořínku cibule u obarvit preparát jaderným barvivem u posoudit kvalitu připraveného preparátu z hlediska usnadnění/ztížení pozorování fází mitózy u rozeznat v preparátu jednotlivé fáze mitózy Primární a sekundární meristémy WHAT IS A MERISTEM? In the early stages of development of the plant embryo all the cells undergo division, but with further growth and development cell division and multiplication become restricted to special parts of the plant which exhibit very little differentiation and in which tissues remain embryonic in character and the cells retain the ability to divide. These embryonic tissues in the mature plant body are called meristems. Charakteristika meristematických buněk umalé, izodiametrální buňky utenká buněčná stěna uvelké jádro (jádro-plasmový poměr) uvelká hustota protoplastu – malé vakuoly u u Buněčný cyklus G0 fáze: buňka se nedělí, je součástí pletiva G1 fáze (z ang. gap = mezera): na buňce není pozorovatelné co se v ní děje, probíhá syntéza RNA a bílkovin S (syntetická) fáze: syntéza DNA G2 fáze: syntéza bílkovin pro vznik a dělení jádra (histony a mikrotubuly) M fáze (mitóza): nepřímé dělení jádra C fáze (cytokineze): dělení celé buňky I (interfáze): doba, kdy se buňka připravuje na dělení, tj. G1, S a G2 fáze mujweb.cz/Veda/biologie/b.%20cyklus.htm. Mitosis | BioNinja Mitóza Kořenový apikální meristém Linum vlastní meristém klidové centrum kořenová čepička kolumela = střední sloupek kořenové čepičky Barviva – zvýšení kontrastu upřírodní ukarmín - červec nopálový uorcein - lišejníky (Lecanora, Roccella) u uhematoxylin - dřevo kampešky (Haematoxylon campechianum) ubrasilin - dřevo druhů rodu Caesalpinia (Caesalpinia sappan, C. brasiliensis) u usyntetická Karmín kyselina karmínová [USEMAP] Dactylopius coccus Cochineal, Natural Red 4, C.I. 75470 Carmine, also called Cochineal, Natural Red 4, or C.I. 75470, is a pigment of a bright red color obtained from the carminic acid produced by the cochineal insect, and is used as a general term for a particularly deep red color. Carmine is used in the manufacture of artificial flowers, watercolors, rouge, cosmetics, food additives and crimson ink, and in the painting of miniatures. Carmine may be prepared from cochineal, by boiling dried insects in water to extract the carminic acid and then treating the clear solution with alum, cream of tartar, stannous chloride, or potassium hydrogen oxalate; the coloring and animal matters present in the liquid are thus precipitated. Other methods are in use; sometimes egg white, fish glue, or gelatine are added before the precipitation. The quality of carmine is affected by the temperature and the degree of illumination during its preparation, sunlight being requisite for the production of a brilliant hue. It differs also according to the amount of alumina present in it. It is sometimes adulterated with cinnabar, starch and other materials; from these the carmine can be separated by dissolving it in ammonia. Good carmine should crumble readily between the fingers when dry. Carmine lake is a pigment obtained by adding freshly precipitated alumina to decoction of cochineal. Carmine can be used as a staining agent in microbiology, as a Best's carmine to stain glycogen, mucicarmine to stain acidic mucopolysaccharides, and carmalum to stain cell nuclei. In these applications, it is applied together with a mordant, usually an Al(III) salt. Orcein archil, orchil, lacmus, litmus a C.I. Natural Red 28, (E121) červené v kyselém pH, modré v alkalickém pH Orcein, also Archil, orchil, lacmus, litmus, and C.I. Natural Red 28 is a dye extracted from a lichen. It is red in acidic pH and blue in alkaline pH. Orcein is approved as a food dye, with E number E121. Its CAS number is 1400-62-0[1]. Its chemical formula is C[28]H[24]N[2]O[7]. It forms dark brown crystals. Orcinol is extracted from archil lichen, Rocella tinctoria. It is then converted to orcein by ammonia and air. Orcein is a reddish-brown dye, orchil is a purple-blue dye. Orcein is also used as a microscopical stain. It is a mixture of phenoxazone derivates - hydroxyorceins, aminoorceins, and aminoorceinimines. Mitotické jedy •halogenové deriváty aromatických uhlovodíků (p-dichlór benzén, -bróm naftalén, 8-hydroxychinolin) •alkaloidy (kolchicin, vincristin) •herbicidy (oryzalin) u Buňky meristému kořene hrachu Pisum po synchronizaci jaderného dělení oryzalinem (dr. J. Macas) Obecný postup roztlakové metody u •fixace Carnoy, Farmer •macerace HCl •roztlačení •barvení acetokarmín, laktopropionový orcein •projasnění levulózový sirup, glycerol fixačně-macerační směs předpůsobení Fixačně-macerační směs Dostál J. (VÚOK Průhonice) •1 díl 96% etanolu •1 díl normálního butanolu •1 díl ledové kyseliny octové •1 díl konc. HCl (35 – 36%) •4 díly destilované vody Pracovní postup uMateriál: kořeny Allium cepa L. u ubez předpůsobení – fáze buněčného cyklu ●odběr naklíčených kořenů ●fixace a macerace v činidle ●izolace kořenové špičky ●barvení laktopropionovým orceinem ●rámování lakem na nehty u upředpůsobení v hydroxychinolinu – narušení cytoskeletu ●inkubace kořenů v 0,02 M roztoku hydroxychinolinu ●odběr naklíčených kořenů ●fixace a macerace v činidle ●izolace kořenové špičky ●barvení laktopropionovým orceinem ●rámování lakem na nehty u Laktopropionový orcein roztlakový preparát Allium cepa Olympus BX-51 procházející světlo Olympus BX-51 DIC Úkoly uzhodnocení kvality macerace, roztlaku a obarvení u srovnání barvení jaderným barvivem a toluidinovou modří u u fotodokumentace roztlaku kořínku bez předpůsobení a s předpůsobením hydroxychinolinem u zhodnocení kvality preparátu vyrobeného během cvičení Cytologie a anatomie rostlin