Fázový kontrast Hana Cempírková, Ph.D. • objekty amplitudové = barevné nebo nabarvené – větší nebo menší měrou absorbují světlo = mění amplitudu procházejícího vlnění • objekty fázové = od svého okolí se liší jen malou změnou indexu lomu = nemění amplitudu vlnění, ale posunují jeho fázi • lidské oko není citlivé na posun fáze • fázový kontrast přeměňuje fázové posuny vlnění na změnu amplitudy a umožňuje tak pozorování živých nebarvených objektů Význam fázového kontrastu Fritz Zernike – holandský fyzik nositel Nobelovy ceny za fyziku v roce 1953 •Formuloval zásady fázového kontrastu •• Poprvé je publikoval v roce 1935 •• Podle jeho patentu byl v roce 1941 vyroben prototyp ve firmě Zeiss Jena. •• Od roku 1945 se toto zařízení začalo sériově vyrábět a získalo si mnoho uživatelů. •• Léta 1948 – 1955 byla obdobím největšího rozkvětu aplikací fázově - kontrastní mikroskopie, především v biologii. 1888 – 1966 Souprava pro fázový kontrast fázové objektivy s fázovou deskou Phz pomocný mikroskop pro centrování clony a fázové desky fázový kondenzor s prstencovými clonami http://kfrserver.natur.cuni.cz/studium/prednasky/mikro/mscope/DIC/FazKontrast.gif http://kfrserver.natur.cuni.cz/studium/prednasky/mikro/mscope/DIC/fk.htm Phase Contrast Illumination > Schéma fázového kontrastu podle Zernikeho http://www.microscopyu.com/articles/phasecontrast/phasemicroscopy.html Vrstva na fázové destičce je nejčastěji tvořena dielektrikem (zajišťuje požadovaný fázový posuv o ¼ vlnové délky); na dielektriku je nanesena kovová vrstva k dosažení potřebné amplitudové propustnosti Srovnání obrazu preparátu epiteliálních buněk sliznice v procházejícím světle ve fázovém kontrastu http://www.microscope-microscope.org/advanced/phase-contrast-microscope.htm Srovnání obrazu projasněného semene Capsella bursa-pastoris při šikmém osvětlení ve fázovém kontrastu Srovnání obrazu epidermis cibule v procházejícím světle ve fázovém kontrastu Diferenciální Interferenční Contrast Podobně jako fázový kontrast i diferenciální interferenční kontrast (DIC) využívá pro vznik viditelného (amplitudového) obrazu rozdíly v indexech lomu prostředí, objektu, nebo jeho jednotlivých komponent. Obvykle se používá k pozorování drobných nebarvených objektů. Podle obvykle používané konstrukce, kterou navrhl Nomarski a u níž je Wolastonův hranol umístěn nad objektivem a není přímo jeho součástí, se také často nazývá Nomarského DIC. „Halo“ efekt http://www.olympusmicro.com/primer/techniques/dic/images/dicphasefigure4.jpg Jedním z typických artefaktů vznikajících při pozorování ve fázovém kontrastu je "halo efekt" ohraničující objekty. Tmavé objekty jsou v pozitivním fázovém kontrastu ohraničeny světlým "stínem" a naopak jasné objekty v negativním fázovém kontrastu mají "stín" tmavý. Tento efekt je výsledkem neúplného prostorového oddělení optických drah světla pozadí a světla procházejícího objektem. Část světla po průchodu objektem sdílí optickou dráhu se světlem pozadí i během průchodu fázovou deskou objektivu a dochází tak k posunu fáze odlišnému od ostatního světla procházejícího objektem. Výsledkem je právě vznik "halo" na hranicích objektu. http://www.olympusmicro.com/primer/techniques/dic/dicphasecomparison.html http://www.funsci.com/fun3_en/guide/guide4/micro4_en_16.jpg Grain of pollen from the lesser celandine (Ranunculus ficaria) which has produced a pollen tube. Kept in a 15% sugar solution for approximately 6 hours. Phase contrast. Field = 0.25 mm. http://www.funsci.com/fun3_en/guide/guide4/micro4_en.htm http://casopis.vesmir.cz/files/image/id/10165 Štítkovité krycí trichomy hlošiny (Elaeagnus sp.), Nomarského diferenciální interferenční kontrast, zvětšení 360× http://casopis.vesmir.cz/files/obr/nazev/2004_146_03:jpg/type/html Dark field – temné pole Školní mikroskop What is Dark Field Microscopy – Microscope Clarity The path of the light is directed in such a way that it can pass through the outer edge of the condenser at a wide-angle and strike the sample at an oblique angle. Only the light scattered by the sample reaches the objective lens for visualization. Polarizační mikroskopie Mikroskop polarizační PM 403 - VERKON SVĚTELNÁ MIKROSKOPIE (základní pojmy) - PDF Free Download Pestrý svět minerálů a hornin - Magazín | Přírodovědci.cz Polarizační mikroskopie :: Mikroskopy Calciphytoliths (calcium oxalate crystals) analysis for the identification of decayed tea plants (Camellia sinensis L.) | Scientific Reports -pozorování určitých buněčných struktur vykazujících jednolom nebo dvojlom -(např. buněčná stěna rostlinných buněk, jaderná membrána, dělicí vřeténko, škrobová zrna, fibrilární struktury kolagenu a elastinu, kontraktilní myofibrily žíhané svaloviny, tonofibrily, krystalické inkluze) Úkoly •Vytvořte mikroskopické preparáty z dodaného materiálu • pozorujte 4 způsoby: světlé pole, fázový kontrast, temné pole a polarizační mikroskopie • vytvořte fotodokumentaci a slovně okomentujte kvalitu pozorování a přínosy (nebo naopak nevýhody) jednotlivých mikroskopických technik na konkrétních preparátech • v závěru shrňte poznatky získané pozorováním