Fluorescenční mikroskopie principy a použití Botanická mikrotechnika, podzimní semestr Hana Cempírková 09_Fluor_mikroskopie2022.pdf Strana 1 z 41 • • objekt absorbuje záření určité vlnové délky, které se vnitroatomovým přeskupením změní na záření o delší vlnové délce excitace: viditelné světlo, UV, X, ... Luminiscence 09_Fluor_mikroskopie2022.pdf Fluorescence je jedním z typů luminiscence. Luminiscence je jev, který můžeme pozorovat i v běžném životě nebo v přírodě, ať už jako svítící čísla na ciferníku hodin ve tmě nebo u různých živočichů, jako jsou třeba medúzy. Strana 2 z 41 Stokesův zákon: λ λE F< Emitované záření má větší vlnovou délku a tudíž nižší energii. E = h . c/λ Stokesův posuv λ 09_Fluor_mikroskopie2022.pdf To, že některé objekty mohou po vystavení nějakému záření samy zářit popisuje tzv. Stokesův zákon. V něm se říká, že emitované záření má větší vlnovou délku než to absorbované. Z praktického hlediska to pro nás znamená, že zatímco excitace objektů probíhá při nižších vlnových délkách, třeba i pro člověka neviditelných (jako je UV-záření), tak emitované záření (fluorescence) je už v oblasti vlnových délek viditelného světla. Strana 3 z 41 • • fosforescence – vyzařování světla trvá i po přerušení excitace fluorescence – nemá setrvačnost, záření zaniká po přerušení excitace Luminiscence 09_Fluor_mikroskopie2022.pdf Mezi základní druhy luminiscence patří fosforescence (to jsou třeba ta svítící čísla na ciferníku ve tmě) a fluorescence, kterou využíváme mimojiné pro pozorování objektů v mikroskopii. Strana 4 z 41 • Intenzivní a téměř monochromatické záření, tj. NE halogenové lampy • Xenonové obloukové lampy nebo rtuťové výbojky s excitačními filtry • Lasery (nejčastěji pro konfokální mikroskopii) • Výkonné LED Světelný zdroj 09_Fluor_mikroskopie2022.pdf Světelné zdroje pro excitaci objektů musí mít vysokou intenzitu a měly by pokrývat širší spektrum vlnových délek. U konfokálních mikroskopů (které jsou také založeny na principu fluorescence) jsou to pak nejčastěji výkonné LED s úzkou a specifickou šířkou vlnových délek. Na obrázku nahoře vpravo vidíte jeden odpojený světelný zdroj (černá "kostka" s otvorem se namontuje na mikroskop, bílá "krabice" je eletrický zdroj a kromě zapínání (zelené tlačítko) je tam i počítadlo pro přehled, jak dlouho ještě lampa vydrží. Strana 5 z 41 Detekce fluorescence • • • • spektrofluorometry a “microplatereaders“ měří průměr vlastností vzorků (µl až ml) fluorescenční mikroskopy rozlišují fluorescenci jako funkci prostorových koordinát ve dvou nebo třech rozměrech pro mikroskopické objekty (menší než ~0.1 mm v průměru) fluorescenční scannery včetně „microarrayreaders“, rozlišují fluorescenci jako funkci prostorových koordinát ve dvou rozměrech pro makroskopické objekty, jako jsou elektroforetické gely, bloty a chromatogramy průtokové cytometry (Flowcytometers) měří fluorescenci každé buňky v protékajícím proudu, což umožňuje identifikovat, kvantifikovat nebo sortovat subpopulace buněk ve velkém vzorku 09_Fluor_mikroskopie2022.pdf Kromě fluorescenčních mikroskopů existují např. spektrofluorometry, které měří fluorescenci tekutých vzorků, fluorescenční scannery, které se používají např. na snímání elektroforetických gelů nebo průtokové cytometry, které mohou měřit fluorescenci každé buňky (případně i chromozomu) v protékajícím proudu. Strana 6 z 41 Princip fluorescenčního mikroskopu excitační (budící) filtr vzorek závěrný (bariérový) filtr 09_Fluor_mikroskopie2022.pdf Základním principem při sledování fluorescence je excitace tzv. excitačním (nebo taky budícím) světlem a vzorek pak vyzáří záření jiných (vyšších) vlnových délek. V mikroskopii potřebujeme "vybudit" (neboli excitovat) jen specifické části vzorku, proto je před vzorek umístěn excitační filtr, který propustí jen záření o určitém rozsahu vlnových délek. Při emisi ze vzorku dochází také k vyzáření různých vlnových délek - my si určíme, které chceme sledovat pomocí tzv. závěrového (bariérového, emisního) filtru. Strana 7 z 41 Excitační filtry - Olympus z katalogu BG = blue glass UG = ultraviolet glass IF = interference filter 09_Fluor_mikroskopie2022.pdf Tady jsou příklady některých filtrů, které dodává ke fluorescenčním mikroskopům firma Olypus: mohou propouštět celkem široký pás vlnových délek v UV nebo modré oblasti, nebo mohou mít relativně tenký pás vlnových délek pro specifičtější excitaci (tzv. interferenční filtry), příp. existují i jejich kombinace. Strana 8 z 41 Bariérové filtry - Olympus z katalogu Y = yellow filter L = longpass filter O = orange glass 09_Fluor_mikroskopie2022.pdf Bariérové (emisní) filtry jsou založeny na jiném principu - propustí všechno záření od určité vlnové délky. Principem správného fungování fluorescenčního mikroskopu je, že vlnové délky excitačního a emisního filtru se nesmí překrývat (pak bychom totiž mohli pozorovat i odražené excitační záření). Např. při excitaci velmi nízkými vlnovými délkami (začátek UV) se použije jako emisní filtr "longpass", ale naopak při excitaci v oblasti modrého záření bude třeba použít oranžový nebo červený filtr, který propustí pouze delší vlnové délky. Strana 9 z 41 Transmisní fluorescenční mikroskop 09_Fluor_mikroskopie2022.pdf Starším typem je tzv. transmisní fluorescenční mikroskop. Světlo je přiváděno na vzorek stejnou cestou jako je klasický světelný mikroskop. Tento mikroskop má spoustu nevýhod, např. nevyužívá plného potenciálu světelného zdroje, protože osvětluje objekt širokým válcem světla, nebo nutnost používat při pozorování techniku temného pole (excitující světlo je přiváděno ke vzorku formou šikmých paprsků (viz číslo 5 na obrázku). Strana 10 z 41 Dichroické zrcadlo a princip funkce 09_Fluor_mikroskopie2022.pdf Vylepšení fluorescenční mikroskopie představuje tzv. dichroické zrcadlo. V tomto zrcadlu se při dopadu světla v jednom směru většina záření odrazí pod pravým úhlem, zatímco v opačném směru většina světla projde skrz. Strana 11 z 41 Schéma epifluorescenčního mikroskopu 09_Fluor_mikroskopie2022.pdf Toto dichroické zrcadlo pak umožnilo konstrukci tzv. epifluorescenčního mikroskopu, ve kterém excitační světlo dopadá na objekt shora. Vyzářené světlo pak prochází dichroickým zrcadlem nahoru a je pozorováno za okulárem. Strana 12 z 41 Epifluorescenční mikroskop -Olympus BX-51 09_Fluor_mikroskopie2022.pdf Tady ještě schéma skutečného mikroskopu se znázorněním optických drah. Strana 13 z 41 „Kostky“ = kombinace filtrů a dichroického zrcadla pro epifluorescenci 09_Fluor_mikroskopie2022.pdf Protože pro různé aplikace potřebujeme různé excitační a emisní filtry, tak tyto výrobci mikroskopů umisťují do tzv. kostek. Díky otočnému karuselu je pak změna filtrů velmi jednoduchá (a jeden mikroskop můžeme používat pro různé techniky). Strana 14 z 41 Nikon 09_Fluor_mikroskopie2022.pdf Konstrukce kostky je jednoduchá: na straně (ve směru, odkud přichází světlo) je excitační filtr, nahoře je bariérový filtr a mezi nimi je šikmo posazené dichroické zrcátko. Strana 15 z 41 Kombinace filtrů (Olympus) a metody UV B G IY DM400 /nm/ Excitace Kostka U-MWU2 U-MNU2 U-MWB2 U-MNB2 U-MWG2 U-MNG2 U-MWIY2 Dichr.zrcadlo Excitační filtr 330 – 385 360 -370 450 – 480 490 - 470 420 515 590 610 Bariérový filtr Použití FITC, Akridinoranž Rhodamin, TRITC, PI, Texas red autofluorescence DAPI Hoechst 33258 510 –550 530 - 550 545 - 580 DM500 DM570 DM600 09_Fluor_mikroskopie2022.pdf Když používáte fluorescenční mikroskop, měli byste vědět, jaké kostky máte k dispozici, protože se liší nejenom oblastí vlnových délek, které propouští excitační filtr, ale třeba i šířkou pásu vlnových délek. Široký pás vlnových délek (např. U-MWU2 kostka, W=wide) je sice použitelný pro více barviček, ale úzký pás (např. U-MNU2 kostka, N=narrow) je zase specifičtější a emitovaná fluorescence bude "ostřejší" a méně rušená emisí "nechtěných" vlnových délek (např. autorfluorescencí). Strana 16 z 41 Typy fluorescence sekundární fluorescence primární fluorescence indukovaná fluorescence autofluorescence barvení = fluorochromy imunofluorescence = fluorochromem značené protilátky 09_Fluor_mikroskopie2022.pdf Ve fluorescenčním mikroskopu můžeme pozorovat několik typů fluorescence: primární, kterou označujeme jako autofluorescence, a sekundární, která spočívá ve fluorescenci nějaké přidané látky, ať už barvičky, protilátky značené fluorochromem nebo nějakou molekulou, která indukuje fluorescenci (např. formaldehyd). Strana 17 z 41 • vysoká specificita a citlivost primární (autofluorescence) – častá u rostlinných pletiv • chlorofyl • lignin, suberin • pryskyřice, sekundární metabolity • sekundární – fluorochromy –specifická vazba na určité struktury (DAPI, Hoechst 33258) • značení GMO fluoreskujícími proteiny (GFP,YFP) • fluorescenční imunohistochemie–spojuje sekundární fluorescenci s reakcí: antigen x protilátka Fluorescence 09_Fluor_mikroskopie2022.pdf Autofluorescence je u rostlinných pletiv docela častá, což se dá dobře využít (levnější než používání fluorescenčních barviček). Fluorescenční barvičky (fluorochromy se specificky vážou na určité struktury, takže je umožňují pozorovat (např. jádra, cytoskelet). Strana 18 z 41 1. autofluorescence 09_Fluor_mikroskopie2022.pdf Strana 19 z 41 Autofluorescence ligninu v xylému a sklerenchymu UV excitace Snímek příčného řezu cévním svazkem foto-soutěž Nikon, 2004 09_Fluor_mikroskopie2022.pdf Strana 20 z 41 Příčný řez stonkem zvýraznění endodermis a sekundárních krycích pletiv 09_Fluor_mikroskopie2022.pdf Strana 21 z 41 09_Fluor_mikroskopie2022.pdf V obrázku nahoře vlevo kromě středního válce kořene můžete pozorovat i vrsty buněk pod rhizodermis díky fluorescenci sekundárně ztloustlých buněk (tzv. hypodermis). V obrázku nahoře napravo jde díky fluorescenci suberizinovaných buněčných stěn pozorovat endodermis ve stádiu Casparyho proužků. Na obrázku dole vlevo lze sledovat rozmístnění cévních svazků ve stonku jednoděložné rostliny, na obrázku dole vpravo pak chloroplasty v listu. Strana 22 z 41 2. fluorochromy 09_Fluor_mikroskopie2022.pdf Strana 23 z 41 Fluorescence kalózy v pylových láčkách fluorochrom: anilínová modř UV excitace 09_Fluor_mikroskopie2022.pdf Strana 24 z 41 Stonek jedle v modrofialovém světle barvení akridinovou oranží 09_Fluor_mikroskopie2022.pdf Strana 25 z 41 Srovnání fluorescenčních barviv 09_Fluor_mikroskopie2022.pdf V případě, že chcete pozorovat různé struktury v rámci jednoho objektu, můžete se vybrat takové barvičky, u kterých jsou odlišná excitační a emisní spektra. Tak budete moci pro každou barvičku použít jinou kostku a nakonec si složit obrázek z jednotlivých barev. Strana 26 z 41 3. sledování životaschopnosti buněk 09_Fluor_mikroskopie2022.pdf Strana 27 z 41 Sledování životaschopnosti buněk substrát: FDA esterázy fluorescein + acetát (fluoresceindiacetát) P. Debergh kombinace obrazu fluorescence a sv. pole 09_Fluor_mikroskopie2022.pdf Všechny živé buňky obsahují enzymy, mj. i esterázy. Když FDA vstoupí do buňky (má schopnost rychlého přenosu do buněk), tak esterázy způsobí odštěpení acetátu a molekula fluoresceinu zazáří. Do mrtvých buněk FDA taky vstoupí, ale nedojde tam k odštěpení acetátu, tudíž k žádné fluorescenci. Strana 28 z 41 Buňky kalusu mrkve Daucus carota ssp. carota Nomarského diferenciální interferenční kontrast (DIC)  fluorescence živých buněk po inkubaci s FDA 09_Fluor_mikroskopie2022.pdf Strana 29 z 41 ukázka živé/mrtvé buňky, buněčná suspenze BY-2, FDA+PI> testování viability, živé buňky zelené, mrtvé-červená jádra (PI) 09_Fluor_mikroskopie2022.pdf Toto sledování životnosti lze ještě podpořit barvičkou propidiumjodid (PI). To je barvička, která barví jádra (červeně). V živých buňkách červená jádra "přesvítí" zelený fluorescein, zatímco v mrtvých buňkách vidíme pouze červeně svítící jádra. Strana 30 z 41 Kombinace fluorochromů a filtrů DAPI + FITC 09_Fluor_mikroskopie2022.pdf Strana 31 z 41 Kombinace fluorochromů a filtrů FITC barví se mikrotubuly propidium jodid barví jádra kombinovaný obraz kultura buněk A549 09_Fluor_mikroskopie2022.pdf Strana 32 z 41 Kombinace DAPI a fázového kontrastu DAPI fázový kontrast kombinovaný obraz 09_Fluor_mikroskopie2022.pdf Strana 33 z 41 FISH (fluorescenční hybridizace)in situ chromosomy ječmene (fluorored) sondy: GAA trinukleotid sekvence (zelená) pAs1 (červená) základní metoda molekulární cytogenetiky: podstatou je hybridizace= navázání sondy k chromozomální DNA sonda = malý fragment DNA značený fluorescenčním barvivem (fluorochromem), který se váže na specifické místo chromozomu. 09_Fluor_mikroskopie2022.pdf Strana 34 z 41 Detekce transgenů, detekce aktivity genů (GFP) 09_Fluor_mikroskopie2022.pdf Strana 35 z 41 GFP The green fluorescent protein (GFP) is a protein composed of 238 aminoacid residues (26.9kDa) that exhibits bright green fluorescence when exposed to light in the blue to ultraviolet range. Although many other marine organisms have similar green fluorescent proteins, GFP traditionally refers to the protein first isolated from the jelly fish Aequorea victoria. The GFP from A. victoria has a major excitation peak at a wavelength of 395nm and a minor one at 475nm. Its emission peak is at 509 nm, which is in the lower green portion of the visible spectrum. The fluorescence quantum yield (QY) of GFP is 0.79. The GFP from the sea pansy(Renillareniformis) has a single major excitation peak at 498nm. In cell and molecular biology, the GFP gene is frequently used as a reporter of expression. It has been used in modified forms to make biosensors, and many animals have been created that express GFP, which demonstrates a proof of concept that a gene can be expressed throughout a given organism, in selected organs, or in cells of interest. GFP can be introduced into animals or other species through transgenic techniques, and maintained in their genome and that of their offspring. To date, GFP has been expressed in many species, including bacteria, yeasts, fungi, fish and mammals, including in human cells. Scientists Roger Y. Tsien, Osamu Shimomura, and Martin Chalfie were awarded the 2008 Nobel Prize in Chemistry on 10 October 2008 for their discovery and development of the green fluorescent protein. 09_Fluor_mikroskopie2022.pdf Strana 36 z 41 Arabidopsis DR5::GFP Auxin Reporter kořen kořen+ auxin anti-IAA AB embryo DR5rev 35S min GFP 35S pA vizualizace přítomnosti auxinu J. Friml 09_Fluor_mikroskopie2022.pdf DR5rev se exprimuje jenom v přítomnosti auxinů (proto tzv. auxinový reportér). Když do stejné sekvence vložíme gen pro GFP, tak se tento bude exprimovat společně s DR5rev (všude, kde se vyskytuje auxin) Strana 37 z 41 DR5::GFP vizualizace přítomnosti auxinu J. Friml histochemická lokalizace IAA Auxin v embryogenezi Arabidopsis 09_Fluor_mikroskopie2022.pdf Strana 38 z 41 PtK1 buňky: mikrotubuly (protilátka proti tubulinu značená FITC = zelená) a DNA (DAPI = modrá) originální snímek snímek po úpravě http://www.aqi.com/index.php (A. Khodjakov, Ph.D.,Wadsworth LabsAlbany, NY) 09_Fluor_mikroskopie2022.pdf Na tomto snímku je ukázána nutnost úpravy snímků - na originálním snímku dochází k "rozmazání" mikrotubulů vlivem záření, které vychází z různých rovin. Tento obrázek je možné zaostřit, aby více odpovídal skutečnosti. Strana 39 z 41 Fotostabilita fluorescence Oregon Green 514 phalloidin fluorescein phalloidin 1s 10s 20s 30s OG514 09_Fluor_mikroskopie2022.pdf Tady chci upozornit na jeden z problémů při používání fluorescenčních barviček - většina se "vysvítí" v relativně krátké době (tzn. nejvíce intenzivní fluorescence je ihned po ozáření excitačním světlem, ale po chvilce začne intenzita fluorescence slábnout a může úplně zmizet). Naštěstí se postupně vyvíjejí i barvičky, které mají delší fotostabilitu. Strana 40 z 41 X-ray fluorescence microscopy image of the seed capsules of the nickel hyperaccumulator plantAlyssummurale. The red colour shows its structure, whereas the green colour shows calcium, and blue shows nickel. 09_Fluor_mikroskopie2022.pdf Strana 41 z 41