Příprava krevního roztěru
Správně Příliš tlustý
Moc krve
Nerovnoměrný
tah
Třásla se ruka
Krev se
srážela
Mastné
sklíčko
Barvení roztěrů
◼ Standardním barvením pro krevní nátěry je tzv. panoptické barvení dle
Pappenheima.
◼ Postup barvení:
1. Celý nátěr na 3 minuty pokryjeme May-Grünwaldovým barvivem.
2. Opatrně přikapáváme destilovanou vodu tak, aby se původní barvivo
nesmylo. Cílem je nechat působit takto naředěné barvivo (1:1) další 1
minutu.
3. Barvivo slijeme, můžeme opláchnout vodou.
4. Na nátěr naneseme Giemsa-Romanowského barvivo. Toto barvivo musí být
před barvením vždy čerstvě naředěné přibližně 1:9 (na 10 ml destilované
vody 10 - 15 kapek barviva). Necháme působit přibližně 15 minut (10 - 20
minut).
5. Barvivo slijeme a důkladně opláchneme pod tekoucí vodou.
6. Spodní stranu sklíčka očistíme utěrkou.
7. Je vhodné ihned zkontrolovat probarvenost krevních buněk a eventuelně
preparát ještě dobarvit.
Barvení pomocí hotových barvicích sad
Výhody:
◼ rychlé (cca 1 – 2 min)
◼ roztoky již připraveny
◼ vydrží dlouho (měsíce)
◼ lze skladovat při pokojové teplotě
◼ používají se opakovaně
Nevýhody:
◼ Neposkytují tak dobré výsledky
jako klasické barvící techniky
◼ Ve výzkumu nebo při hodnocení
sporných patologických nálezu je
lepší použít klasické techniky,
přestože jsou časově náročnější
Příklady:
barvící sada Leukodif (Pliva Lachema)
Diff-Quik ( Medion Diagnostics)
Postup barvení :
Roztěr musí být suchý
1. Fixační činidlo (metanol) 5 x 1 s
2. Eozin 5 x 1 s
3. Azur 5-6x 1 s
4. Oplach (fosfátový pufr pH 7,4 nebo dest. voda)
Nechat zaschnout a pozorovat pod imerzí
Mezi jednotlivými kroky
neoplachujeme ani
nesušíme
Vyhodnocování krevního roztěru
• Pozorujeme zásadně pod imerzí
• Správná oblast pro hodnocení: kde se krvinky příliš nedotýkají
• V této oblasti prohlížet preparát při tzv. meandrovitém pohybu (C)
• Krevní diferenciál (dif): procentické zastoupení jednotlivých typů leukocytů
• Krevní obraz: kompletní hodnocení počtu a morfologie formovaných krevních
elementů
• Orientační pomůcka: na jeden leukocyt připadá asi 700 erytrocytů
Úkoly:
◼ Připravit cvičný roztěr z myší krve (jeden nebo více)
◼ Obarvit myší roztěr a orientačně prohlédnout – nevyhodnocovat !!!
◼ Vyhodnotit učitelem dodaný roztěr lidské krve:
Zakreslit jednotlivé typy krvinek (erytrocyt, trombocyty, 5 typů
leukocytů)
Vyhodnotit diferenciál (u 100 leukocytů určit typ a vypočíst z toho
jejich procentické zastoupení).
Srovnat určený diferenciál s fyziologickými hodnotami, které je
nutné vyhledat v textu ve složce☺
◼ V mezičase se seznámit s manipulací s automatickými
pipetami
Popis formovaných krevních elementů
Granulocyty:
v cytoplasmě mají granula, jádro bývá segmentované
• Neutrofil: velikost 10 – 12 μm, cytoplasma se barví slabě růžově,
jádro tmavě modré, segmentované (2 – 7 segmentů) Průměrný
počet segmentů se vyjadřuje pomocí Hynkova čísla, které odráží
stupeň zralosti neutrofilů. Granula se barví kyselým i zásaditým
barvivem a mají proto nevýraznou narůžovělou barvu, jsou velmi
malá, sotva rozlišitelná. Hlavní funkcí neutrofilů je fagocytóza
cizorodých částic a jejich rozklad pomocí lyzosomárních enzymů.
• Eozinofil: velikost 12 – 14 μm, jádro ze dvou segmentů (brýlovité),
granula větší než u neutrofilů, barví se cihlově červeně.
Hlavní funkcí eozinofilů je obrana proti endoparazitům a mohou
se účastnit i alergických reakcí
• Bazofil: velikost 9 - 11 μm, jádro protáhlé, často esovité, granula tmavě
modrá, velká, barví se stejně jako jádro, proto se jeví jakoby jádro
překrývala. Bazofily se účastní alergických reakcí.
Popis formovaných krevních elementů
Agranulocyty:
v cytoplasmě nemají granula, jádro není segmentované
• Lymfocyt: velikost 6 – 12 μm podle stupně zralost (malé, střední a velké
lymfocyty) , jádro okrouhlé hodně tmavé. Při diferenciaci (zrání) buňky
přibývá cytoplasmy, jádro je stejné. Granula v cytoplasmě nejsou pouze
drobná zrnitost. V roztěru nerozlišíme T a B lymfocyty, vetšina v periferní
krvi jsou B lymfocyty. Hlavní funkce T lymfocytů je kooperace s dalšími
imunitními buňkami při likvidaci cizorodých látek. Hlavní funkcí B lymfocytů
je produkce protilátek.
◼ Monocyt: velikost 14 – 20 μm, kulaté nebo oválně, jádro často
ledvinovitého tvaru (záleží na směru pozorování). Chromatin je
jemně zrnitý, jádro je vždy světlejší než u lymfocytů. Granula
nejsou, cytoplasma se však může jevit jako mírně zrnitá. Hlavní
funkcí je fagocytóza cizorodých částic za účelem jejího
zpracování a předložení dalším buňkám imunitního systému.
Popis formovaných krevních elementů
◼ Erytrocyty: velikost: 7 μm. Savčí erytrocyty jsou bezjaderné,
oblast kde jádro před dozráním bylo se jeví jako světlejší disk.
Erytrocyty ostatních tříd obratlovců jsou většinou oválné a mají vždy
jádro.
◼ Trombocyty: krevní destičky, u savců jsou bezjaderné, jsou to
vlastně odškrcené okrsky cytoplasmy z buněk, které se mazývají
megakaryocyty a jsou trvale v kostní dřeni. Tyto okrsky cytoplasmy
mají velikost asi 3 μm a často v roztěrech vytvářejí shluky.
Trombocyty ostatních obratlovců jsou jaderné.
Granulocyty
neutrofil
eozinofil
bazofil
Agranulocyty
lymfocyt
monocyt
trombocyt
erytrocyty
Použité zdroje:
◼ Atlas Hematologie zvířat:
http://projekty.sosvet.cz/2006_hematologie/index.htm
◼ Tichý a kol: Histologie, VFU Brno, 2000