UNI SCI masaryk university faculty of science department of experimental biology laboratory of microbial molecular diagnostics Bi5000 - Bioinformatika Technologie sekvenovani • Sekvenovani (sequencing) stanovenl poradl nukleotidu v molekule DNA-primarni struktura Důvody řešení genomových projektů Genomika modelových organismů {de novo sekvenování) ♦ Analýza mutací a SNP, výzkum genetických onemocnění (resekvenování genomů, varianty sekvencí, sequence capture) ♦ Diagnostika a identifikace (de novo sekvenování a resekvenování) ♦ Metagenomika (16S rRNA, celé metagenomy) ♦ DNA metylační studie (medip-seq, bisulfite treated DNA, ONT) ♦ Analýza transkriptomu (RNAseq), diferenciální exprese ♦ Analýza malých RNA: miRNAs, siRNA, piRNA, (small RNA seq) ♦ CHIP-seq (Chromatin imunoprecipitation sequencing) Techniky sekvenování • Klasické techniky: - Chemická (Maxamova-Gilbertova) Již se nepoužívá - Enzymová (Sangerova) * V současnosti se používá automatická varianta • Metody sekvenování nové generace (next generation sequencing, NGS) - 454 (pyrosekvenování), lonTorrent, lllumina, SoLiD • Metody sekvenování třetí generace - PacBio, NanoPore Princip sekvenačních metod ® Klasické sekvenování kapilární elektroforézou - Vyžaduje velký počet kopií vstupního materiálu DNA jako templátu ve formě jednořeťězců, abychom zachytili signál Sekvenování nové generace - Jako templát slouží jediná molekula, která je amplifikována pro získání dostatečného signálu, produkuje krátká čtení, možnost kvantitativní analýzy (SNP) Sekvenování třetí generace - Jako templát slouží jediná molekula. Nevyužívá amplifikace za účelem zvýšení signálu, produkuje dlouhá čtení Projekt Výběr platformy Příprava knihovny Sekvenování Kontrola kvality Alignment i Assembly Vizualizace a analýza Normalizace, srovnání knihoven Hledání genů, variant, vazebných míst,... Diferenciální analýza, exprese, metabolomika, Bioinformatické zpracování o Trimming, selection Pipeline (automated processing) Graphic visualization Polishing Annotation a) ATCl TCCG ATTA: .<. A A A' AA C N ,TTTCATTCACTAAAA06AC6 A A ÄTATAA j Ctorwd gentunes into variable í tied segment* Unordered wqucrtccd segment CumipuMlitiii.il jLiUľUMLľil Rrvulting nvrrLipping M-qurncr VrgmefULfrhe higher the coverage (he better tKe-quAlrly g( ihe ■-.--:■=■■=■-. ■■ is Chn(fl>ppi ntj sequence icq merits combi rwd lo construct the qmtim-dinirnnh ť) Cloned genomes Gřrwmí divided into l.irgr egmenli. of kr own arder. □Ordered 9 frmnif AT(j ľTCCCi ATTA rrTCATTCAGTAAA«-,[-,a<,C,AAATATAA Multiple gpnamr pprtipni 3re sheared intpviiiatHc vm3 vrgmenti iegrnints Compuuftanal juianuted assembly Ht-iulTing nwrkipping q u f nr. i-ti :eq mentv | The higher the coverage 1h* better ■he quality of the sequencing. Overlapping i*quert«J segment; combi net) to con si mel ThĽ rjĽncune CuíisĽn iui. , Celogenomové shotgun (náhodné) sekvenování versus postupné shot-gun sekvenování Technické požadavky pro úspěšné stanovení sekvence Fragmentace DNA zajistit dostatečné pokrytí při čtení genomu Příprava knihovny pro sekvenování molekuly s přesně definovanými konci • s místem pro vazbu primeru • s koncovou značkou Příprava variant fragmentů (ssDNA) lišících se svou délkou o jeden nukleotid • Syntéza • Degradace Detekce variant fragmentů • Přesná separace na základě jejich délky • Detekce koncové báze po jejím připojení • Kontinuální čtení Postup enzymatického sekvenování DNA 1. Příprava ssDNA jejíž sekvence má být stanovena 2. Rozdělení do 4 vzorků 3. Reakce s DNA polymerázou při níž se začlení do syntetizované DNA místo normálního deoxyribonukleosidtrifosfátu jeho analog, který působí jako koncový inhibitor syntézy DNA - dideoxynukleosidtrifosfát (ddNTP). V každém ze 4 vzorků vzniknou fragmenty, které jsou zakončeny příslušným ddNTP (ddCTP, ddGTP, ddATP a ddTTP). Reakce obsahuje: •molekulu DNA •značený primer při pojující se k části molekuly DNA (místo odkud začínáme stanovovat sekvenci) •směs obsahující 4 normální nukleotidy •jeden ddNTP (v každém ze 4 vzorků je jiný) •DNA polymerázu 4. Denaturace produktů 5. Elektroforetická separace umožňující oddělení fragmentů lišících se délkou o jednu bázi 6. Detekce fragmentů, které nesou označený konec Dideoxynukleotidy nemají hydroxy 1 na 3'-konci 23.4 DEOXYNUCLEOSIDE TRIPHOSPHATE 237 dideoxyhibose blocks elongation Pokudje dideoxynukleotid inkorporován do syntetizujícího se řetězce, působí jako terminátor reakce CH2 J BASE I Nucleotide will join on here at 3' position €K£>

break this bond HO Replikace DNA s normálními deoxynukleotidy AGCCTGG CGACCATCGT TCGGACCGCTGGTAGCA 3' AGCCTGG CGACCATCGT AGCCTGG CGACCATCGT TCGGACCGCTGGTAGCA Co se stane pokud při reakci použijete směs dGTP a ddGTP? AGCCTGGCGACCATCGT TCGGACCGCTGGTAGCA AGCCTGGCGACCATCGT A G C T C G G. G CG ta T C G T T A G C A T CG T C GG TCGGACCG TCGGACCGCTG TCGGACCGCTGG TCGGACCGCTGGTAG Enzymová metoda sekvenování DNA (Sanger) (A) deoxyribonukleosidtrifosfát dideoxyribonukleosidtrifosfát 5' G®0-O-CH2 O pY pI ň-o- 5' CH2 n base 31 OH / / je možno prodloužit řetězec na 3' -konci není možno prodloužit řetězec na 3' -konci (B) normální prekursory „ malé množství jednoho deoxyribonukleosidtri- ^ 4GCGA dideoxyribonukleosidtrifosfátu fosfátů (dATP, dCTP, TA TG^Cj (ddATP) dGTP, dTTP) IfficÍT Jvzácná inkorporace dideoxyribonukleosidtrifosfátu DNA-polymerázou zastaví další růst molekuly DNA I ~ C GAT GGAC GT AC CXTGAAGCG 3' / 5' jednořetězcová DNA, která bude sekvenována ~K. A ^ (C) 5' GCATATGTCAGTCCAG 3' dvou řetězcová 3' CGTATACAGTCAGGTC 5' DNA označený primer 5' GCAT 3' jednoretezcova 3' CGTATACAGTCAGGTC 5' DNA + nadbytek dATP dTTP dCTP dGTP + ddATP \+ DNA-polymeráza + ddTTP + ddCTP + DNA-polymeráza \ + DNA-polymeráza 1: ddGTP DNA-polymeráza GCAT A GCAT AT GCAT ATGTC GCAT ATG GCAT ATGTCA GCAT ATGT GCAT ATGTCAGTC GCAT ATGTCAG GCAT ATGTCAGTCCA GCAT ATGTCAGT GCAT ATGTCAGTCC GCAT ATGTCAGTCCAG Obraz autoradiogramu ze sekvenačního gelu A T C G seq4.mov ti * ATGC ATGC ATGC ATGC Automatické sekvenování DNA Je variantou Sangerova enzymového sekvenování DNA Knihovnu tvoří • Klonované fragmenty v plazmidových vektorech • Produkty PCR Syntéza DNA probíhá v jedné reakci Ke značení produktů se používají čtyřmi různými fluorescenčními značkami označené • primery • dideoxyribonukleotidy Strategie barevných terminátorů asymetrická PCR DENATURACE PŘIPOJENI PRIMERU SYNTÉZA Enzyme, dNTPs, dye-labeled terminators ♦ o • o ♦ AJO 0\O G]0 PRODUKTY AO A CO A CO A A A A GO C C C C C G\Tj9 C C G T\K\0 C C G T A[T]i Princip detekce produktů • Detekce produktů probíhá během elektroforézy pomocí laserového detektoru (laserem indukovaná fluorescence, LIF) napojeného na počítač, který vyhodnocuje sekvenci. CACCGCATCGaAATTAACTTCCAAAGTTAAGCTTGG ^ LASER DETEKTOR Fragmenty ■ 3161A_R40rj-ARP0D22130 - C hro m a s File Edit Options. Help □ X a? y V -+N A4 —^J— -|Sample: 3161A_R400-ARP0022130 Open Save Export Print Next Find Reverse Enhance I lli 20 4'j 5'j 17'j G T CGI C TI I I CT T CT G G T A C T T CA GC T T CCTACACG TAG A A A G G T T T A T T C C C A G ATAAAAGCA GT TTA.C. ■ 3161AJW0D-ARP0D2213D-Chromas File Edit Options Help □ X a. V S -+N Open Export Print Next Find Reverse Enhance f J |Sample: 3161A_R40Q-ARP0Q22130 E C G T G C G C C A C TT TCTTAAGGAGCAAGCCCC T T A A T A T C GTT C G A C T T G C A T G T A T T A G G C CTGCC G C T I 4'j'j 4 lij 42 j 4 i'j 4 4'j 4 5'j Príprava gelu Laserový detektor Rezervoár pufru Automatické nanášení vzorku Genetický analyzátor ABI 3100 Soustava kapilár Vyhřívaná deska Příprava knihovny pro náhodné sekvenování genomů • Při náhodném sekvenování genomu jsou nejdříve připraveny mechanickým stříháním genomové DNA fragmenty s optimální velikostí (1 300 - 2 000 bp) a po úpravě jejich konců jsou nahodile nakloňovány do vhodného vektoru za vzniku velkého počtu klonů. • Ke štěpení DNA se využívá sonikace nebo pankreatická DNáza I za přítomnosti Mn2+. Příprava knihovny pro Sangerovo sekvenování Izolace DNA Fragmentace 1300 - 2000 bp u+ Vektor C D Úprava konců a klonování ö°ö.P B C O Sestavení překrývajících se klonů AB C DE F G H I ......r ■ ■ Metody sekvenování nové generace (next generation sequencing, NGS) Liší se v provedení a chemii V základu se podobají v sekvenování tisíců až miliónů klonálně amplifikovanvch molekul (masivní paralelní sekvenování) Probíhá vývoj technik - Více čtení - Delší čtení - Rychlejší sekvenování - Nižší cena Nové aplikace v klinické oblasti, vývoj kitů cílených na určité části genomů (dědičná onemocnění nádorová onemocnění, metagenomika, 16S rRNA) Clonal Reaction Amplification Output Pyrosequencing Roche/454 Sequencing by Ligation Life Tech/SOLiD H+ Ion Generation Life Tech/Ion Torrent Reversible Dye Terminators lllumina ePCR ePCR ePCR Cluster Luminescence Fluorescence pH Change > Signal/Noise Conversion Sequence Fluorescence J • Sekvenování tretí generace Pacific Biosciences Oxford Nanophore Technologies Helicos Biosciences NABsys VisiGen Biotechnologies Vývoj technik sekvenování q Sanger sequencing 1977 I -•A "tT »pG Maxa m-Gilbert sequencing lllumlna GA Ion torrent PGM Nanopore sequencing family 2005 2006 2007 2010 2011 2014 454 Pyrosequencing ABI's SoLiO system PacBio Sequel System Life 2022, Í2(1), 30; https://doi.Org/10.3390/life12010030 Metody přípravy knihovny o Fragmentace DNA na uniformní délku • Enzymatická • Fyzikální (sonikace, nebulizace, Hydroshear) Ligace adaptorů Amplifikace Library preparation Emulsion PCR "Polony" PCR on a slide Semiconductor sequencing (Ion Torrent) Reversable terminator sequencing umina) Pyrosequencing (454) Sequencing by ligation (SOLiD) Selekce fragmentů podle velikosti E-gel Systém Weil raw for library recovery Unligated Ion adapiors i Add SPRIsele« Selekce pomocí magnetických kuliček Size Selection Separation Etna nol Wash Elution Buffer Transfer Magnet i Discard Supernatant Discard EtOH 100-200 bp size selection bp 800 A 400 200 *200 bp -100 bp 200 100 500 bp 200 bp Ligace adaptorů p5 \h index ii iri e y \ Rd2 SP UMI UMI Rd1 SP II II Rd1 SP UMI Insert UMI Rd2 SP \ pE 5' 3' Nucleic Acids Research, 46(6), doi: 10.1093/nai7gky1ffT 3' 3' N i7 index 15 index ® end repair 5'®. 3' ■ tailing 3' 51 5'(El 3* A- [Mill L 1® 3' 5' ligation mni *T A * 111111 3' 5' PCR(barcode incorporation) -T ■A ■T' + amplified library iT ■A* ■A ■T' Typy uspořádání NGS sekvenování Single Read Paired-end read (PE) Mate-pair read (MP) výsledkem jsou miliony krátkých čtení sekvencí z náhodných částí genomu Orientace párových čtení <— —> —► <— < —> <--► 4--> —► 4- < » 4- > 4- ->• Paired end (PE) reads » < pe, MP Mate pair (MP) reads ^- ->- mp Hloubka sekvenování (pokrytí) • Coverage (pokrytí) = (počet získaných čtení * průměrná délka čteníývelikost genomu • Fragment 2000 bází sestavíme z 8 čtení o délce 500 bp -> 8x500/2000 = 2 • Příklad 1: Získali jsme 106 čtení s technologií lontorrent, velikost genomu je 3 Mb. Jaké je pokrytí? • Příklad 2: Sekvenátor lllumina poskytuje 200 milionů čtení. Kolik genomů o velikosti 5 Mb mohu osekvenovat s použitím chemie poskytující čtení o délce 150 nt, abych získal pokrytí 50*? Ion Torrent polovodičové sekvenování • Nástupce pyrosekvenování (454-sekvenování) • prvním platforma, která nepoužívá pro detekci sekvenovaných bází DNA světelný signál, který by byl uvolňovaný při enzymatických reakcích s fluorescenčními nebo chemiluminscenčními substráty • Sekvenování Ion Torrent je založené na elektrochemické detekci vodíkových iontů (pH) které jsou uvolněny při replikaci sekvenovaného templátu na speciálním polovodičovém čipu. Uvolneni vodiku v nepufrujicich podminkacn O 4dNTPs 5' 3' 3' 5' dNTPs Example: Primer Template Příprava knihovny při emulzní PCR Příprava jednořetězcové DNA knihovny - Umožňuje zpracovat různé typy vzorků • genomové DNA • produkty PCR • klonované DNA - Frakcionace dlouhých úseků na 300- až 500-bp dlouhé fragmenty - Vazba dvou adaptorů specifických pro 3'- a 5'-konce na každý fragment • Adaptor A obsahuje vazebné místo pro primer • Adaptor B obsahuje 5'-biotinovou značku, která slouží k imobilizaci DNA knihovny na mikrosféry pokryté streptavidinem • Klonální amplifikace knihovny - emulzní PCR, amplifikační reagencie ve směsi voda-olej ->• mikroreaktory obsahující jedinou kuličku s unikátním fragmentem DNA z knihovny - (107) kopií • Separace kuliček a výběr pouze těch, které obsahují amplifikovanou DNA (enrichment) • Sekvenační reakce • Analýza dat a assembly lonTorrent polovodičové sekvenování • Na čipu se nachází milióny jednotlivých reakčních cell (reaktorů), ve kterých probíhá sekvenační analýza individuálních kopií DNA na základě kontinuálního střídání reakčních složek (jednotlivých typů nukleotidů) v mikrofluidním systému. • DNA imobilizovaná na mikrosférách (po emulzní PCR) • Kapacita závisí na typu použitého polovodičového chipu - 10-65 miliónů - 100-600 miliónů - > 1000 miliónů lonTorrent čip Ion Torrent polovodičové sekvenování • Technologie Ion Torrentu je otevřená pro sekvenování DNA de-novo i cílené sekvenování vybraných oblastí genomu • Minimální délka sekvenačního čtení - V jedno směru: 400bp - Obousměrné (Paired end) - Počet vzorků analyzovaných v jednom běhu - až 96 vzorků - pomocí označení tzv. barkodem • Doba sekvenační analýzy - 2 - 3,5 hodiny - podle použitého čipu Výstup z Torrent server Reail Summary: Unaligned 1.05 G Total ESiei ■III 80 % isp Loaamg ISP Density 40 Kay Signal 3,162,233 Total Raadi ml ISP Summai y 80% Loading 93% Final Library 33% Polyclonal 2% Test Fragments 0% Adapter Dimer 5% Low Quality 332 bp 330 bp 392 tip ■idlin Hadi Re.nl LeiHjtli I 100 200 300 400 500 Re^d Length Ali% GS De novo Assembler Technologie firmy Illumina/Solexa • Uvedena na trh 2006 • Prošla řadou inovací, zejména délky čtení • Masivní paralelní sekvenování („polony" sequencing) • Sekvenacování syntézou na čipu (flow cell), které využívá strategii reverzi bil nich terminátorů • Nevyžaduje klonování ani přípravu knihovny na mikrosférách • Dosahuje 99,9 % přesnosti Příprava knihovny PC R - Náhodná fragmentace DNA na krátké úseky 200 - 500 bp - Zatupení konců a vytvoření 1 nt A-přesahu na 3'-konci (T4 DNA polymeráza, Klenow a polynukleotid-kináza T4) - Navázání adaptorů umožňujících kovalentní vazbu na opticky transparentní povrch pro sekvenování - Každý fragment je na povrchu uchycen _ pouze jedním koncem, po přidání enzymů pro amplifikaci dochází k ohnutí fragmentu do „mostu". - Výsledkem amplifikace jsou dva řetězce, každý s jedním volným a jedním pevným koncem - Po denaturaci jsou fragmenty narovnány a uspořádány do shluků, ve kterých je dosažena značná hustota, až 1000 kopií fragmentu na pm2 povrchu - Na celém povrchu je dosaženo hustoty deseti milionů shluků na cm2 polony I i I o Bridge amplification: initiation OH 1 Ml P7 P5 Grafted nowcell Template hybridization ii ii ii ii ii initial extension Dena Unfit ion On the surface: complementary oligos u diôl diol J_L 1st cycle denn t illation U diol diol J_L Ist cycle annealing i diol did J_L 1st cycle extension Ü diol did J_lU 2nd cvcle extension Gm Core u diol d. □ read_Q03d377b-6clf-4 «■ □ read_Q0907da5-c64e-«- Cj read_00adbSea-c214-*■ Cj read_00bf55f7-e843-4 > Cj read_00cc574b-f0b0-4 > Cj read_00cf295d-5cdf-4( l Cj read_00d55ae3-96b0-«- □ read_00f9a80d-7cef-4 o-£jread_0113347f-c7e3-4 III IL Clear Text I TexMew - Fastq - /read_000265a2-68fa-4e93-9056-214bfcacl8dl/Analyses/Basecall_lD_0Q0/BaseCalled_template/ - FAK84752_484f7064fad,.. [jf 0 Text Data selection: ;a000265a2-6Bfa-4e93-9Q56-214bfcaclBdl runid=4B4f7064fad5f5c89fec89B46473c6da08bbc5eb read=742 ch=4Q9 start_tirne=2019-07-18T15:43:06Z flow_cell_id=FAK84752 protocol_group_id=P40 sample_id=P40 ATCAmGGGTGmMCCGTTTTTCGCATTATCGTGAMCGCmCGCGT^^ ACTTAATTTCTTCACC ATTAAGTGTMTATAATTTCTC CMG CAC CTTTAGTAATCAAG C C CTTTCTACTGCTTCTTG ATATAC MCATTTTGTGG GTCTAAAC C ATTAATTMTGTC CCATCAGnMTTCCCATTCGGATAGTAGnGAGCTTCTGCTTnGGnAGGTCnGATAGTnAGACTTrnAGTnCMTACGCATM TAGCTmGAnGTmMmGAGCTCCmGmACmMTACGTAMCnGCCGCATGTTCAMTGCTCTACCACCAGTGGACnAATAGGGTCAT: + + ###r-(&,32556>i@@79BCC<:6BFEIi:==DCNNI==^^ >(06953.34@ABC@;EB@;B+0&*;=>@DDDEHHC?AMEE;«=?89==?B>DGC:EID4950:;>A56<;-/388;?CB??BCDD565579?>?<=ADA?><::88<8412-]$*-.0»;«466>A:KF? 39><6Sl<=<:2%%*37HC?9,1 + .-21>AF8<9:F2DDCD77GAC>660/-BEE554-,/0=;;EB;7:20.%r]2g9/0g<7B?D-cEICCA»DB=65-l' ]TableView - Trace ■ /read_Q0Q265a2-68fa-4e93-9056-214bfcacl8dl/Analyses/Basecall_lD_000/BaseCalled_template/ ■ /home/nanopore/DAT,,, 0" 0 Table 10 93 105 99 102 100 101 101 100 102 100 103 107 170 171 133 134 oa 04 30 12 43 43 43 43 43 43 70 33 47 47 47 jjTableView - Signal - /read_000265a2-68fa-4e93-9056-214bfcacl8dl/Raw/ - /home/nanopore/DATA/MinlON_runs/P40/P40/2Q190718_1512_M... S Table 0, 0 700 Lineplot - /read_000265a2-6Bfa-4e93-9056-214bfcac18d1 /Raw/Signal - by column 0 0 769 1 462 2 447 3 437 4 446 5 433 6 454 7 458 8 485 9 370 752 484f7064fad5f5c89fec89846473c6da08bbc5eb 0.fast5 [ d TabfeWew - Trace - /read 000265a2-68fa-4e93-9056-214bfcaclMIP -0 5972 !s/Basecall_lD_000/BaseCalled_template/-/home/nanopOre/DATA/MinlON_runs/P40/P40/20190718_1512 78_FAK84752_995eb019/fast5_pass/FAK84752_484f7064fad5f5c89fecB9846473c6da08bbc5eb 0.fast5 [ dirnsOxl, startOxO, count2582x8, stridelxl ] TableWew - Signal - /read Q00265a2-68fa-4e93-9Q56-214bfcacl8dl/Raw/ - /home/nanopore/DATA/MinlON runs/P40/P40/20190718 1512 MN31278 FAK84752 995eb019/fast5 pass/FAK84 752 484f7064fad5f5c89fec89846473c6da08bbc5eb O.fastS [ dimsO, startO, count5672, stridel I I s Log Info [ Metadata Srovnání sekvenačních metod Srovnání metod pro sekvenování Metoda Příprava knihovny Klasické Maxam-Gilbert (chemická) Radioaktivně značené ssDNA Sanger (enzymová) Inzerty v plazmidových vektorech / produkty PCR NGS 454 (pyrosekvenování) Emulzní PCR Polovodičové (lonTorrent) Emulzní PCR lllumina Polony PCR Solid Emulzní PCR + imobilizace Třetí generace PacBio Ligace adaptorů se smyčkou Nanopore Ligace adaptorů + molekulární motor Helicos Ligace adaptorů Srovnání metod pro sekvenování Metoda Princip reakce Klasické Maxam-Gilbert (chemická) Degradace chemickými činidly Sanger (enzymová) Syntéza DNA polymerázou s terminátory, elektroforéza NGS 454 (py rose kve n ování) Syntéza DNA polymerázou, detekce pyrofosfátu (PP) Polovodičové (lonTorrent) Syntéza DNA polymerázou, detekce H+ lllumina Syntéza DNA polymerázou s reverzibilními terminátory Solid Série ligací sond + posun rámce Třetí generace PacBio Syntéza DNA polymerázou Nanopore Měření změn el. potenciálu při průchodu inertní membránou Helicos Syntéza DNA polymerázou s reverzibilními terminátory o Srovnání metod pro sekvenování Metoda Délka čtení Klasické Maxam-Gilbert (chemická) 150-300 nt Sanger (enzymová) 600- 1200 nt NGS 454 (py rose kve n ování) 500 nt Polovodičové (lonTorrent) 400 nt lllumina 1x 300 nt, 2x 150 nt, 2x 75 nt Solid 30 - 40 nt Třetí generace PacBio 10-15 kb Nanopore > 10 kb Helicos 200 nt Srovnání metod pro sekvenování Metoda Uspořádání Klasické Maxam-Gilbert (chemická) Single read Sanger (enzymová) Single read, Pair-end read NGS 454 (pyrosekvenování) Single read, Pair-end read Polovodičové (lonTorrent) Single read, Pair-end read lilu mina Single read, Mate-pair read Solid Mate-pair read Třetí generace PacBio Single read Nanopore Single read Helicos Single read