Blokové cvičení z Metod aplikované biochemie a buněčné biologie 2024 Jméno: Stanovení aktivity b-cateninu [DEL: :DEL] [INS: Modelový systém: :INS] [INS: :INS] [INS: HEK 293 :INS] [INS: T-REx™-293 :INS] [INS: – Human Embryonal Kidney – epiteliální charakter (Odkaz: :INS] [INS: https://www.lgcstandards-atcc.org/products/all/CRL-1573.aspx?geo_country=cz :INS] [INS: ) :INS] [INS: [DEL: :DEL] :INS] [INS: [DEL: Konkrétně se jedná o derivát :DEL] :INS] [INS: [DEL: T-REx™-293 Cell :DEL] :INS] [INS: [DEL: Line, který je odvozen od HEK 293 buněk, transdukovaných :DEL] :INS] [INS: [DEL: velkým :DEL] :INS] [INS: [DEL: T antigenem :DEL] :INS] [INS: [DEL: z viru SV40 :DEL] :INS] [INS: [DEL: , a umožňuje použití :DEL] :INS] [INS: [DEL: Tet-On systému. Tento model používáme, protože buňky dobře rostou a lépe odpovídají na stimulaci :DEL] :INS] [INS: [DEL: Wnt dráhy než původní HEK 293 buňky. :DEL] :INS] [DEL: Modelový systém: :DEL] [DEL: :DEL] [DEL: HEK 293 – Human Embryonal Kidney – epiteliální charakter :DEL] [DEL: https://www.lgcstandards-atcc.org/products/all/CRL-1573.aspx?geo_country=cz :DEL] [DEL: :DEL] [DEL: :DEL] [DEL: :DEL] d DVL2 d DVL2 Agonista antagonista https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0301468117300774 A) V nepřítomnosti Wnt ligandů nebo při zablokování dráhy (např. v extracelulárním prostoru pomocí DKK1 nebo SFRP) je cytosolický β-catenin konstitutivně fosforylován v destrukčním komplexu, který zahrnuje proteiny APC, CK1, AXIN a GSK3. Tento fosforylovaný β-katenin je následně ubiquitinován a degradován v proteasomu. E3 ubiquitin ligázy ZNRF3 a RNF43 přidávají ubiquitinové značky na receptory Frizzled a LRP, což vede k jejich destabilizaci a inhibici Wnt signalizace. B) Po vazbě Wnt ligandů (např. Wnt3a) na jejich receptory LRP5/6 a Frizzled dochází k fosforylaci proteinu DVL2, což vede k inhibici destrukčního komplexu. β-catenin se hromadí v cytosolu, následně se translokuje do jádra, kde se váže na transkripční faktor TCF/LEF, a umožňuje tak transkripci cílových genů této signální dráhy. R-spondin (RSPO) posiluje Wnt signalizaci vytvořením ternárního komplexu s LGR proteiny a ZNRF3/RNF43, což indukuje autoubiquitinaci ZNRF3/RNF43, vedoucí k jejich degradaci v proteasomu. Tento proces je dále zesílen přítomností 1 µM LGK-974 (Stock solution – SS: 1 mM), inhibitoru acyltransferázy porcupine, která normálně acetyluje Wnt v endoplazmatickém retikulu a umožňuje jeho sekreci. V přítomnosti LGK-974 není endogenní Wnt sekretován, což zvyšuje citlivost buněk na exogenní Wnt stimulaci. [INS: [DEL: :DEL] :INS] [DEL: :DEL] Wnt3a b-catenin RNF43 RSPO Ve zkratce: > > Vzorky: 1. –CTR bez LGK-974 = catenin kontrolní hladina před ovlivněním exportu Wnt (450 ul DMEM) 2. CTR = catenin kontrolní hladina (450 ul DMEM + 0,45 ul LGK) 3. WNT3a = catenin (300 ul DMEM + 150 ul CM Wnt3a + 0,45 ul LGK) 4. RSPO = catenin (300 ul DMEM + 150 ul CM RSPO + 0,45 ul LGK) 5. WNT+ RSPO+ = catenin (150 ul DMEM + 150 ul CM Wnt3a + 150 ul CM RSPO + 0,45 ul LGK) PROTOKOLY Transfekce buněk Buňky vysejeme den předem (50x10[INS: ^ :INS] [DEL: * :DEL] 3 b na jamku v 24W desce - do 0,5 ml DMEM) Zkontrolovat, jestli je konfluence 70 – 80 % Příprava transfekčních směsí – na 1 jamku: SS plazmidu 500ng/ul 1. 100 ul DMEM pure + 150 ng každého plazmidu (celkem 0,45 ug DNA) výpočet: 500 ng…. 1 ul 150 ng…. 0,3 ul 2. 100 ul DMEM pure + 1,35 ul PEI (poměr DNA : PEI = 1:3, tj. 0,45x3 = 1,35)[INS: :INS] pRLtkLuc Super8X TOP Flash pmax GFP Výpočet: DMEM pure 345 368 251 PEI 1 jamka 100 0,3 0,3 0,3 1,35 ul 5+1 jamek 600 1,8 1,8 1,8 8,1 ul Připravené transfekční směsi důkladně zvortexujeme, krátce stočíme a necháme 10 minut inkubovat při RT. Obě zkumavky smícháme, důkladně promícháme a opět 10 minut inkubujeme při RT. Do každé jamky přidáme 203 ul výsledné transfekční směsi. Po 3 hodinách odsajeme vše[INS: chno médium :INS] z[DEL: :DEL] [INS: :INS] jamek[INS: a :INS] [DEL: , :DEL] přidáme do [INS: nich :INS] [DEL: vzorků :DEL] 150 ul DMEM s 0,45 ul LGK (2,25 ul LGK + 750 ul DMEM) a 150 ul kondiciovaného média (CM) s WNT3a (W+) nebo R-spondinem (R+) (dle rozpisu vzorků). Doplníme do 450 ul DMEM. Do kontroly bez LGK přidáme jen 450 ul DMEM. Kontrolu označenou 0 vůbec nezpracováváme – je to kontrola bez ovlivnění. Vše inkubujeme přes noc v inkubátoru [INS: při :INS] 37°C. Stanovení účinnosti transfekce 1. [INS: Mikroskopicky :INS] [INS: – Fluorescenci vzorků, vyvolanou expresí plazmidu pMAX s GFP, budeme snímat pomocí fluorescenčního mikroskopu. K tomu použijeme kombinaci modrého excitačního světla a zeleného emisního filtru, přičemž udržujeme mírné osvětlení v průchozím světle, abychom m :INS] [INS: ohli identifikovat nejen fluorescenční (pozitivní) buňky, ale také celkový počet buněk v zorném poli. Výsledná účinnost transfekce je dána poměrem počtu pozitivních buněk k celkovému počtu buněk. :INS] [DEL: Mikroskopicky :DEL] [DEL: - Fluorescenci vzorků způsobenou expresí plazmidu pMAX s GFP nafotíme na :DEL] [DEL: fluorescenčním mikroskopu :DEL] [DEL: kombinací :DEL] [DEL: modrého světla a :DEL] [DEL: zeleného filtru :DEL] [DEL: při zachování mírného osvětlení průchozím světlem :DEL] [DEL: , abychom byli schopni určit jak množství svítících buněk, tak počet všech buněk v zorném poli. Výsledek je poměr pozitivních buněk ku všem buňkám :DEL] . Výsledek: Účinnost transfekce PEI je přibližně %. 2. Pomocí ELISA readeru – lyzát vytvořený pro metodu TopFlash změříme na fluorimetru Hidex Sense při excitační vlnové délce 480 nm a emisi 509 nm. Srovnáme s netransfekovanou kontrolou. Výsledek: Účinnost transfekce PEI je přibližně %. Metoda TopFlash = Dual Luciferase Assay (kit Promega ) Odsajeme médium Přidáme opatrně 1 ml PBS, odsajeme, na sucho inkubujeme v -80 °C/ 5-10 min Rozmrazíme pufr LAR II a Stop & glow buffer Naředíme si 5x lyzační pufr – 1 jamka 50 ul, 6+1 jamek 350 ul, tj. 280 ul MQ H[2]O + 70 ul 5x lysis buffer Přidáme 50 ul 1x lyzačního pufru do každé jamky a inkubujeme 15 min/RT na třepačce Naředíme si 100x Stop & glow reagent v Stop & glow buffer (25 ul na jamku, 6+2 vzorky tj. 200 ul) Výpočet: ul Stop & glow buffer + ul Stop & glow reagent = 200 ul Nachystáme si luminometr Hidex Sense a stripy na měření Do jamek stripu nakapeme 20 ul lyzátu z každého vzorku (důkladně zhomogenizovaného) U luminometru velmi rychle přikápneme 25 ul LARII substrátu pro firefly (FF) luciferázu Změříme chemiluminiscenci Přidáme Stop & glow roztok pro renilla (R) luciferázu (inhibice aktivity FF luciferázy + substrát pro R luciferázu) Změříme chemiluminiscenci Výslednou hodnotu spočítáme jako podíl FF luciferázy a R luciferázy Výsledek: Zde napište stručné shrnutí výsledků, výpočty zpracujte do samostatné přílohy. [DEL: :DEL] [DEL: :DEL] [DEL: :DEL] qRT-PCR Izolace mRNA Den předem byly vysety buňky (1[INS: , :INS] 50 x 10^[INS: 5 :INS] [DEL: 3 :DEL] v 150 ul) a k buňkám byla přidána CM a LGK dle rozpisu. Vzorky opatrně opláchneme PBS a poté přidáme 0,5 ml Trypsin/EDTA, 5 min inkubace v 37 °C. Buňky přeneseme do eppendorfky, stočíme (200g/5 min), odstraníme supernatant. K peletu přidáme 350 μl lyzačního pufru RLT s 1 % merkaptoethanolem (Sigma Aldrich), důkladně zvortexujeme 30 sec, rychle stočíme a necháme inkubovat v RT 5 min. Výpočet: 5+1 vzorků = ul RLT + ul merkaptoetanolu K izolaci mRNA použijeme návod z komerčního kitu CatchGene - Cell and tissue kit. Přidáme 350 ul pufru RB, důkladně zvortexujeme 30 sec, rychle stočíme a znovu inkubujeme 5 min v RT. Vzorky přeneseme do kolonky vložené do 2 ml sběrné zkumavky. Centrifugace na max/1 min, vyměníme sběrnou zkumavku (RNA navázána na kolonku). Přidáme 700 ul pufru RW1, centrifugace na max/1 min, vylejeme proteklou tekutinu (promývání) Přidáme 700 ul pufru RW1, centrifugace na max /1 min, vylejeme proteklou tekutinu (promývání) Přidáme 700 ul pufru RW2, centrifugace na max /1 min, vyměníme sběrací zkumavku (promývání) Centrifugujeme na max /3 min Vyměníme 2 ml zkumavku za 1,5 ml zkumavku, přidáme 30 ul RNase-free H[2]0, inkubace 2 min v RT Centrifugujeme na max /1 min (eluce) Eluát ještě jednou naneseme do kolonky a znovu zcentrifugujeme na max /1 min Naředíme si 1 ul vzorku + 9 ul RNase free H[2]O a změříme koncentraci vyizolované mRNA na spektrometru NanoDrop® ND-1000 Spectrometer (Thermo Fisher Scientific). Izolovanou celkovou RNA uchováváme v –80 ˚C. Přepis mRNA do cDNA = reverzní transkripce Reverzní transkripce slouží k vytvoření templát[INS: ové :INS] [DEL: u :DEL] DNA (cDNA = complementary DNA), který bude vstupovat do polymerázové řetězové reakce (PCR). Celý proces je založen na použití reverzní transkriptázy, což je RNA[INS: - :INS] [DEL: :DEL] dependentní DNA[INS: :INS] [DEL: - :DEL] polymeráza. Po celou dobu práce je nutné vzorky uchovávat na ledu kvůli jejich nestabilitě. PRÁCE NA LEDU! Z celkové RNA odebereme 1 ug (výpočet), který doplníme RNase free H[2]O do objemu 12 ul. Přidáme 1 μl [INS: ( :INS] 0,5 ug/ul[INS: ) :INS] [DEL: M :DEL] Oligo(dT), inkubace vzorků 5 minut při 65 ˚C (PCR cykler). Přidáme 4 μl 5x RT reakčního pufru, 2 μl 10 mM směsi nukleotidů dNTP a 1 μl (200 U) RevertAid reverzní transkriptázy (vše Thermo Fisher Scientific). Zamícháme a krátce centrifugujeme, inkubace v cykleru hodinu při 42 ˚C a dalších 10 minut při 70 ˚C pro denaturaci enzymu, čímž ukončíme reakci. Vzorky cDNA jsou skladovány při -20 ˚C. [INS: :INS] [INS: :INS] [INS: :INS] Výpočet: Vzorek koncentrace RNA 1 ug RNA (ul) H[2]O (do 12 ul) Reakční mix pro RT: 1 vzorek 5+1 vzorků 5x RT reakční pufr 4 ul dNTP 2 ul RevertAid RT 1 ul [DEL: :DEL] Real time PCR 1. Do každé jamky (20 ul) patří: 1,5ul cDNA templátu 18,5 ul Master mixu: 3 ul 2xcc Roche - LighCycler 480 SYBR green I master kit (směs nukleotidů, FastStart Taq DNA polymeráza, SYBR green, MgCl[2]) 0,375 ul každého z primerů (SS 20 uM) vypočítej výslednou koncentraci: 1,7 ul MgCl[2] (SS 25 mM) vypočítej výslednou koncentraci: Doředit do 18,5 ul sterilní RNase-free MQ H[2]O Detekované geny: HPRT, ZNRF3, Axin2, cyklin D1 Sybr green 1. primer 2. primer MgCl[2] H[2]O 1 vzorek 3 0,375 0,375 1,7 13,05 ul 10+4 vzorků 42 5,25 5,25 23,8 182,7 ul Do jamek na dno napipetovat v duplikátu (vedle sebe) master mix pro daný gen Přidat 1,5 ul cDNA všech vzorků (podle rozpisu) jako kapku na horní část jamky HPRT ZNRF3 Axin2 CD1 Zcentrifugovat 5 min/4 °C, vložit do LC 480 (Roche) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A -CTR B CTR C W D R E W+R F G H [INS: :INS] [DEL: :DEL] Dopiš do obrázku teploty[INS: :INS] [DEL: a dobu :DEL] [DEL: pro jednotlivé fáze :DEL] [INS: a časy :INS] [DEL: :DEL] [DEL: :DEL] [DEL: cyklu :DEL] [INS: :INS] 40 cyklů[INS: :INS] [DEL: :DEL] [DEL: :DEL] [INS: :INS] Vyhodnocení podle maxima 2. derivace křivky [INS: :INS] [INS: :INS] [INS: :INS] [INS: :INS] [INS: :INS] [DEL: :DEL] Výsledek: Zde napište stručné shrnutí výsledků, výpočty zpracujte do samostatné přílohy. [DEL: :DEL] [DEL: :DEL] [DEL: :DEL] Western blotting Příprava SDS lyzátů Den předem byly vysety buňky (1[INS: , :INS] 5[DEL: 0 :DEL] x 10^[DEL: 3 :DEL] [INS: 5 :INS] v 150 ul) a k buňkám byla přidána CM a LGK dle rozpisu. Ze vzorků odsajeme médium a opatrně přidáme 0,5 ml PBS, které také odsajeme Přidáme 100 ul Laemmli lyzačního pufru ([DEL: sodium dodecyl sulfate, :DEL] 2 % SDS[INS: (sodium dodecyl sulfate,) :INS] , 10 % glycerol a 100 mM TRIS pH 6,8, 0,0[INS: 0 :INS] 5 % bromfenolová modř, [DEL: 2 :DEL] 5% merkaptoetanol). Inkubujeme 10 minut na ledu a následně přeneseme do zkumavek (vzorky je možné uchovávat v -20 °C). PRÁCE NA LEDU! Rozbití buněčných struktur a DNA provedeme sonikací a vařením na 95 °C/5 min v bločku. SDS-polyakrylamidová gelová elektroforéza (SDS-PAGE) 2x polyakrylamidový gel 8 %, tloušťka 1,5 mm, 15 jamek Před nanesením vzorků na gel je důkladně zvortexujeme. Do každé jamky v gelu napipetujeme 20 μl z každého vzorku a do krajních jamek napipetujeme 1,5 μl barevně značeného proteinového standardu (PagerRuler Plus Prestained Protein Ladder, ThermoScientific) dle rozpisu. Elektroforéza 130 V 1 hodinu (proteiny, jež díky SDS získaly záporný náboj, migrují ke kladné elektrodě). Wet blotting Přeneseme gely s proteiny rozseparovanými podle MW na metanolem aktivovanou PVDF (Polyvinylidene difluoride) membránu (Immobilon-P membrane, Merck, Kenilworth, USA)[INS: . Při vytváření :INS] [DEL: , vyrobíme :DEL] tzv. sandwich[INS: e :INS] [DEL: , :DEL] důležité je myslet na to, že proteiny migrují ke + elektrodě a musí přitom přejít z gelu na membránu. Složení použitých roztoků: Transferujeme proteiny na PVDF 100 V/70 minut, membránu vyjmeme, opláchneme promývacím pufrem. Blokujeme nespecifické vazby protilátek pomocí inkubace 20 minut v blokačním pufru (5 % roztok netučného sušeného mléka rozpuštěného v promývacím pufru). Imunodetekce Nařežeme membránu na proužky podle markeru molekulární hmotnosti tam, kde předpokládáme výskyt hledaných proteinů podle barevných standardů. Proužek vložíme do 50 ml falcon zkumavky, ve které jsou 3 ml roztoku blokačního pufru s příslušnými specifickými I. Ab protilátkami v příslušné koncentraci (viz obrázek). Inkubujeme přes noc 4 °C, na rolleru Studenti [INS: :INS] Kontrola[INS: Studenti Kontrola :INS] kDa 250 130 100 72 55 35 Total LRP6 150-250 kDa (1:1000) DVL2 90-95 kDa Tubulin alfa 55 kDa (cs-5335S, 1:1 000) R kDa 250 130 100 72 55 35 pS1490-LRP6 150-250 kDa (cs-2568, 1:1 000) R Aktivní b catenin (ABC), 92 kDa (Millipore5665, 1:1000) M [DEL: :DEL] [INS: :INS] [DEL: CK1 45 kDa :DEL] [INS: Actin beta, 42 k :INS] [INS: Da :INS] - [INS: :INS] M[INS: :INS] [INS: - :INS] K[DEL: :DEL] [INS: :INS] K[DEL: :DEL] [INS: :INS] W[INS: :INS] R [INS: :INS] WR[INS: :INS] M [INS: - :INS] K K [INS: :INS] W [INS: :INS] R [INS: :INS] WR [INS: :INS] M [INS: :INS] -[INS: - M :INS] [INS: -K K W R WR M -K K W R WR M - :INS] Doplňte chybějící informace o výrobci Ab a řed[DEL: e :DEL] [INS: ě :INS] ní[DEL: , :DEL] [DEL: :DEL] a druhové specifitě. Membrány druhý den přemístíme do misky a třikrát opláchneme promývacím pufrem po dobu 10 minut (shaker). Připravíme nové [INS: 50 ml :INS] falcon[DEL: k :DEL] y s 3 ml blokačního pufru se sekundárními protilátkami (II. Ab), konjugovanými s křenovou peroxidázou, ředěnými 1:5 000. Do II. Ab vložíme opláchnuté membrány (dle druhové specifity I.Ab) a inkubujeme na rolleru 60 minut/RT. Membrány přemístíme do misky a třikrát opláchneme promývacím pufrem po dobu 10 minut (shaker). Nachystáme si substrát pro peroxidázu s obsahem peroxidu vodíku a luminolu (Immobilon Western Chemiluminescent HRP substrate, Merck Millipore) – smícháme obě složky v poměru 1 ml : 1 ml. Membrány uspořádáme do původní podoby a zalijeme substrátem, který špičkou rovnoměrně rozmístíme a překryjeme fólií. Detekci signálu provedeme pomocí programu FusionSL a zařízení s CCD kamerou (Fusion SL, Vilber), které detekuje chemiluminiscenci vzniklou oxidací luminolu po rozštěpení peroxidu vodíku peroxidázou. Výsledek: Zde napište stručné shrnutí výsledků, [DEL: výpočty :DEL] zpracujte do samostatné přílohy. Závěr: Celkové zhodnocení všech výsledků