Průtoková cytometrie flow cytometry (FCM) Bi6589 Laboratorní a bioinformatické metody rostlinné biosystematiky Průtoková cytometrie Black box Informace Průtoková cytometrie Black box Informace C:\old_comp\c\DOKUMENTY\osobni\labiny2014\IMG_2365.JPG Průtokový cytometr Srdce cytometru = průtoková kyveta C:\old_comp\c\DOKUMENTY\osobni\labiny2014\IMG_2362.JPG http://www.abcam.com/ps/CMS/Images/Flow-Cytometry-how%20it%20works-Diagram.jpg Funkce průtokové kyvety •Separace částic v proudu unášecí kapaliny •Počátek měření optických vlastností částic •Velikost částic: 0,2-200µm Průtoková cytometrie Měření optických vlastností malých částic, které jsou uvedeny do pohybu. Fluorescence (Excitace/emise) Zástin paprsku; Rozptýlené světlo = Forward scater Odraz paprsku; Boční světlo = Side scater Optické vlastnosti částic Částice: pylová zrna, mikroorganismy, buňky, buněčná jádra, apod. zesilovač laser detektor fluorescence zapisovač značená jádra vzorku a standardu unášecí tekutina vzorková tryska menší částice větší částice pozice vzorku x hmotnost jader standardu (pg) hmotnost jádra vzorku (pg) = --------------------------------------------------------------------- pozice standardu pozice standardu pozice vzorku Osa x ≈ intenzita flurescence Co se děje v průtokové kyveta? Základní výhoda cytometru: rychlá analýza velkého množství částic hydrodynamická fokusace fluorescence Pojmy Osa X = optické vlastnosti částic Přesnost měření je stanovená pomocí variačního koeficientu (CV). směrodatná odchylka CV = x 100 průměrná pozice píku Standard = organismus se známou velikostí stanovovaných hodnot (velikost genomu, GC obsah, atd.) Fluorescenční barvy §Způsob navázání: neselektivní (PI, EB); selektivní na AT báze (DAPI, DIPI, Hoechst); preferující GC báze (některá antibiotika) §Excitační a emisní vlnová délka Pojmy C:\old_comp\c\DOKUMENTY\osobni\labiny2014\IMG_2362.JPG http://www.bio.miami.edu/dana/pix/visible_spectrum.jpg Excitation: green laser 536 nm Propidium iodide (PI) http://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/structure8/011/mfcd00011921.eps/_jcr_content/ renditions/mfcd00011921-medium.png 617 nm Fluorescence Day Factor (DF) §Důležitý pro výpočet GC obsahu; poměr poměrů (vzorek/standard(DAPI) ku vzorek/standard(PI)) Excitovaný stav je nestabilní a elektrony se vzápětí vracejí zpět do původního, základního stavu. Tento přechod bývá doprovázen uvolněním tepelné a světelné (= fluorescence) energie. Protože část energie se ztrácí ve formě tepla, má vyzářené světlo jinou (delší) vlnovou délku než původní záření. Vhodně zvolenou kombinací filtru lze pak obě záření oddělit (emisní od excitačního). Jak se připravuje vzorek pro cytometrické stanovení velikosti genomu? Co odebírat §Živý materiál (nejčastěji list) §Semena §Vzorky ze silikagelu/herbáře §Pyl § K čemu přihlížet při odběru §ontogenetické stáří §intenzita oslunění a množství sekundárních metabolitů §způsob uchování vzorku (semena vs. pletivo) Volitelné §Extrakční pufr §Standard Příprava rostlinného materiálu k měření http://www.sos-medequip.com/652-1546-thickbox/biohit-proline-automatic-pipette.jpg Bel-Art 146460000 Urbanti® Plastic 100mm High-Speed Analytical Filter Funnel, TPX® Polymethylpenten http://www.sos-medequip.com/652-1546-thickbox/biohit-proline-automatic-pipette.jpg C:\old_comp\c\DOKUMENTY\osobni\labiny2014\IMG_2365.JPG 4. přidáme fluorochrom 3. zfiltrujeme do zkumavky 1. pufr + kousek listu http://ecx.images-amazon.com/images/I/315vmAqR9zL._SL500_AA300_.jpg http://s3.amazonaws.com/rapgenius/filepicker%2Fdx88U9QfSSqEqRH1MKzA_razorblade.jpg 2. posekáme žiletkou 5. zkumavku zasuneme do stroje Velikost genomu – příprava vzorku Doba přípravy a měření vzorku: 10 minut Cena měření: 15 Kč Jak hmotnost DNA v jádře změřit? Sekvenace celého genomu Průtoková cytometrie zdlouhavá rychlá levná drahá jednoduchá složitá živý materiál živý/sušený/zamražený materiál K čemu je to dobré? Průtoková cytometrie Měření optických vlastností malých částic, které jsou uvedeny do pohybu. Fluorescence (Excitace/emise) Zástin paprsku; Rozptýlené světlo = Forward scater Odraz paprsku; Boční světlo = Side scater Optické vlastnosti částic Částice: pylová zrna, mikroorganismy, buňky, buněčná jádra, apod. Zdroj taxonomických znaků (stálé; k dispozici i ve sterilním stavu; mitoticky neaktivní chromozomy) §Velikost genomu §GC obsah §Ploidní úroveň (cca karyotyp) §Endopolyploidizace (zásobní orgány) §Vnitrodruhová variabilita (aneuploidie; B-chromozomy vs. zvětšení/zmenšení chromozomů) §Identifikace holocentrických vs. monocentrických chromozomů K čemu je to dobré? půdní měňavka Chaos chaos Jádro váží 0,0023 pg Jádro váží 1400 pg Jádra se liší 600 000 krát !!! Diverzita genomů Střevní parazit Encephalitozoon intestinalis Slunce a Země se hmotnostně liší „jen“ 330 000 krát ! Země Slunce Trpaslík Obr http://leesbirdblog.files.wordpress.com/2009/08/2-common-ostrich-struthio-camelus-massaicus-by-bob- nan.jpg http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/f/fb/Archilochus-alexandri-003.jpg Archilochus alexandri 0,9 pg kolibřík černobradý Struthio camelus 2,2 pg pštros dvouprstý 2,4x U mnohobuněčných organizmů rozdíly často menší Ptáci Existují i opačné případy – extrémních rozdílů 300 pg Paris japonica Genlisea aurea 0,1 pg 3000x krytosemenné rostliny Holocentrické chromozomy Monocentrické chromozomy Rostoucí nestresovaná rostlina UV záření Holocentrický vs. mononocentrický chromozom? Rozrůznily se velikosti genomu náhodně nebo adaptivní evolucí? http://turfmutt.discoveryeducation.com/images/Stoma_GuardCells.jpg http://thumbs.dreamstime.com/x/cell-nucleus-14279900.jpg http://tuebingen.mpg.de/uploads/RTEmagicP_Arabidopsis_02.jpg velké jádro se do malé buňky nevejde velké průduchy se nemohou rychle zavřít velký pyl se se hůř transportuje velká jádra se pomalu dělí http://1.bp.blogspot.com/_mTtLMFeSCqU/TLXSt_p9WEI/AAAAAAAAACI/b7yE_ba7EBo/s200/wind+pollination.gif http://jacquelinechurch.com/wp-content/uploads/2013/03/pollen17Birch.jpg http://www.edupic.net/Images/Mitosis/anaphase.png Velikost genomu ovlivňuje vlastnosti organizmů http://3.bp.blogspot.com/-BItPj0pQmB0/UYJQjkQvSvI/AAAAAAAAF-8/mgp_LL36eqo/s400/preg+stomach+right.j pg Proč se Mendelův hrách nestal modelem současných genetiků ? Má genom moc velký !!! 9 pg http://www.biologie.uni-hamburg.de/b-online/e08_mend/mendel.jpg Druh s malým genomem = ideální model pro genetiku ! Znalost velikosti genomu má i metodické důsledky http://www.mpg.de/7529598/zoom.jpg Arabidopsis thaliana 1C = 0,32 pg Zdroj taxonomických znaků (stálé; k dispozici i ve sterilním stavu; mitoticky neaktivní chromozomy) §Velikost genomu §GC obsah §Ploidní úroveň (cca karyotyp) §Endoreduplikace (zásobní orgány) §Vnitrodruhová variabilita (aneuploidie; B-chromozomy vs. zvětšení/zmenšení chromozomů) §Identifikace holocentrických vs. monocentrických chromozomů Souvislosti §Ekologické (odolnost k mrazu, rychlost ontogeneze, pravděpodobnost invazibility) §Fenologické (nástup kvetení) §Fyziologické (velikost buněk) §Metodické (vytypování organizmů pro sekvenování) K čemu je to dobré? SEX? Koho to zajímá?! Zdroj taxonomických znaků (stálé; k dispozici i ve sterilním stavu; mitoticky neaktivní chromozomy) §Velikost genomu §GC obsah §Ploidní úroveň (cca karyotyp) §Endoreduplikace (zásobní orgány) §Vnitrodruhová variabilita (aneuploidie; B-chromozomy vs. zvětšení/zmenšení chromozomů) §Identifikace holocentrických vs. monocentrických chromozomů Souvislosti §Ekologické (odolnost k mrazu, rychlost ontogeneze, pravděpodobnost invazibility) §Fenologické (nástup kvetení) §Fyziologické (velikost buněk) §Metodické (vytipování organizmů pro sekvenování) Sex §Způsob rozmnožování (sexuálové vs. apomikti) §Mezidruhová hybridizace (identifikace hybridů; rozdíl mezi rodiči >10%) §Šlechtění (experimentální hybridizace a polyploidizace; výběr a pěstování hybridních jedinců) K čemu je to dobré? embryo_sac embryo sacs sperm cells reduced unreduced egg cell C polar nuclei 2C egg cell 2C polar nuclei 4C reduced C C 2C 3C 3C 5C unreduced 2C 2C 3C 4C 4C 6C reduced 0 C C 3C 2C 5C unreduced 0 2C C 4C 2C 6C 0 0 C 2C 2C 4C embryo endosperm embryo endosperm Způsob rozmnožování – detekce reprodukčních systémů Apomixie = nepohlavní rozmnožování pomocí semen Matzk F., Meister A. & Schubert I. (2000): An efficient screen for reproductive pathways using mature seeds of monocots and dicots. – Pl Journ 21: 97–108. embryo_end Způsob rozmnožování Mezidruhová hybridizace a polyploidizace R1 R2 F1 Šmarda et al. 2018; Ginkgo biloba http://www.pakdairyinfo.com/Pic/Sex%20Sorting.jpg Další aplikace průtokové cytometrie – třídění spermií – diagnostika leukémie a jiných hematologických chorob – diagnostika AIDS – pylová viabilita