Bi6589
Laboratorní a bioinformatické metody rostlinné biosystematiky


Metody molekulární biologie



nasedání listu
na stonek
typ listové žilnatiny
tvar listu
 typ listu
tvar listové báze
typ květu,
květenství
typ plodů
květní znaky
typ ostnů
průduchy
trichomy
pylová zrna
histologické preparáty
karyologické preparáty
Standardní botanické přístupy

Botanika pro odvážné



•stabilní a detekovatelné ve všech pletivech bez ohledu na stadium růstu, diferenciaci, vývoj (a
obranný status buňky)
•
•oproštěné pleiotropického (gen kóduje více znaků) a epistatického (překrytí jiného znaku) efektu
fenotyp = genotyp x ekotyp
Proč metody molekulární biologie ?

Metodami molekulární biologie odvozujeme, studujeme a porovnáváme znaky (markery) kódované v
biomolekulách.
DNA, RNA, proteiny
dendrogram
  (kladogram)
molekulární metoda
analýza
molekulární znaky
Ordinační diagram
Proč metody molekulární biologie ?

•Genotypizace: identifikace jedinců, druhů, hybridů;
•Fylogeneze: příbuzenská vztah, vzájemná podobnost;
•Fylogeografie: genetická historie šíření druhu v závislosti na klimatických a geografických
podmínkách, identifikace glaciálních refugií; šíření druhů: tok genů, migrační směr, hybridní zóny;
•Populační genetika: genetická struktura;
•Ochranářská genetika: biodiverzita x izolované populace;
•Párovací systémy: sexuální x asexuální, zastoupení jedinců v potomstvu;
•Polyploidizace: vznik a rozšíření polyploidů;
•Evoluce: rodu, druhu, genomu; atd.
•Diagnostika: vztah DNA znaku a specifické vlastnosti;
Jaké otázky mohou být řešeny?

Metody molekulární biologie
Izolace DNA


Organely s DNA
Chloroplasty (ctDNA)
Mitochondrie (mtDNA)
Jádro (nDNA)
Izolace DNA

Princip:
-překonání buněčné stěny
- inhibice nukleáz
- odstranění sekundárních     metabolitů
- odstranění proteinů
- odstranění RNA
- odstranění volných       nukleotidů a nečistot
Izolace DNA

Izolace DNA
Laboratorní skleněná láhev 250ml víčko GL45 za 128 Kč - Allegro Laboratorní skleněná láhev 250ml
víčko GL45 za 128 Kč - Allegro Laboratorní skleněná láhev 250ml víčko GL45 za 128 Kč - Allegro
Komerční kit
„ruční“ izolace
vs.

Izolace DNA - upravená CTABová metoda (Doyle a Doyle 1987)
1.homogenizace 100 mg rostlinného materiálu v tekutém dusíku
2.přidat 0,2 ml extrakční pufr CTAB (suspenze by měla být právě tekutá)
3.inkubace 10 minut při 65°C
4.
4.přidat fenol:chloroform (1:9) v poměru 1:1 k roztoku, dobře protřepat
5.centrifugace –  max. otáčky, 5 min
6.odebrat supernatant (horní vrstva) do nové zkumavky; nenasát nečistoty nebo F:CH!!!
7.
7.přidat vymražený etanol v poměru 2:1 (etanol:supernatant), vymrazit 5-10 min.
8.centrifugace – 4 000-10 000 RPM (dle množství DNA), 3 min;
9.odstranit roztok (dále pracuji s peletem!) a nechat pelet 10 minut oschnout při RT
10.
10. rozpustit pelet ve 100 μl octanu draselném (300 mM výsledná koncentrace)
11. přidat RNAsu (výsledná koncentrace 40ng/ml); inkubace 10 minut při RT
12.
12. přidat vymražený etanol v poměru 2:1 (etanol:roztok DNA), vymrazit 5-10 min.
13. centrifugace – 4 000-10 000 RPM (dle množství DNA), 3 min;
14. odstranit roztok (dále pracuji s peletem!) a nechat pelet 10 minut oschnout při RT
15.
15. rozpustit pelet v 50-100 μl destilované vodě (dle velikosti peletu)
CTAB pufr 40ml
2% CTAB 0,8g
2% PVP 0,8g
100 mM 1M Tris-HCl (pH 8,0) 4ml
 25 mM 0,5 M EDTA (pH 8,0) 2ml
2,0 M NaCl 4,67g
(0,5g/l spermidin                 0,02g)
VODA                33,2ml