Bi6589 Laboratorní a bioinformatické metody rostlinné biosystematiky Metody molekulární biologie Analýzy DNA Metody molekulární biologie Elektroforéza - + kratší fragmenty jsou pohyblivější než delší fragmenty Agarózový gel El. proud DNA/RNA má záporný náboj díky fosfátovým skupinám Pufr TBE vs. TAE Elektroforéza – princip separace nukleových kyselin 10 000 – 4 000 – 3 000 – 2 000 – 1 550 – 1 000 – 750 – 500 – 400 – 300 – 200 – 100 – 50 – VM – velikostní marker 1 – genomová DNA 2, 3 – DNA fragmenty pb Vizualizace DNA: na DNA se naváže fluorescenční barvivo, které po osvícení UV zářením fluoreskuje. Elektroforéza – elektroforetogram Kvantifikace nukleových kyselin Metody molekulární biologie Kvantifikace nukleových kyselin (spektro)fotometr měří: absorbanci, tedy kolik světla bylo pohlceno vzorkem (spectro)fluorometr měří: intenzitu fluorescenčního záření emitovaného vzorkem Stanovení koncentrace DNA měřením absorbance při 260 nm Nukleová kyselina Extinkční koeficient A260 = 1 ds DNA 50 μg/ml ss DNA 33 μg/ml RNA 40 μg/ml 1) vlož do kyvety 114 μl destilované vody 2) proveď kalibraci spektrofotometru (nastavení nulové hodnoty) 3) přidej do kyvety 6 μl vzorku; 4) promíchej obsah kyvety pipetou 5) změř absorbanci při 260 nm (A260) 6) odečti naměřenou hodnotou 7) proveď výpočet koncentrace DNA dle vzorce Koncentrace nukleové kyseliny = A260 x extinkční koeficient x diluční faktor Stanovení koncentrace DNA měřením fluorescence Qubit™ Fluorometric Quantitation - Protocol - OneLab Stanovení koncentrace DNA měřením fluorescence Polymerázová řetězová reakce Polymerase Chain Reaction (PCR) Metody molekulární biologie Důmyslná metoda pro zmnožení (amplifikaci) známé sekvence. Trocha historie 1979 – Kary B. Mullis objevil principy PCR 1985 – popsána samotná PCR 1993 – Nobelova cena za chemii Paradox: 1971 - Dr. K. Kleppe a H.G. Khorana publikovali principy na kterých stojí PCR; jejich nápad však zapadl Polymerázová řetězová reakce (PCR) Denaturace 94°C Elongace 72°C Anelace 45-65°C PCR - princip Different steps in PCR PCR PCR - princip PCR gel Exponential Amplification Green and red algaes in Norris geyser basin. Yellowstone National Park Národní park Yellowstone (USA) Thermus aquaticus PCR - princip Komponenta Pipetovaný objem Zásobní koncentrace Finální koncentrace DNA 1 μl ? 50 - 100 ng Taq polymerase 1 μl 1U/ 1μl 1U/ reakce Primer F 1 μl 5 μM 250 nM Primer R 1 μl 5 μM 250 nM dNTP 0,3 μl 10 mM (each) 150 nM Pufr (15 mM MgCl2) 2 μl 10 x 1 x PCR voda 13,7 μl Doplnit do 20 μl suma 20 μl PCR program 1x 94°C 2 min 30x 94°C 30 sek 56°C 30 sek 72°C 30 sek 4°C forever PCR - protokol Výhody • jednoduchost • rychlost • velká možnost modifikací základního postupu • návaznost na další metody • možnost automatizace • potřeba 50 –100 ng DNA (v ideálním případě je tedy možné pomnožit DNA úsek z několika buněk) • v některých případech stačí hrubý extrakt DNA Nevýhody • omezená délka amplifikovaného fragmentu (3-15 tis. pb) • chybovost polymerázy • obecně nutná znalost cílové sekvence (některé modifikace standardní PCR tuto znalost nevyžadují) • u rostlinných pletiv častý výskyt inhibitorů PCR • nespecificita PCR (primerů) PCR - shrnutí Sekvenování Metody molekulární biologie Starší metody • Sangerova metoda •Maxam–Gilbertova metoda • Pyrosekvenování Nové metody 454, Solexa, Solid, Ion Torrent, Oxsford Nanopore, ... „Black box“ Liší se • Délkou sekvenovaného fragmentu • Finanční náročností • Časovými nároky • Chybovostí Sekvenování Vztah k našemu problému: Organelové markery Jaderné markery deoxycytozin (dCTP) dideoxycytozin (ddCTP) Principy: 1977 Komerční využití: 1986 Sangerova metoda - princip Po přiřazení ddNTP se zastaví prodlužování řetězce. Inkorporace ddNTP je náhodná, vznikají tedy fragmenty různých délek. Sangerova metoda - princip Výhody • nízká koncentrace templátu (10-100 ng) • vysoká opakovatelnost • známé vlastnosti, funkce a evoluční význam studovaných fragmentů • možnost automatizace (zavedený pracovní postup) • rychlé a cenově výhodné při malém počtu vzorků • jednoduchá analýza dat • délka čtení (500-700 pb) Nevýhody • pracná technika a náročná na technické vybavení (lze řešit jako službu) • problémy při kontaminaci vzorku cizorodou DNA (v případě, kdy se používá univerzální primer) • drahý, časově náročný vývoj univerzálních primerů (omezená možnost použitelnosti) • nízké pokrytí genomu • nízký stupeň variace v taxonomických jednotkách menších než druh Sangerova metoda - shrnutí Next Generation Sequencing (NGS) - princip Next Generation Sequencing (NGS) - princip Sekvenování Illumina Sekvenování Illumina • • Založena na barvivových terminátorech. • Při této metodě jsou molekuly DNA nejprve připojeny k primerům na sklíčku a amplifikovány (tzv. můstkové zesílení). • Při elongaci, může být DNA prodloužena vždy pouze o jeden fluorescenčně značený nukleotid. • Kamera pořídí snímky fluorescenčních zanček. • • Poté je barvivo spolu s koncovým 3′ blokátorem chemicky odstraněno z DNA a je zahájen další cyklus. Next Generation Sequencing (NGS) - princip Sekvenování Illumina Next generation sequencing (NGS) - shrnutí Výhody • pokrytí téměř celého genomu (alternativně náhodný výběr sekvencí z celého genomu) • velké množství informací z malého množství DNA • velký stupeň variability v sekvencích v různých taxonomických úrovních • opakovatelnost Nevýhody • pracná technika a náročná na technické vybavení (lze řešit jako službu) • finančně nevýhodné pro malý počet vzorků (do cca 20 vzorků) • časově neefektivní/nevýhodné pro malý počet vzorků (do cca 20) • krátké čtení (150-300 bps) např. od Illumina • obvykle analyzujeme anonymní fragmenty (neznáme jejich vlastnosti, funkci a evoluční význam) • problematické odstraňování paralogů a ortologů • složitá analýza dat