Bi6589 Laboratorní a bioinformatické metody rostlinné biosystematiky Mikroskopické techniky Průduchy Pyl Chromozomy Mikroskopické techniky Průduchy Funkce průduchů figure a Ztráta H2O Výměna plynů O2 a CO2 Při dýchání se uvolní cca 14% CO2, který rostlina přijala při fotosyntéze Fotosynteticko–transpirační kompromis: maximální přísun oxidu uhličitého při únosných ztrátách vody. New Phytol. http://doi.org/c2v3 (2019) Proč studovat průduchy? Závislost velikosti průduchů (délky svěracích buněk) na velikosti buněčného jádra! Vyplývá z „karyoplazmatického poměru“ = optimální poměru mezi objemem jádra (≈ obsah DNA) a cytoplazmy Omezená variabilita velikosti průduchu; netrpí endopolyploidií The relationship between log-transformed genome size and stomatal length in geophytes. Regressions (lines not shown): overall, y ¼ 0 . 1761x + 0 . 8492, r ¼ 0 . 580, P ¼ 0 . 000; small-to-large genomes (2C , 40 000 Mbp; open symbols) y ¼ 0 . 1434x + 0 . 971, r ¼ 0 . 448, P ¼ 0 . 000; extremely large genomes (2C ≥ 40 000 Mbp; closed symbols) y ¼ 0 . 5342x – 0 . 8289, r ¼ 0 . 545, P ¼ 0 . 003. Circles, analysed geophytic species; squares, Tradescantia virginiana; triangles, genus Fritillaria. Annals of Bot. DOI:10.1093/aob/mcr267 (2012) Velikost průduchů u rostlin s malými genomy více ovlivňují ekofyziologické a ekomorfologické omezení; Velikost průduchů u rostlin s velkými genomy je ovlivněna limity spojenými s fungováním buňky haploid diploid aneuploid tetraploid Vztah průduchů a ploidie Brassica rapa L. ssp. pekinensis Ai Xia Gu et al. (2016) Breeding Science Proč studovat průduchy? Sci.Direct: https://doi.org/10.1016/j.scitotenv.2022.160908 (2023) Proč studovat průduchy? Velikost genomu negativně koreluje s hustotou průduchů. Mezi velikostí průduchů a hustotou průduchů je inverzního vztahu. Odlišné prostředí může generovat variabilitu v hustotě průduchů uvnitř druhu. Pravděpodobně reakce na pokles obsahu CO2 v atmosféře. Jedná se tedy snahu o snižování difúzní vzdálenosti pro CO2 Labeled diagram showing plant stoma open and closed. Anatomie průduchů Tenká buněčná stěna Tlustá buněčná stěna Naplněná vakuola Buněčné jádro Zavřený průduch Otevřený průduch Svěrací buňka Vysoký tlak/turgor Chloroplast Průduchová štěrbina Epidermální buňky Svěrací buňka Nízký tlak/turgor Prázdná vakuola Typy průduchů – základní dělení dle tvaru Ledvinovitý (typ Amaryllis) Piškotovitý (typ Gramineae) Další typy: Helleborus, Pteridofytní, Gymnospermní Wheat Leaf Stomata, SEM Svěrací buňky obklopené vedlejšími Průduchy – důležité informace Dle polohy průduchů k rovině listu (zohlednit při přípravě preparátu) 1) Faneroporní – v rovině listu, nejčastější typ 2) Emerzní – nad úrovní listu (vyčnívají), typické pro vlhkomilné rostliny; 3) Submerzní (kryptoporní) – pod úrovní listu (ponořené), typické pro suchomilné rostliny (zamezuje nadměrným ztrátám vody) Podle umístění stomat rozlišujeme listy (ujasnit si, co chci měřit) 1) hypostomatické: stomata se nacházejí v abaxiální (spodní) epidermis – nejčastější typ listu 2) epistomatické: stomata jsou pouze v adaxiální (horní) epidermis 3) amfistomatické: stomata jsou v epidermis abaxiální i adaxiální Klasifikace stomat podle počtu a tvaru epidermálních buněk sousedících se stomaty U některých rostlin průduchy chybí, resp. druhotně vymizely! •Játrovky, lišejníky, šídlatky (Isoëtes), některé druhy hlevíků, některé druhy kapradin (např. čeleď Salviniaceae); •u mechorostů jsou obvykle průduchy přítomné na sporofytu (tzn. na tobolce), výjimečně i na gametofytu; •chybí u nezelených/parazitických druhů krytosemenných rostlin, jako je hlístník hnízdák (Neottia nidus-avis) či hnilák (Monotropa); •až na výjimky je nemají vodních rostlin (vyjma např. leknín, Nymphaea). Průduchy nejsou jen na listech! Lze je nalézt na květech, listenech, úponcích, kořenech hlízách atd. Průduchy – důležité informace Měření průduchů Bělení listu v SAVU 1)Hydratace suchého materiálu 2)Vybělení v SAVU 3)Přenesení pletiva na podložní sklíčko 4) Mikroreliéfní metoda (otisky průduchů) 1) Zpřístupnění průduchů (oholení apod.) 2) Nalakování pokožky listu 3) Přelepení průhlednou lepicí páskou 4) Stržení lepicí pásky 5) Nalepení lepicí pásky s otisky průduchů na podložní sklíčko Schematic representation of the stomatal and pore dimensions as measured by image analysis. The grey area represents the guard cells, the black area the pore walls, and the white area (internal ellipse) depicts the stomatal pore area. Průměrný počet průduchů na mm2: 50-484 ks Průměrná velikost průduchové štěrbiny: 17,7 x 6,7 μm Mikroskopické techniky Pyl Pylová zrnka jednotlivých rostlin se od sebe liší velikostí i tvarem Palynologie = nauka o pylu, sporách a cystách. Morfologie pylových zrn TVAR: Kulovitý; elipsoidní; nitkovitý (vodní rostliny) APERTURY (tremy, otvory) - ztenčeniny v exině jimiž klíčí pylová láčka Rozlišují se dle: POČTU: mono - polyaperturátní POLOHY (umístění): zonoapertury (v určité rovině) – pantoapertury (po celém povrchu ) TYPU: Exina se skulptury Intina Stěna pylového zrna (sporoderma) Jádro generativní buňky Jádro vegetativní buňky kolpátní porátní kolporatní SKULPTURY POVRCHU: psilátní, skabrátní, verukátní atd. Morfologie pylových zrn TVAR: Kulovitý; elipsoidní; nitkovitý (vodní rostliny) APERTURY (tremy, otvory) - ztenčeniny v exině jimiž klíčí pylová láčka Rozlišují se dle: POČTU: mono - polyaperturátní POLOHY (umístění): zonoapertury (v určité rovině) – pantoapertury (po celém povrchu ) TYPU: kolpátní, porátní, kolporátní SKULPTURY POVRCHU: psilátní, skabrátní, verukátní atd. http://www.botany.unibe.ch/paleo/pollen_e/surface.htm Morfologie pylových zrn U entomogamních rostlin charakteristický tvar a výrazné povrchové útvary (skulptury), které by měli umožnit efektivní přenos pylu, ale současně zabránit sběru pylu opylovačům (tzv. „pylové dilema“ mezi rostlinou a opylovači). U anemogamních rostlin obvykle povrch pylových zrn hladký, nelepivý a velmi často opatřený vzdušnými vaky. Sci. Report. https://doi.org/10.1038/s41598-019-41262-6 (2018) Velikost pylových zrn Velikost pylových zrn: 5 - 250 μm (pomněnka/tykev) Udává se, že velikost pylových zrn koreluje se stupněm ploidie. Neplatí obecně, některé práce to vyvracejí a jako možné důvody udávají: 1)vyšší ploidie menší pylová zrna, která by se mohla snáze zapojit do reprodukce; 2)pylová zrna polyploidů mohou být pod selektivním tlakem, aby byla kompatibilní s velikostí blizny jejich rodičovských rostlin; 3)velikost pylu nekoreluje s ploidií, ale s C-value hodnotou South African Journal of Botany. https://doi.org/10.1016/j.sajb.2017.11.017 (2017) Velikost pylových zrn různých druhů rodu Streptocarpus (v 2x charakteristická velikost pro jednotlivé sekce) Velikost pylových zrn Velikost pylových zrn: 5 - 250 μm (pomněnka/tykev) Udává se, že velikost pylových zrn koreluje se stupněm ploidie. Neplatí obecně, některé práce to vyvracejí a jako možné důvody udávají: 1)vyšší ploidie menší pylová zrna, která by se mohla snáze zapojit do reprodukce; 2)pylová zrna polyploidů mohou být pod selektivním tlakem, aby byla kompatibilní s velikostí blizny jejich rodičovských rostlin; 3)velikost pylu nekoreluje s ploidií, ale s C-value hodnotou (a) Journal of Botany. https://doi.org/10.1155/2010/612017 (2010) Velikost pylových zrn Velikost pylových zrn: 5 - 250 μm (pomněnka/tykev) Udává se, že velikost pylových zrn koreluje se stupněm ploidie. Neplatí obecně, některé práce to vyvracejí a jako možné důvody udávají: 1)vyšší ploidie menší pylová zrna, která by se mohla snáze zapojit do reprodukce; 2)pylová zrna polyploidů mohou být pod selektivním tlakem, aby byla kompatibilní s velikostí blizny jejich rodičovských rostlin; 3)velikost pylu nekoreluje s ploidií, ale s C-value hodnotou (a) Regresní analýza využívající fylogeneticky nezávislých kontrastů nepodpořila tento korelovaný vztah Pylová viabilita Při mezidruhové hybridizaci vznikají jedinci, kteří mají sníženou viabilitu pylu. Pylovou viabilitu lze testovat: 1) klíčení pylu a růstu pylové láčky (klíčení pylových zrn na živném médiu): in vitro, in vivo 1) 2) Barvení pylu: má za cíl vizualizovat specifické sloučeniny, obsahy nebo buněčné kompartmenty související s životaschopností pylu (acetokarmín, tetrazolium, fluorescein diacetátem (FDA), apod.) Alexandrovo barvení: barví cytoplazmu červeně, zatímco buněčné stěny jsou zbarveny zeleně. Červená barva signalizuje životaschopné pylové zrno; zelená barva indikuje abortované pylové zrno (chybí cytoplazma a proto je viditelná zelená buněčná stěna) 3) Průtoková cytometrie: např.: impedanční průtoková cytometrie, která měří elektrické vlastnosti jednotlivých buněk 4) Analýza finálního souboru semen po opylení Alexandrovo barvení - protokol Složení Alexandrova barviva (Alexander 1969) Na 100ml roztoku: 10 ml 95% ethanol 10 mg malachitové zeleně 50 ml destilované vody 25 ml glycerol 5 g fenolu 5 g chloral hydrátu 50 mg kyselého fuchsinu 0,5 ml 1% oranže G v destilované vodě 1-4 ml ledové kyseliny octové Postup 1)Nakapat několik kapek Alexanderovy barvící směsi na podložní sklo. 2) 2)Do kapky barviva vypreparovat pylová zrna a překrýt krycím sklem. 3) 3)Zarámovat sklo bezbarvým lakem. 4) 4)Po několika minutách vyhodnotit zbarvení pylových zrn Mikroskopické techniky Chromozomy Karyologie = nauka o struktuře a funkci buněčného jádra figure 7 Změny ve velikosti buněčného jádra Rozdíly mezi druhy vs. rozdíly uvnitř druhu Variabilitu ve velikosti genomu způsobují změny: 1)Počtu chromozomů – polyploidie, aneuploidie. 2)Ve velikosti chromozomů (repetice, transpozony, vystřihování DNA, atd.) 3)B chromozomy 4)Pohlavní chromozomy Procesy beze změn velikosti genomu 1) rozpady a fúze chromozomů (především u taxonů s holocentrickými chromozomy) Změny ve velikosti buněčného jádra Rozdíly mezi druhy vs. rozdíly uvnitř druhu Variabilitu ve velikosti genomu způsobují změny: 1)Počtu chromozomů – polyploidie, aneuploidie. 2)Ve velikosti chromozomů (repetice, transpozony, vystřihování DNA, atd.) 3)B chromozomy 4)Pohlavní chromozomy Procesy beze změn velikosti genomu 1) rozpady a fúze chromozomů (především u taxonů s holocentrickými chromozomy) Genetics. https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1007700.g004 (2018) Změny ve velikosti buněčného jádra Rozdíly mezi druhy vs. rozdíly uvnitř druhu Variabilitu ve velikosti genomu způsobují změny: 1)Počtu chromozomů – polyploidie, aneuploidie. 2)Ve velikosti chromozomů (repetice, transpozony, vystřihování DNA, atd.) 3)B chromozomy 4)Pohlavní chromozomy Procesy beze změn velikosti genomu 1) rozpady a fúze chromozomů (především u taxonů s holocentrickými chromozomy) undefined Změny ve velikosti buněčného jádra Rozdíly mezi druhy vs. rozdíly uvnitř druhu Variabilitu ve velikosti genomu způsobují změny: 1)Počtu chromozomů – polyploidie, aneuploidie. 2)Ve velikosti chromozomů (repetice, transpozony, vystřihování DNA, atd.) 3)B chromozomy 4)Pohlavní chromozomy Procesy beze změn velikosti genomu 1) rozpady a fúze chromozomů (především u taxonů s holocentrickými chromozomy) Hobza (2017): Živa. Silenka širolistá (Silene latifolia) Využití k řešení našeho problému Počty chromozomů How does evolution define offspring like a mule that can't reproduce? - Quora Využití k řešení našeho problému Velikost chromozomů Luzula campestris subsp. campestris 2n = 12, large x Luzula sudetica 2n = 48, small Luzula xheddae 2n = 30 = 6l + 24s Kirschner 1991, Preslia 63: 81-112. Kirschner_Luzula Kirschner_Luzula Kirschner_Luzula Karyoptyp L. xheddae: 6 AL + 24 CL Využití k řešení našeho problému Typy chromozomů dle centromery metacentrický akrocentrický submetacentrický telomerický MONOCENTRICKÉ HOLOCENTRICKÉ Využití k řešení našeho problému Barvení chromozomů: G-banding (dle Giemsy) karyotyping-708x556-2x Zvýrazňují se oblasti bohaté na adenin s thyminem GISH na chromozomechTragopogon mirus 2n = 4x = 24 -1 +1. (A) Chromozomy podbarvené DAPI; (B) DNA sondy identifikující subgenomy pocházející buď z T. dubius (zelená) nebo T. porrifolius (červená); (C) Karyotyp s chromozomy barvenými DAPI (z A) a chromozomy hybridizované genomovou DNA (z B) pocházejícími z T. dubius (horní dvě řady) a T. porrifolius (spodní dvě řady). Bílé čáry označují trisomické a monosomické chromozomy. Využití k řešení našeho problému Barvení chromozomů – GISH (Genomic in situ hybridization) GISH do metafázových chromozomů kořenové špičky divokého přístupu Tragopogon mirus 2n = 4x = 24 -1 +1. (A) DAPI obarvené chromozomy. (B) Chromozomy hybridizované s genomovou DNA identifikující subgenomy pocházející buď z T. dubius (zelená) nebo T. porrifolius (červená). (C) Karyotyp s chromozomy barvenými DAPI (z A) a chromozomy hybridizované genomovou DNA (z B) pocházejícími z T. dubius (horní dvě řady) a T. porrifolius (spodní dvě řady). Bílé čáry označují trisomické a monosomické chromozomy. Chester et al. (2010) Genes Chromozomy Tragopogon mirus 2n = 4x = 24 -1 +1 Chromozomy z T. dubius Chromozomy z T. porrifolius Anatomie kořene Meristematická zóna Plně vyvinuté pletivo Elongační zóna Kořenová čepička Synchronizace buněčného cyklu Meristematické buňky jsou vystaveny podmínkám, které jim zabrání v plynulém průchodu buněčným cyklem. Dojde tak k nahromadění buněk v určité fázi buněčného cyklu. Cytostatika: ledová voda, kolchicin, hydroxymočovina, atd. MITOTICKÝ INDEX: podíl počtu buněk ve stádiu mitózy k celkovému počtu buněk. cell-cycle Mitóza Buněčný cyklus Rychlá roztlaková metoda FIXACE 1)Vložit kořenové špičky do fixační směsi (96% etanol : ledová kyselina octová, poměr 3:1); nechat působit ON při 6°C. 2)Přendat koř. špičky do 70% etanolu (dlouhodobé skladování). MACERACE 1)Přenést koř. špičky do maceračního roztoku (96% alkoholu: koncentrované HCl, poměr 1:1); inkubovat 1-2 minuty při RT. 2)Vyprat koř. špičky v destilované vodě; 1-2 minuty. 3)Přemístit koř. špičku na podložní sklíčko do kapky vody. 4)Odříznout část koř. špičky s dělivými meristémy, zbytek kořene odstranit. 5) BARVENÍ 1)Odsát přebytek vody z krycího skla a přidat kapku barviva (laktopropionorcein) 2)Překrýt koř. špičku krycím sklíčkem a rozmáčnout špičkou reparační jehly. 3)pozorován imerzním objektivem se zvětšením 100x. Fixace způsobuje rychlé usmrcení objektu při zachování neporušené struktury chromozomů Macerace rozruší pektinovou střední lamelu. Rozvolněné buňky se tlakem rozprostřou do plochy. Barvení zviditelní chromozomy