Mezibuněčná signalizace
membránovými receptory
doc. RNDr. Jakub Neradil, Ph.D.
Ústav experimentální biologie PřF MU
Bi7005 Buněčné regulace / 2 / 2. 10. 2024
Bi7005 Buněčné regulace / 02 / 2. 10. 2024
2
OSNOVA:
• Receptory spřažené s G-proteiny (GPCRs)
• GPCRs a jejich napojení na iontové kanály
• GPCRs a jejich napojení na enzymy
• Role druhých poslů
• Receptory spřažené s enzymy
• Cytoplasmatické kinázy
3
Receptory spřažené s G-proteiny (GPCRs)
Bi7005 Buněčné regulace / 02 / 2. 10. 2024
4
RECEPTORY SPŘAŽENÉ S G-PROTEINY (G protein-coupled receptors, GPCRs)
• 7x transmembránová α-helix doména (H1-H7)
• 4x extracelulární segment (E1-E4)
• 4x cytosolický segment (C1-C4)
• N-konec extracelulárně
• C-konec intracelulárně
Bi7005 Buněčné regulace / 02 / 2. 10. 2024
5
RECEPTORY SPŘAŽENÉ S G-PROTEINY (G protein-coupled receptors, GPCRs)
• Největší skupina receptorů u eukaryot (lidský genom ≈ 800)
• Vazba malých molekul, peptidů, proteinů
• Receptory: vidění, chutí, vůní, pro neurotransmitery, pro hormony
• Rychlé změny buněčných funkcí i změna genové exprese
• Hormon/ligand vázající doména – extracelulárně nebo v membráně
• Aktivovaný receptor po vazbě ligandu aktivuje asociovaný heterotrimerický G-protein
• Interakce pomocí C3 a C4 cytoplasmatických regionů
• G-protein interaguje s efektorovým proteinem vázaným na membráně
6
Receptory spřažené s G-proteiny a jejich
napojení na iontové kanály
Bi7005 Buněčné regulace / 02 / 2. 10. 2024
7
NAPOJENÍ GPCR NA IONTOVÉ KANÁLY
POZOR! - nejde o receptory spřažené s iontovými kanály, kdy se
kanál otevírá po navázání ligandu, popsané pro některé
neurotransmitery (např. acetylcholin na synapsích)
• Komplikovanější přenos signálu – přes G proteiny
• Aktivují Na+ nebo K+ kanály/pumpy
• Ovládají zapnutí/vypnutí funkce kanálu
• Regulovány receptory pro neurotransmitery
• Přímá regulace:
např. muskarinový acetylcholinový receptor v srdečních buňkách
• Nepřímá regulace:
Navíc role druhých poslů, např. rhodopsin v tyčinkách v oku
GPCR (G protein-coupled receptor) = receptor spřažený s G-proteiny
Bi7005 Buněčné regulace / 02 / 2. 10. 2024
8
PŘÍMÁ REGULACE IONTOVÉHO KANÁLU G PROTEINEM
• Muskarinový acetylcholinový receptor
• V buňkách srdeční svaloviny
• Aktivace receptoru -> transdukce signálu dimerem Gβγ
• Otevření K+ kanálu -> eflux K+ -> hyperpolarizace membrány
• Zpomalení činnosti srdce
• Další agonista = muskarin
• Houbový toxin (strmělky, vláknice, m. červená)
• Antagonista = atropin
• Toxin rulíku
• Zrychlení činnosti srdce
Amanita muscaria Atropa bella-donna
Bi7005 Buněčné regulace / 02 / 2. 10. 2024
9
NEPŘÍMÁ REGULACE IONTOVÉHO KANÁLU G PROTEINEM – RECEPTORY PACHŮ
• Lidé - schopnost vnímat 10.000 pachů, 350 druhů čichových receptorů = 350 druhů čichových neuronů
• Olfaktorické (čichové) neurony exprimují na povrchu cilií olfaktorické receptory spřažené s G proteiny
• Aktivace G proteinu (Gαolf) -> aktivace adenylátcyklázy -> ↑cAMP
• cAMP otvírá Na+ kanály -> depolarizace membrány -> vznik vzruchu
Bi7005 Buněčné regulace / 02 / 2. 10. 2024
10
• Vnímání: slabého světla – tyčinky / barevného světla – čípky
• RHODOPSIN = s G proteinem spřažený receptor světla v tyčinkách
sítnici oka
• Navázaný na membránové disky vnějšího segmentu tyčinky (40 x 106
/ buňka)
• Obsahuje protein OPSIN – struktura 7 transmembránových domén
• RETINAL = světlo absorbující pigment – vazba na opsin
• TRANSDUCIN = G protein
• Čípky – u lidí 3 druhy, různé fotopsiny (modrá, zelená, žlutá)
NEPŘÍMÁ REGULACE IONTOVÉHO KANÁLU G PROTEINEM – RECEPTORY SVĚTLA
Bi7005 Buněčné regulace / 02 / 2. 10. 2024
11
NEPŘÍMÁ REGULACE IONTOVÉHO KANÁLU G PROTEINEM – SIGNALIZACE VIDĚNÍ
• Signálem je foton -> konverze 11-cis-retinalu na all-trans-retinal ->
• konformační změna opsinu -> aktivace G proteinu
• Gt podjednotka aktivuje cGMP fosfodiesterázu (PDE) -> hydrolýza cGMP
• Klesá koncentrace cGMP vázaného na iontové kanály
• Zavírání kanálů v plasmatické membráně -> přechodná hyperpolarizace
• Souhrnně: světelný signál ≈≈≈> změna elektrického signálu
Bi7005 Buněčné regulace / 02 / 2. 10. 2024
12
Bi7005 Buněčné regulace / 02 / 2. 10. 2024
13
Bez světla:
• Membránový potenciál tyčinek relativně vysoký -30mV
• Ostatní neurony -60 až -90mV
• Probíhá signalizace druhým poslem cGMP
• Stálé otevření nespecifických kanálů pro Na+ a Ca2+
• Influx kationtů
• Membrána je dopolarizovaná
• Soustavná sekrece neurotransmiterů
• Nepřetržitá stimulace neuronů v synapsi
Za světla:
• Neprobíhá signalizace druhým poslem cGMP
• Zavření nespecifických kanálů pro Na+ a Ca2+
• Membrána je hyperpolarizovaná
• Velmi nízká sekrece neurotransmiterů
Bi7005 Buněčné regulace / 02 / 2. 10. 2024
14
Součinnnost několika mechanismů pro ukončení signalizace
• Hydrolýza GTP na Gt -> konec aktivace cGMP fosfodiesterázy -> ↑cGMP
• Pokles Ca2+ iontů -> stimulace guanylátcyclázy -> ↑cGMP
• Aktivace rhodopsin kinázy -> fosforylace rhodopsinu -> vazba arrestinu
Rekonstrukce signální dráhy – příprava na přijetí dalšího signálu
• Konverze all-trans-retinalu na 11-cis-retinal -> spojení s opsinem
• Odstranění arrestinu z rhodopsinu
15
Receptory spřažené s G-proteiny
a jejich napojení na enzymy
Bi7005 Buněčné regulace / 02 / 2. 10. 2024
16
CYKLICKÝ ADENOSINMONOFOSFÁT (cAMP) JAKO DRUHÝ POSEL
• Syntéza cAMP z ATP: adenylátcykláza (inducibilní)
• Štěpení cAMP na AMP: cAMP-fosfodiesteráza (konstitutivní)
• cAMP je rozpustný ve vodě, snadno difunduje cytosolem
• Rychlý nárůst (až 20x/s)
• Regulace metabolismu cukrů a tuků, syntéza a sekrece hormonů,
svalová kontrakce…
Neurony reagující na serotonin. Signalizace zvyšuje koncentraci
cAMP. Detekováno pomocí fluorescenční sondy.
Bi7005 Buněčné regulace / 02 / 2. 10. 2024
17
GPCR SPOJENÉ S ADENYLÁTCYKLÁZOU
• Navázání ligandu na receptor -> aktivace G proteinu -> aktivace adenylátcyklázy –>
• ↑cAMP –> aktivace kinázy (proteinkináza A) –> fosforylace cílového proteinu
• Funkce závisí na receptoru a typu G proteinu
• U savců > 30 GPCRs aktivujících Gs a adenylátcyklázu
• Buňky exprimují jeden či více typů současně
Bi7005 Buněčné regulace / 02 / 2. 10. 2024
18
REGULACE AKTIVITY ADENYLÁTCYKLÁZY
• Závislost na aktivaci příslušného receptoru a G proteinu
• Regulace mezi aktivací a inhibicí adenylátcyklázy
Bi7005 Buněčné regulace / 02 / 2. 10. 2024
19
PŘÍKLAD AKTIVACE/INHIBICE ADENYLÁTCYKLÁZY
• Buňky tukové tkáně exprimují různé GPCR regulující adenylátcyklázu
• Adrenalin, glukagon, adrenokortikotropní hormon –> stimulují adenylátcyklázu –> rozklad tuků
• Prostaglandin E a adenosin –> inhibují adenylátcyklázu –> rozklad tuků neprobíhá
Bi7005 Buněčné regulace / 02 / 2. 10. 2024
20
Hormony zprostředkovaná signalizace regulovaná cAMP
• Široké spektrum buněčných odpovědí
• Genetické defekty v G podjednotce –> snížená odpověď na hormony –> metabolické abnormality
Bi7005 Buněčné regulace / 02 / 2. 10. 2024
21
cAMP AKTIVUJE PROTEINKINÁZU A (PKA)
• PKA – hlavní cíl pro cAMP, v neaktivním stavu heterotetramer
• 2x katalytická podjednotka, 2x regulační (inhibiční) podjednotka
• Regulační podjednotky váží A-kinase anchoring proteins (AKAPs)
• AKAPs – vazbou na cytoskelet nebo organely určují buněčnou lokalizaci PKA
• Po vazbě cAMP na regulační podjednotku –> změna konformace –> uvolnění z
komplexu
• Katalytické podjednotky se fosforylují a následně aktivují (fosforylují) cílové
proteiny s typickým motivem (Arg-Arg-X-Ser/Thr)
Struktura regulační podjednotky
Bi7005 Buněčné regulace / 02 / 2. 10. 2024
22
POMALÁ ODPOVĚĎ NA cAMP
• Buněčná odpověď v řádu minut až hodin
• Regulace genové exprese
• Aktivovaná PKA fosforyluje jaderný protein CREB (CRE-binding)
• pCREB vykazujte DNA vazebnou aktivitu
• Vazba na CRE element (cAMP responzivní element)
• Společně s dalšími transkripčními faktory + RNA Pol II –> transkripce
Příklady signalizací s pomalou odpovědí na cAMP
• Játra - syntéza proteinů pro glukoneogenezi
• Mozek - učení a paměť
Bi7005 Buněčné regulace / 02 / 2. 10. 2024
23
DOWN REGULACE SIGNALIZACE ŘÍZENÉ cAMP
• Pomocí různých mechanismů na různých úrovních signální dráhy
• Uvolnění hormonu z receptoru
• Desenzitizace receptorů kinázami
• Endocytóza receptoru
• Hydrolýza GTP na G podjednotce
• Hydrolýza cAMP pomocí cAMP fosfodiesterázy (PDE)
Příklad regulace signalizace pomocí cAMP zpětnou vazbou
• Protein AKAP (A-kinase anchoring proteins) – váže jadernou membránu, PKA a PDE
• Aktivovaná PKA přechází do jádra a současně aktivuje PDE –> snížení cAMP –> konec signalizace
jaderná membrána kardiomyocytu
Bi7005 Buněčné regulace / 02 / 2. 10. 2024
24
INOSITOLTRIFOSFÁT (IP3) A DIACYLGLYCEROL (DAG) JAKO DRUZÍ POSLI
• Obě molekuly vznikají díky aktivitě fosfolipázy C-β (PLCβ)
• Aktivace PLCβ přes receptor spřažený s G proteinem třídy Gq
• Substrátem PLCβ je - fosfatidylinositol 4,5-bisfosfát [PI(4,5)P2; PIP2]
• Lokalizovaný ve vnitřní vrstvě plasmatické membrány
Bi7005 Buněčné regulace / 02 / 2. 10. 2024
25
INOSITOLTRIFOSFÁT (IP3)
• Ve vodě rozpustný, difunduje cytosolem do endoplasmatického retikula
• Zde vazba na IP3 receptor v membráně retikula
• IP3 receptor je membránový iontový kanál pro Ca2+
• Po vazbě IP3 otevření kanálu vyplavení Ca2+ z endoplazmatického retikula
• Zvýšení intracelulární koncentrace Ca2+ >10x
Bi7005 Buněčné regulace / 02 / 2. 10. 2024
26
DIACYLGLYCEROL (DAG)
• Zůstává ukotvený v membráně
• Aktivuje proteinkinázu C (PKC) – „C“ jako Ca2+ dependentní
• Translokace PKC z cytosolu na membránu
• PKC aktivována vápníkem, spojením s DAG a fosfatidylserinem
• Aktivace způsobuje fosforylaci
• Následuje fosforylace cílových proteinů
• Další štěpení DAG –> arachidonová kyselina (AA)
• Rozvětvený metabolismus –> eikosanoidy
Fosfatidylserin na VNĚJŠÍ straně
membrány funguje jako „eat
me“ signál pro makrofágy
během regulace buněčné smrti
AA –> Lipoxygenáza –> leukotrieny
AA –> Cyklooxygenázy (COX1 a COX2) –> prostaglandiny a tromboxany
Cyklooxygenázy jsou cílem nesteroidních antiflogistik (brufen, aspirin)
Bi7005 Buněčné regulace / 02 / 2. 10. 2024
27
ÚLOHA VÁPENATÝCH IONTŮ (Ca2+)
• Role Ca2+ v signalizaci u všech živočichů
• V cytosolu udržovaná nízká hladina volného Ca2+ (≈10-7 M), extracelulárně až ≈10-3 M
• Vápníkové ATP pumpy –> přenos Ca2+ do endoplasmatického retikula nebo ven z buňky
• Velký gradient Ca2+ vzhledem k cytosolu
• Signál (depolarizace, natažení membrány, ligand) –> otevření kanálů na membráně
• Signál (druhý posel) –> IP3 receptory + ryanodinové receptory –> otevření kanálů z ER
• –> intenzivní zvýšení koncentrace v cytosolu (10x-100x)
• Zvýšení koncentrace lokálně v buňce –> efekt v daném místě
• Receptory s funkcí kanálu na retikulu jsou citlivé na Ca2+
• Ca2+ otevřením kanálů ↑ konc. Ca2+ - pozitivní zpětná smyčka
Ryanodinové receptory (RyR 1-3)
- senzitivní na alkaloid ryanodin
- lokalizace na retikulu
- závislé na Ca2+
- fce jako iontový kanál
Bi7005 Buněčné regulace / 02 / 2. 10. 2024
28
REGULACE BUNĚČNÝCH PROCESŮ Ca2+
• Chemoatrakce/pohyb buňky
• Kontrakce svalových buněk
• Exocytóza sekrečních váčků s hormony nebo neurotransmitery
• Fertilizace oocytu
Vápník vizualizovaný pomocí
Fura-2 v leukocytu. Lokalizace v
místě kortikální kontrakce. Při
změně směru pohybu, změna
gradientu vápníku.
Vápník vizualizovaný fluorescenční značkou v oocytu.
Lokalizace v místě průniku spermie. Postupné uvolňování
vápníku z ER. Následně kortikální reakce oocytu
zabraňující polyspermii.
Bi7005 Buněčné regulace / 02 / 2. 10. 2024
29
POZITIVNÍ A NEGATIVNÍ REGULACE KONCENTRACE Ca2+
Velmi nízká koncentrace signálu
• otevření malého množství kanálů na ER
• striktně lokalizované ↑ Ca2+, omezená difuze
Vyšší koncentrace signálu
• postupné otvírání vyššího množství kanálů na ER
• Vlna ↑ Ca2+ v cytosolu, pozitivní smyčka
Vysoká koncentrace Ca2+
• Inhibuje funkci kanálů na ER
• Aktivuje funkci ATP pump
• Vlna ↓Ca2+ v cytosolu, negativní smyčka
Střídání pozitivní a negativní regulace ≈> oscilace signalizace
Bi7005 Buněčné regulace / 02 / 2. 10. 2024
30
PRINCIP FUNKCE Ca2+ JAKO DRUHÉHO POSLA
• Ca2+ interaguje s vazebnými proteiny
• „EF hand“ rodina proteinů – motiv helix-loop-helix
• nejvýznamnější kalmodulin
✓ 1 % buněčné masy
✓ Tvar činky – 2 globulární domény
✓ 4 vazebná místa na Ca2+
Bi7005 Buněčné regulace / 02 / 2. 10. 2024
31
CÍLE KALMODULIN/Ca2+ KOMPLEXU
• Vazba Ca2+ na kalmodulin –> konformační změna –> vazba na cílový protein
• Zanutí/vypnutí cílového proteinu – fce jako switch protein
• Regulace různých enzymů a membránových proteinů
✓ Vápníková ATP pumpa - eflux Ca2+ z buňky - negativní smyčka
✓ CaM-kinázy (Ca2+/calmodulin dependent kinases) – fosforylace TF
Bi7005 Buněčné regulace / 02 / 2. 10. 2024
32
ROLE CaM KINÁZY II V NERVOVÉM SYSTÉMU
• Vysoká koncentrace v buňkách savčího mozku
• Primárně na synapsích
• Struktura: 12 molekul enzymu ve dvou prstencích
• Kinázová doména vně + regulační segment
• Fce jako molekulární paměť
• Aktivace Ca2+/kalmodulinem –> autofosforylace kináz
• Udržení aktivity i bez Ca2+/kalmodulinu
• „paměťová stopa“ předchozího Ca2+ signálu
• Vypnutí aktivity pomocí fosfatáz
• Uplatnění v paměti a učení savců
• KO mozkové formy CaM II u myší –> poruchy paměti
Bi7005 Buněčné regulace / 02 / 2. 10. 2024
33
ROLE CaM KINÁZY II V NERVOVÉM SYSTÉMU
• Využití molekulární paměti pro vnímání frekvence Ca2+/kalmodulin signálů
• Při současné přítomnosti fosfatázy a opakovaných Ca2+/kalmodulin signálů
• Aktivita CaM II závislá na frekvenci signálů
• Nízká frekvence –> opakovaně stejně nízká aktivita kinázy
• Vysoká frekvence –> vzrůstající aktivita kinázy –> postupná autofosforylace všech podjednotek –>
–> po maximální aktivaci kinázy může frekvence signálů poklesnout - aktivita přetrvá
• Uplatnění v postsynaptických buňkách –>
dlouhodobé změny v buněčné odpovědi
Bi7005 Buněčné regulace / 02 / 2. 10. 2024
34
Sydney Ringer (1835 – 1910)
Odhalení role vápníku: Sydney Ringer, 1883
Vliv vápníku na kontrakce izolovaných krysích srdcí
Roztok NaCl:
• v destilované vodě: slabé kontrakce
• v kohoutkové vodě: silné kontrakce (obsah Ca2+ )
35
Receptory spřažené s enzymy
Bi7005 Buněčné regulace / 02 / 2. 10. 2024
36
RECEPTORY SPŘAŽENÉ S ENZYMY (enzyme-coupled receptors)
• Transmembránové proteiny, 3 domény
• Extracelulární – vazba ligandu
• Transmembránová – 1x prochází skrz membránu
• Intracelulární – vlastní enzymatická aktivita nebo přímá asociace s enzymem
• Často aktivace podobných drah jako přes GPCR
• Nejtypičtější – receptorové tyrozinkinázy (RTKs)
• Funkce: regulace proliferace, diferenciace, metabolismu, aj.
• Ligandy pro RTK - sekretované nebo na membráně navázané proteiny
Bi7005 Buněčné regulace / 02 / 2. 10. 2024
37
PŘÍKLADY EXTRACELULÁRNÍCH LIGANDŮ PRO RTKs
Bi7005 Buněčné regulace / 02 / 2. 10. 2024
38
RODINY RTKs
• lidský genom: 59 genů (+alternativní sestřih), 20 strukturálních rodin
Bi7005 Buněčné regulace / 02 / 2. 10. 2024
39
TRANSDUKCE SIGNÁLU PŘES RTKs
• Vazba růstového faktoru/ligandu na extracelululární doménu
• Přiblížení a následná dimerizace receptorů
• Konformační změna
• Cross-autofosforylace
• Stimulace katalytické aktivity tyrozinkinázové domény
• Tvorba vazebných (fosforylovaných) míst pro domény adaptorových proteinů
Bi7005 Buněčné regulace / 02 / 2. 10. 2024
40
PRINCIP AKTIVACE KINÁZOVÉ DOMÉNY
• Závisí na typu RTK
• V neaktivním stavu je aktivační smyčka (activation loop domain) nefosforylovaná
a konformačně blokuje kinázovou aktivitu = brání vazbě ATP nebo substrátu
A) Stačí přiblížení kinázových domén ve správné orientaci –> cross-autofosforylace
obou (např. PDGFR)
B) Pokud je receptor dimerem (např. InsR) –> po vazbě ligandu současná změna
orientace extracelulární i intracelulární domény –> cross-autofosforylace obou
C) Kinázová podjednotka je aktivována konformačními změnami díky vzájemné
interakci – ale mimo aktivní (fosforylační) místa (např. EGFR)
Bi7005 Buněčné regulace / 02 / 2. 10. 2024
41
TVORBA DOKOVACÍCH MÍST PRO INTRACELULÁRNÍ SIGNÁLNÍ PROTEINY
• Po aktivaci kinázové domény –> fosforylace dalších reziduí (Tyr) mimo kinázovou doménu
• Představují specifická místa pro intracelulární signální proteiny
• Ty obsahují fosfotyrozin-vazebnou doménu – rozeznávají p-Tyr a jeho okolní aminokyseliny
• Po vazbě na RTK se signální proteiny fosforylují/aktivují
• Fosforylace RTK funguje jako spínač sestavení intracelulárních signálních komplexů
• Proteiny v komplexech určují směr transdukce signálu a buněčnou odpověď
Bi7005 Buněčné regulace / 02 / 2. 10. 2024
42
INTRACELULÁRNÍ SIGNÁLNÍ PROTEINY
• Velké množství + další proteiny pomocí protein-proteinových interakcí - role modulárních domén
• Fosfolipáza Cγ (PLCγ): Stejná role jako při aktivaci receptoru s G proteinem – nárůst koncentrace
Ca2+ a aktivace PKC
• Cytoplasmatická tyrozinkináza Src – fosforylace dalších cytoplasmatických proteinů
• Adaptorové proteiny – aktivace Ras/MAP kinázové dráhy
• Fosfatidylinositol-3-kináza (PI3K) – fosforyluje spíše lipidy - fosfolipidy dokují signální proteiny na
membráně
Bi7005 Buněčné regulace / 02 / 2. 10. 2024
43
INTRACELULÁRNÍ SIGNÁLNÍ PROTEINY
Pro všechny signální proteiny platí:
• Přítomnost fosfotyrozin-vazebné domény: SH2 (Src homology 2) nebo PTB (phosphotyrosine-binding)
• Přítomnost dalších vazebných domén (např. SH3 – vazba na „prolin rich“ motiv) – interakce s dalšími
proteiny - transdukce signálu
• Možný i tlumící efekt = negativní zpětná vazba, např. ubikvitinligáza Cbl – katalyzuje ubikvitinaci receptoru
–> endocytóza + degradace v lysozomu. Mutace v genu Cbl prodlužuje odstraňování - podíl na rozvoji
nádorových onemocnění
3D struktura SH2 domény
• Endocytóza (společně s ligandem) nemusí tlumit signalizaci – pokračuje
v jiném buněčném kompartmentu, např. ligand NGF + receptor TrkA z
konce neuritu přesun signalizace pro přežití do centra buňky
• Významná účast adaptorových proteinů – mají SH2 a SH3 domény –
spojují RTKs se signálními proteiny, které SH2 nemají (např. napojení na
Ras GTPázu)
Bi7005 Buněčné regulace / 02 / 2. 10. 2024
44
MONOMERICKÁ GTPÁZA RAS NAVAZUJE NA VĚTŠINU RTKS
• Ras superrodina – široké spektrum regulací
• Ras a Rho – transdukce z membránových receptorů
• Ras připojený na membránu lipidovými skupinami
• Primární fce v regulaci TF – řízení proliferace a diferenciace
• Driverová mutace v Ras – hyperaktivita enzymu – 30 % nádorů
• Rezistentní k GAPs (GTPase-activating proteins) – zamčený v aktivním stavu s
navázaným GTP
• Standardní aktivace pomocí GEF (guanine nucleotide-exchange factors) –
jejich lokalizace určuje jaká GTPáza a kde bude aktivovaná
Sos (Son-of-sevenless) – homolog RTK
Sev u Drosofily, podílí se na vývoji oka,
mutace = ztráta fotoreceptorové buňky
Bi7005 Buněčné regulace / 02 / 2. 10. 2024
45
RAS AKTIVUJE MAP KINÁZOVOU DRÁHU
• Vlastní aktivace RTKs a Ras rychle mizí (fosfatázy + GAPs)
• Pro dlouhodobé buněčné odezvy - nutné prodloužení signalizace
• Evolučně zakonzervovaný MAP kinázový komplex
• Návaznost 3 proteinkináz (serin/threoninových)
• MAPKKK -> MAPKK-> MAPK (= Raf, MEK, ERK)
• Spojení pomocí scafold proteinů – zamezení cross-talku
Bi7005 Buněčné regulace / 02 / 2. 10. 2024
46
MAP KINÁZOVÁ DRÁHA
• Fosforylované MAPK – změna konformace – dimerizace – aktivita v cytosolu nebo
translokace do jádra
• Následná fosforylace různých cílů vč. transkripčních faktorů –> vyvolání buněčné
odpovědi
• Transkripce genů včasné odpovědi (early response genes), hlavně transkripční
faktory (např. c-fos, c-myc)
• Následná transkripce genů stimulující proliferaci (např. G1 cykliny)
• Mitogenní signalizace: růstový faktor –> receptor –> MAPK dráha –> proliferace
• Délka aktivace MAPK dráhy určuje buněčnou odpověď
• Např. Působení na neurální prekurzor:
✓ EGF –> EGFR –> ERK aktivní 5 min –> proliferace
✓ NGF –> TrkA –> ERK aktivní x hodin –> diferenciace
Bi7005 Buněčné regulace / 02 / 2. 10. 2024
47
NEGATIVNÍ REGULACE
MAPK DRÁHY
Fosfatázy:
• Defosforylace signálních molekul
• Transkripčně regulované
• Stabilizace proti degradaci
Inaktivační fosforylace:
• ERK –> MEK
• ERK –> SOS
• MEK –> Raf
Bi7005 Buněčné regulace / 02 / 2. 10. 2024
48
PŘÍMÁ MEZIBUNĚČNÁ SIGNALIZACE – RTK/Rho
• Rho = rodina monomerních GTPáz (Rho, Rac, Cdc42)
• Regulace aktinového cytoskeletu (tvar, polarita, pohyb,
adheze)
• Regulace buněčného cyklu, transkripce, transportu
Role v růstu axonů
• Vazba ephrinů na ephrinové receptory (EphA 1-10, EphB 1-6)
• Eph receptor na povrchu motorických neuronů – navádění
konce axonu ke svalu
• Vazba ephrinu na Eph receptor –> aktivace RhoA –> kontrakce
aktin/myozinových komplexů –> zastavení růstu axonu –>
změna směru růstu
Bi7005 Buněčné regulace / 02 / 2. 10. 2024
49
FOSFOINOSITIDOVÁ SIGNALIZACE NAVAZUJÍCÍ NA RTK
• Hlavní dráha regulující růst a přežití buněk
• PI3K (fosfatidylinositol-3-kináza) aktivovaná pomocí RTKs
fosforyluje inositidy -> připravuje dokovací místa na
membráně
• Typicky PIP3 – POZOR není solubilní jak druhý posel IP3
• Deaktivace fosfatázou PTEN
• Mutace v PTEN – onkogenní - prodlužuje signalizaci
Bi7005 Buněčné regulace / 02 / 2. 10. 2024
50
FOSFOINOSITIDOVÁ SIGNALIZACE NAVAZUJÍCÍ NA RTK
• PI3K – 3 třídy, často heterodimerické
• Regulační podjednotka se váže na pRTK nebo na GPCR
• Katalytická tvoří PIP3
• Na PIP3 se váží proteiny PH doménou (pleckstrin homology)
• PH doménu má > 200 proteinů (např. SOS, Akt)
• Serin/threoninová kináza Akt
• PI3K/AKT dráha - hlavní regulátor přežívání a růstu u buněk
obratlovců i bezobratlých
Třídy PI3 kináz
Bi7005 Buněčné regulace / 02 / 2. 10. 2024
51
PI3K/AKT DRÁHA STIMULUJE PŘEŽITÍ A RŮST BUNĚK
• Přežití buněk ≠ proliferace
• Typickým signálem insulin nebo IGFs (insulin-like growth factors), ale i jiné růstové faktory
• Na PIP3 se současně váže PDK1 (phosphoinositide-dependent protein kinase 1) a Akt
• Akt po aktivaci fosforyluje cílové proteiny na membráně, v cytosolu a v jádře
• Často je fosforylace inaktivující (např. Bad – inhibitor antiapoptotického Bcl2)
Bi7005 Buněčné regulace / 02 / 2. 10. 2024
52
Bi7005 Buněčné regulace / 02 / 2. 10. 2024
53
PI3K/AKT/mTOR DRÁHA STIMULUJE PŘEŽITÍ A RŮST BUNĚK
• Růst buněk závislý na aktivaci kinázy mTOR (mammalian target of
rapamycin)
• Rapamycin = bakteriální toxin, inhibuje kinázy, imunosupresivní a
protinádorová funkce (komerčně dostupný Sirolimus)
• Kináza se vyskytuje ve dvou multiproteinových komplexech
mTORC1 a mTORC2
• mTORC1 – obsahuje protein Raptor – komplex je senzitivní na
rapamycin – stimuluje buněčný růst
• mTORC2 – obsahuje protein Rictor – komplex není senzitivní na
rapamycin – stimuluje buněčné přežití aktivaci Akt kinázy a
reguluje aktinový cytoskelet
• Aktivace mTOTRC1 – růstovými faktory a živinami (AMK)
Bi7005 Buněčné regulace / 02 / 2. 10. 2024
54
PŘEKRYV SIGNÁLNÍCH DRAH AKTIVOVANÝCH
GPCR A RTK
• Společná aktivace (např. PLCγ)
• Aktivace rozdílných drah –> stejné cílové
proteiny
• Interakce mezi dráhami umožňuje různým
signálům koordinovat navzájem svůj efekt
Bi7005 Buněčné regulace / 02 / 2. 10. 2024
55
CYTOKINY A JEJICH RECEPTORY
• Receptorů pro cytokiny je několik skupin (často dimery,
trimery)
• Různé ligandy - interleukiny, interferony, růstové faktory…
• Typ I a II – asociované s cytoplasmatickými tyrozinkinázami JAK
• JAKs (pův. „just another kinases“) –> Janus kinases - dle
římského boha, mají dvě podobné domény - kinázovou a
inhibiční
• JAKs fosforylují a aktivují transkripční regulátory STAT (signal
transducers and activators of transcription)
Bi7005 Buněčné regulace / 02 / 2. 10. 2024
56
RECEPTORY PRO CYTOKINY AKTIVUJÍ JAK-STAT SIGNÁLNÍ DRÁHU
• Po nasednutí ligandu -> crossfosforylace JAKs –> fosforylují cytoplasmatickou část receptoru –>
vytvoří dokovací místo pro STAT
• Po fosforylaci se STAT disociuje a může homo/hetero-dimerizovat
díky SH2
• Následná translokace dimeru do jádra – vazba na odpovídající
DNA element – iniciace transkripce cílových genů
• Regulace signalizace: transkripce inhibitorů
Bi7005 Buněčné regulace / 02 / 2. 10. 2024
57
RECEPTORY PRO LIGANDY Z TGFβ SUPERRODINY AKTIVUJÍ
PROTEINY SMAD
• TGFβ superrodina, > 30 strukturálně příbuzných dimerických proteinů
• Podrodiny: TGFβ, Aktiviny/Inhibiny, BMPs
• Regulace širokého spektra biologických funkcí
• Během vývoje: proliferace, diferenciace, smrt, produkce ECM..
• V dospělosti: hojení tkání, imunitní odpověď, ..
• Receptory (typ I a II) mají serin/threoninovou kinázovou doménu
• Dimer ligandu se váže na heterotetramerický komplex receptorů
• Aktivace kinázové domény (typ II fosforyluje typ I)
• Následná vazba a fosforylace Smad proteinu
• Fosforylovaný Smad se spojí s dalšími Smad molekulami a translokuje
do jádra
• V závislosti na dalších transkripčních regulátorech – různé cílové geny
58
Cytoplasmatické
tyrozinkinázy
Bi7005 Buněčné regulace / 02 / 2. 10. 2024
59
CYTOPLASMATICKÉ TYROZINKINÁZY
• Receptory nemající vlastní tyrozinkinázovou doménu
• Asociují s cytoplasmatickou tyrozinkinázou – fosforylace cílových proteinů (včetně receptoru)
• Cytoplasmatická tyrozinkináza je nekovaletně navázaná na receptor
• Příklady: receptory pro antigen a interleukiny u lymfocytů, integriny, receptory pro hormony a cytokiny
• Častá kooperace s rodinou cytoplasmatických kináz Src (Src, Yes, Fgr, Fyn, Lck, Lyn, Hck, a Blk)
• Obsahují SH2 a SH3 domény – vazba na receptor a na lipidové řetězce
• Aktivují se po vazbě ligandu na receptor
• Můžou se vázat i na RTK – následně vzájemná aktivace – zesílení a prodloužení signalizace
• Asociace s integriny – spojené s ECM – podíl na tvorbě fokálních adhezí
• FAK (focal adhesion kinase) – navazuje na cytoplasmatickou část integrinů – fosforyluje se a tvoří dokovací
místo pro Src – fosforylace cílových proteinů včetně cílů RTK signalizace
• Společná signalizace: adheze k vhodnému podkladu kde může přežít, růst, dělit se…
Bi7005 Buněčné regulace / 02 / 2. 10. 2024
60
c-Src
• První objevená tyrozinkináza (1979)
• Homologní k v-Src (Rous sacoma virus)
• V neaktivní formě vazba na mastnou kyselinu (myristovou) a membránu
• Aktivace pomocí RTK (EGFR, HGFR), GPCRs nebo receptory bez kinázové domény
• Následně: odstranění fosfátu z c-konce + vazba aktivačního proteinu na SH3 + fosforylace
• Funguje jako signalizační integrátor – musí nastat více aktivačních kroků
• Kooperace s dalšími dráhami – MAPK, STAT, AKT.. -regulace proliferace, přežití, pohybu
• Mutace -> ≈ 50 % of nádorů střeva, jater, plic, prsa, pankreas
Bi7005 Buněčné regulace / 02 / 2. 10. 2024
61