Buněčná regulace
intracelulárními receptory
doc. RNDr. Jakub Neradil, Ph.D.
Ústav experimentální biologie PřF MU
Bi7005 Buněčné regulace / 3 / 6. 11. 2024
Bi7005 Buněčné regulace / 03 / 6. 11. 2024
2
OSNOVA:
• Ligandy nukleárních receptorů
• Nukleární receptory
• Regulace buněčné odpovědi nukleárními receptory
• Signalizace oxidem dusnatým
3
Ligandy nukleárních receptorů
Bi7005 Buněčné regulace / 03 / 6. 11. 2024
4
• Malé hydrofobní/lipofilní molekuly – prochází přes plasmatickou membránu cílové buňky
• Vazba na intracytoplasmatické receptory - funkce transkripčních regulátorů
• Pomalá buněčná odpověď – na úrovni genové exprese
• Ligandy: steroidní hormony, tyroidní hormony, retinoidy, vitamín D – různá struktura a funkce
• Receptory: strukturálně příbuzné – superrodina nukleárních receptorů
• Poměrně velká část receptorů doposud nemá známé ligandy = „orphan“ receptory
• Ligandy nemusí být vždy extracelulární, ale i intracelulární
• Např. pro PPARs (peroxisome proliferation activated receptors) – ligandy jsou lipidové metabolity
Bi7005 Buněčné regulace / 03 / 6. 11. 2024
5
Steroidní hormony
• Původ z cholesterolu
• Kortizol – produkce kůrou nadledvin- fce při zátěži organismu - katabolismus
• Pohlavní steroidní hormony - testosteron, progesteron, estrogeny – testes/ovaria
• vitamín D – syntéza v kůži u obratlovců- konverze na aktivní formu v
játrech/ledvinách - vstřebávání vápníku
• ekdyson - u hmyzu – aktivace epidermálních buněk -> svlékaní
Tyroidní hormony
• Původ z tyrozinu: tyroxin (T4) a trijodthyronin (T3)
• Pro syntézu potřebují jód z krve
• Zvyšují intenzitu metabolismu
Retinoidy
• Původ z vitaminu A (retinol)
• Morfogeny - vliv na vývoj obratlovců
6
Nukleární receptory
Bi7005 Buněčné regulace / 03 / 6. 11. 2024
7
• Ligandy samostatně špatně rozpustné – v krvi a extracelulárně vazba na přenašeče
• Nukleární receptory - po vazbě ligandu interagují s DNA
• Některé receptory „čekají“ na ligand v cytoplasmě jiné přímo na DNA
• Před vazbou ligandu v neaktivním stavu – vazba inhibičního komplexu
• Vazba ligandu změní konformaci receptoru – uvolnění inhibitorů- navázání
koaktivátorů – aktivace transkripce
• Možná i inhibice transkripce nukleárním receptorem – po vazbě ligandu se z
transkripčního aktivátoru stane transkripční represor
RAR - receptor pro kys. retinovou
Bi7005 Buněčné regulace / 03 / 6. 11. 2024
8
NUKLEÁRNÍ RECEPTORY
• Příbuznost na základě AMK sekvencí – 3 konzervované domény
• N-terminální region (100-500 AMK) – obvykle aktivační funkce
• DNA-vazebná doména – prostřední – opakování motivu zinkových prstů (obvykle 2x)
• Ligand-vazebná doména na C-konci – u některých receptorů funguje jako inhibiční
doména (bez ligandu)
• Jaderné receptory nemají: rostliny, řasy, houby, prvoci
• C. elegans ≈ 270, u člověka > 50
• Bezobratlí: nemají receptory pro steroidní hormony
(nadledvinkové ani pohlavní hormony)
• Vývoj receptorů pro steroidní hormony až od strunatců
– regulace reprodukce, diferenciace, homeostáza, …
Bi7005 Buněčné regulace / 03 / 6. 11. 2024
9
MODULÁRNÍ STRUKTURA NUKLEÁRNÍCH RECEPTORŮ
A/B region:- AF1 (activation function) doména - nezávislá na ligandu
- transkripčně aktivační funkce
- vysoká variabilita
C region: - DNA vazebná doména (DBD)
- motivy zinkových prstů (obvykle 2x)
- vysoce konzervovaná
D region: - pantová doména
E region: - ligand vazebná doména (LBD)
- dimerizační doména
- AF2 doména – závislá na ligandu
- transkripčně aktivační funkce
F region: - variabilní sekvence - funkce neznámá
VDR-RXR heterodimer s ligandy
Bi7005 Buněčné regulace / 03 / 6. 11. 2024
10
HETERODIMERICKÉ NUKLEÁRNÍ RECEPTORY
• Pouze v jádře, bez ligandu potlačují transkripci vazbou na DNA
• Asociace s histon deacetylázovými komplexy –> deacetylace histonů
• Po vazbě ligandu – konformační změny –> navázání histon acetylačních
komplexů –> acetylace histonů –> vazba dalších iniciačních komplexů + RNA
polymerázy II
Bi7005 Buněčné regulace / 03 / 6. 11. 2024
11
HOMODIMERICKÉ NUKLEÁRNÍ RECEPTORY
• Bez ligandu = lokalizace v cytoplasmě vs. vazba ligandu = translokace do jádra
• Např. glukokortikoidový receptor (GR)
• Bez ligandu je LBD rozvolněná pomocí chaperonu Hsp70 = nelze translokovat
• Ligand uvolní Hsp70 naváže se Hsp90 –> správné sbalení = transport do jádra
• Lokalizace na responzivní element –> navázání histon acetylačních komplexů –>
acetylace histonů –> vazba dalších iniciačních komplexů + RNA polymerázy II
Bi7005 Buněčné regulace / 03 / 6. 11. 2024
12
Bi7005 Buněčné regulace / 03 / 6. 11. 2024
13
RESPONZIVNÍ ELEMENTY
• Místa na DNA se specifickou sekvencí – vazba nukleárních receptorů
• Často dva repeaty – 6bp
Homodimerní receptory – vazba na invertované repeaty, předpoklad
vazby symetrického dimeru
• GRE - glucocorticoid receptor response element
• ERE - estrogen receptor response element
Heterodimerické nukleární receptory - obsahují RXR podjednotku + další,
vazba na přímý repeat
• RXR-VDR – odpověď na vitamín D3 – vazba na přímý repeat s mezerou
3 bp = VDRE (vitamin D response element)
• RXR-TR – odpověď na tyroidní hormony - vazba na stejný repeat s
mezerou 4 bp = TRE (thyroid hormone response element)
• RXR-RAR – odpověď na kyselinu retinovou - vazba na stejný repeat s
mezerou 5 bp = RARE (retinoic acid response element)
Bi7005 Buněčné regulace / 03 / 6. 11. 2024
14
DLOUHODOBÁ BUNĚČNÁ ODPOVĚĎ PO AKTIVACI NUKLEÁRNÍCH RECEPTORŮ
Bi7005 Buněčné regulace / 03 / 6. 11. 2024
15
NUKLEÁRNÍ RECEPTORY INTERAGUJÍ S DALŠÍMI TRANSKRIPČNÍMI FAKTORY
• Nukleární receptory neovlivňují transkripci samostatně – vždy v komplexu
• Tkáňová specifita - nasednutí na DNA závisí na typu buněk – specifická přístupnost jednotlivých úseků DNA
• V jednom promotoru – více responzivních elementů současně
• Výsledek transkripce závisí na kooperaci – pozitivní vs. negativní
• Transaktivace – vazba jednoho transkripčního regulátoru usnadní vazbu dalšího
• Transreprese – některé nukleární receptory nemusí mít responsivní element v promotoru – i tak ovlivňují
transkripci – vazba na jiné TFs- inhibují jejich funkci
Transaktivace CREB glukokortikoidovým receptorem
(CREB =Cyclic AMP Response Element Binding Protein)
Transreprese JUN/FOS glukokortikoidovým receptorem
Bi7005 Buněčné regulace / 03 / 6. 11. 2024
16
FOSFORYLACE NUKLEÁRNÍCH RECEPTORŮ
• Nukleární receptory obsahují potenciální místa fosforylace = cíle kináz
• Často vazba na AF1 doménu tj. aktivační doména nezávislá na ligandu
např. u myši bez ovarií (estrogenu) popsáno, že EGFR aktivuje MAPK dráhu –> nukleární estrogenový receptor
je aktivován i bez ligandu, exprese cílových proteinů estrogenového receptoru
• Následky fosforylací:
✓ Umožnění dimerizace a vazbu ligandu
✓ Umožnění interakce s RNA polymerázou II a
s proteiny koaktivačního komplexu
✓ Navázání ubiquitinligázy = destrukce
receptoru v proteazomu
17
Regulace buněčné odpovědi
nukleárními receptory
Bi7005 Buněčné regulace / 03 / 6. 11. 2024
18
ROLE NUKLEÁRNÍCH RECEPTORŮ V LIPIDOVÉM METABOLISMU
Bi7005 Buněčné regulace / 03 / 6. 11. 2024
19
ROLE RETINOIDŮ A REXINOIDŮ VE VZTAHU K TUMORIGENEZI
a) Blok mitogenní signalizace na úrovni TF
b) Indukce diferenciace
c) Blok buněčného cyklu v G1
d) Indukce postmaturační apoptózy
e) Indukce apoptózy nediferencovaných buněk
f) Indukce apoptózy v kooperaci s chemoterapií
Bi7005 Buněčné regulace / 03 / 6. 11. 2024
20
MECHANISMUS TRANSKRIPČNÍ REPRESE A
AKTIVACE RAR-RXR HETERODIMERŮ
Bez ligandu
• na RAR-RXR navázaný korepresorový komplex (CoR)
• + histondeacetyláza (HDAC)
• HDAC – odstraňuje acetyly z histonů –> kondenzace
chromatinu –> silencing
S ligandem
• Konformační změna v LBD
• Uvolnění korepresoru –> navázání koaktivátoru (CoA)
• Možná fosforylace receptorů MAPK dráhou
• Navázání histon acetyltransferáz (HATs) – acetylace
histonů- dekondenzace chromatinu
• Navázání dalších stabilizačních komplexů a polymerázy II
Bi7005 Buněčné regulace / 03 / 6. 11. 2024
21
FUNKCE RETINOIDŮ U AKUTNÍ PROMYELOCYTÁRNÍ LEUKEMIE
• APL – typická translokace t(15;17), vznik fúze proteinů PML-RAR
• PML-RAR snadno dimerizuje nebo oligomerizuje
• Snadno navazuje HDACs – super-represe cílových genů spojených s diferenciací
• Pouze terapeutická koncentrace retinoidů uvolní represory
• Navázání koaktivátorů a histon acetyltransferáz
• Diferenciační terapie
Bi7005 Buněčné regulace / 03 / 6. 11. 2024
22
ROLE STEROIDNÍCH HORMONŮ V KAPACITACI SPERMIÍ
• Kapacitace je nutná pro schopnost spermie
proniknout do oocytu
• Schopnost hyperaktivace (rychlý asymetrický pohyb
bičíku) a akrozomální reakce (vylití hydrolytických
enzymů z akrozomu)
• CATSPER = iontový Ca2+ kanál na bičíku
• aktivovaný progesteronem z folikulárních buněk a
zvýšeným pH (eflux HCO3
-)
• Otevření kanálu –> intracelulární zvýšení Ca2+
• Vlna uvolnění Ca2+ v cytoplasmě až k akrozomu
• Fúze membrány, rozpad akrozomu
• Změna motility bičíku
Bi7005 Buněčné regulace / 03 / 6. 11. 2024
23
ROLE STEROIDNÍCH HORMONŮ V REGULACI
MLÉČNÉ ŽLÁZY
• Estrogeny a progesteron: přechodná produkce během
menstruačního cyklu (žluté tělísko) a trvale během
těhotenství (placenta) – zabránění ovulace
• Vliv na vývoj mléčné žlázy, produkci mléka a zachování
endometria
Mléčná žláza:
• Tvořena kanálky zakončenými laloky a lalůčky
• Kmenové buňky diferencují do bazální a luminální vrstvy
• Během opakovaných estrálních/menstruačních cyklů
proliferace a diferenciace buněk a bez následného
těhotenství involuce
Bi7005 Buněčné regulace / 03 / 6. 11. 2024
24
• Během těhotenství: dlouhodobá expanze buněk, prodlužování kanálků (estrogen) a větvení a nové lobuly
(progesteron)
• Kmenové buňky – negativní pro oba receptory – proliferace a diferenciace
• Neproliferativní buňky luminálního epitelu – exprese progesteronových i estrogenových receptorů
• Estrogen a progesteron u nich spustí expresi jiných růstových faktorů (amphiregulin, Wnt4, RANKL..)
• Kmenové buňky mají pro ně receptory (ErbB2, Lrp5, RANK) – proliferace
• Vznik progenitorů a diferenciace do bazálních a luminálních buněk
25
Signalizace oxidem dusnatým
Bi7005 Buněčné regulace / 03 / 6. 11. 2024
26
SIGNALIZACE POMOCÍ OXIDU DUSNATÉHO (NO)
• Plyn: volně prochází plasmatickou membránou
• Lokální a krátkodobé působení (poločas 2-30s)
• Po reakci s H2O a O2 vznik dusičnanů a dusitanů
• Difuze z endotelových buněk do hladkého svalstva -> relaxace
• Dilatace cév (např. zásobující srdce) -> zvýšené zásobení krví
Bi7005 Buněčné regulace / 03 / 6. 11. 2024
27
SIGNALIZACE POMOCÍ OXIDU DUSNATÉHO (NO)
• Aktivace endotelií acetylcholinem -> fosfolipáza C -> IP3-> Ca2+/kalmodulin -> NO syntáza -> NO
• Vznik NO z O2 a argininu
• Difuze do svalových buněk – vazba na NO receptor –> změna konformace
• Přímá aktivace cílových enzymů – guanylátcykláza –> tvorba cGMP
• cGMP aktivuje efektory –> pokles vápníku –> omezená fce aktin/myozinových struktur
• Nemění genovou expresi = rychlá odezva
Bi7005 Buněčné regulace / 03 / 6. 11. 2024
28
SIGNALIZACE POMOCÍ OXIDU DUSNATÉHO (NO)
• NO –> relaxace svalových buněk
• Využití v medicíně: při infarktu nebo angině pectoris
• Aplikace nitroglycerinu – metabolizace na NO
• Uvolňuje krevní cévy a snižuje zátěž srdce
Bi7005 Buněčné regulace / 03 / 6. 11. 2024
29