5 Regulace buněčné adheze a polarity prof. Mgr. Vítězslav Bryja, Ph.D. Ústav experimentální biologie PřF MU Bi7005 Buněčné regulace / 05 ‹#› Buněčná adheze Bi7005 Buněčné regulace / 05 ‹#› CO JE TO BUNĚČNÁ ADHEZE? –Fyzická interakce buňky s extracelulární matrix nebo mezi dvěma buňkami navzájem. –U adhezí rozlišujeme: –Dobu/sílu interakce (tranzientní vs. stabilní) –Typ molekul, které adhezi zprostředkují (cadheriny, integriny, jiné…) –Funkci adheze (signalizace, pohyb, mechanotransdukce, transport, izolace) Bi7005 Buněčné regulace / 05 ‹#› ORGANIZACE BUNĚČNÝCH SPOJŮ - JEDNOVRSTEVNÝ EPITEL Těsné spoje •spojují membrány sousedících buněk •hlavní funkce je izolační, není u všech epitelů •claudiny, occludin Kotvící spoje – zajišťují propojení s cytoskeletem (mechanické vlastnosti) A.mezibuněčné – zprostředkované kadheriny 1.adhezní spoje – s aktinovým c. 2.desmozomy – s intermed. fil. B.buňka k ECM – zprostředkované integriny A.fokální adheze – s aktinovým c. B.hemidesmozomy – s intermed. f. Vodivé spoje – gap junctions •umožňují intercelulární transport malých rozpustných molekul (do 1,5 kDa) Bi7005 Buněčné regulace / 05 Jako typický model pro ilustraci různých typů adhezí se nabízí jednovrstevný epitel. Relativně stabilní adheze u nepohyblivých buněk epitelu můžeme rozdělit na: 1. Spoje těsné (zonula occludens), jejichž hlavní funkce je utěsnění bariéry mezi lumen a tkání ohraničenou epitelem. Těsné spoje jsou tvořeny dlouhými vláknitými spoji, které velmi těsně spojují membrány sousedních buněk. Tyto spoje jsou především tvoženy claudiny a occludin. Těsné spoje však nejsou přítomny u všech typů epitelů. 2. Kotvící spoje jsou napojené na cytoskelet buněk a umožňují tak přenos mechanických sil mezi buňkami anebo vůči extracelulární matrix. Kotvící spoje propojující dvě buňky jsou zprostředkovány cadheriny. Můžeme je rozdělit na dva obecné typy: adhezní spoje (adherens junctions) napojené na aktinový cytoskelet; a desmozomy, které propojují intermediární filamenta. Spoje připojující buňku k proteinům extracelulární matrix jsou zprostředkovány integriny, opět se dělí na fokální adheze spojené s aktinem, a hemidesmozomy spojené s intermediárními filamenty. Speciálním typem spojů jsou vodivé spoje (gap junctions), které umožňují přenos iontů a drobých molekul tvorbou mezibuněčných kanálů tvořených konexiny. Protože dnešní přednáška je věnovaná adhezi a migraci, budeme se především soustředit na kotvící spoje, a to především na ty spojené s aktinovým cytoskeletem, jelikož jsou to právě ty, které buněčný pohyb umožňují. ‹#› Bi7005 Buněčné regulace / 05 Kadheriny a jejich regulace ‹#› KADHERINY –Velká rodina proteinů, obsahujících více tzv. kadherinových domén –Extracelulární Ca2+ (Cadherin) je vyžadován jako kofaktor pro vazbu mezi N-terminálními doménami –Vazba je tzv. homofilní (vazebným partnerem je pouze jiný kadherin) –Klasické kadheriny (propojení s aktin. filamenty): E, N, P-cadherin –Desmozomální (propojení s interm. filamenty): desmogleiny, desmocolliny –Protokadheriny (mnoho, různé funkce) – např. Fat (buň. polarita) –Nekonvenční kadheriny (další) – např. CELSR/Flamingo, T-cadherin Bi7005 Buněčné regulace / 05 Buněčné adheze jsou zprostředkovány různými adhezními molekulami. Jedna velká skupina jsou kadheriny, které se vyznačují opakujícími se extracellulárními tzv. kadherinovými doménami. Tyto kadherinové domény váží extracelulární vápník, který je nezbytný pro vazbu k jinému kadherinu. To, že kadheriny váží jiné kadheriny, nám napovídá, že kadheriny zprostředkovávají především mezibuněčná spojení. Mezi taková spojení patří adhezní spoje (adherens junctions), které se napojují na aktinový cytoskelet. Kadheriny, které se v těchto spojích vyskytují jsou především E-cadherin, hlavní epiteliální kadherin, N-cadherin typický pro neurony a buňky u nichž proběhl EMT, a placentární P-cadherin. Desmozomy se napojují na intermediární filamenta, což nám napovídá, že se zde budou vyskytovat jiné kadheriny s vhodnou intracelulární doménou. Mezi tyto kadheriny patří hlavně ty ze skupiny desmogleinů a desmokolinů. Pak ještě také existuje velká skupina tzv. protokadherinů, které rovněž mají kadherinové domény, ale evolučně se oddělily a plní různé jiné funkce. Mezi ty patří např. Fat, o kterém ještě bude řeč. Stejně tak existuje ještě celá řada takzvaných nekonvenčních kadherinů. Např.. CELSR, o kterém se ještě také zmíníme v části věnované buněčné polaritě. ‹#› –Klasické kadheriny mají do 5 kadherinových domén, neklasické mohou mít až 30. –Kadheriny se také velmi liší ve svých intracelulárních doménách: –Flamingo/Celsr má 7 transmembránových domén, čímž se podobá GPCR receptorům –T-cadherin je v membráně zakotvený pouze glykosylfosfatidylinositolovou kotvou Bi7005 Buněčné regulace / 05 Společnou vlastností kadherinů je přítomnost různého počtu kadherinových domén, klasické kadheriny mívají do 5 takových domén, nicméně u ostatních skupin kadherinů můžeme najít až 30 domén. Kadheriny se liší v intracelulárních doménách – váží tak jiné intracelulární adaptéry nebo signální molekuly. Např. Flamingo/Celsr v ní obsahuje 7 transmembránových domén, což jej činí podobným G-proteinovým receptorům, a např. T-cadherin intracelulární doménu zcela postrádá a je na membránu napojen pouze přes GPI kotvu. ‹#› PROPOJENÍ KLASICKÝCH KADHERINŮ S CYTOSKELETEM A diagram of a structure Description automatically generated https://www.nature.com/articles/ncb3457 Propojovací komplex tvoří 3 vrstvy: 1.Signalling layer (SL) •β- a p120-catenin •Adaptérové molekuly nezbytné pro aktivaci kadherinu 2.Force-transduction layer (FTL) •α-catenin, vinculin •Zvýšení tenze adheze vede k fosforylaci vinculinu a změně jeho konformace (rozbalení), aktivaci a přenosu specifických aktinových regulátorů do vrstvy aktinového kortexu (VASP, zyxin) a jeho přestavbě. Výsledkem je zesílení adheze. 3.Actin regulatory layer (ARL) •α-actinin, eplin, palladin a další... •Vrstva aktinového kortexu s jeho regulatory schopnými modulovat jeho mechanické vlastnosti a tím regulovat pevnost a sílu adheze. Bi7005 Buněčné regulace / 05 Komplex propojující aktivované (navázané) kadheriny s aktinovým kortexem (vrstvou aktinových vláken pod buněčnou membránou buňky) je tvořeno komplexem celé řady proteinů. Tento komplex se dá funkčně rozdělit do 3 vrstev, které byly identifikovány pomocí superrezoluční mikroskopie. ‹#› Bi7005 Buněčné regulace / 05 Integriny a jejich regulace ‹#› INTEGRINY –Heterodimery - alfa a beta podjednotky (kódované zvláštními geny) –U člověka 24 typů (18 genů pro α-podj., 8 genů pro β-podj.) –Heterofilní interakce, často více ligandů –ECM: fibronectin, collagen, vitronectin, laminin –Buňky: IgCAMs (ICAM1-5, VCAM) –Př. VLA4 (integrin α4β1) – váže VCAM-1 a fibronectin –Fokální adheze (propojené s aktinovým cyt.) – různé integriny –Hemidesmosomy (propojené s AF) - integrin α6β4 –Integriny dokáží signalizovat dovnitř i ven z buňky Bi7005 Buněčné regulace / 05 Integriny představují narozdíl od kadherinů adhezní molekuly vytvářející heterofilní spoje, což znamená, že váží jiné molekuly, nikdy ne další integriny. Integriny se vždy skládají ze dvou podjednotek, alfa a beta, kódovaných zvláštními geny. Jednotlivé kombinace těchto podjednotek potom dávají dohromady různé integriny. Integriny obvykle váží molekuly ECM, nepříklad fibronectin, collagen, vitronectin, laminin. Jinak ale mohou vázat i molekuly na povrchu buněk, například některé z imunoglobulinových adhezních molekul. Různé integriny mají různě specifické cíle, avšak jsou schopné obvykle vázat vice různých molekul. Ńapř. Leukocytární integrin VLA4 (integrin α4β1) váže VCAM-1 (Vascular CAM 1), ale take fibronectin. Integriny podobně jako cadheriny tvoří domény, které propojují buněčný cytoskelet tentokrát s ECM. Hemidesmozomy jej propojují s intermediárními filamenty, a jsou tvořeny zejména integrinem α6β4. Zatímco spoje ECM s aktinovým cytoskeletem se označují jako fokální adheze, o těch poté ještě vice, až se budeme bavit o buněčné migraci. Klíčovou vlastností integrinů je jejich signalizační aktivita, kterou mohou vysílat jednak směrem dovnitř buňky, tak vazvou na receptorouv molekulu do buňky sousední. ‹#› PROPOJENÍ INTEGRINŮ S AKT. CYTOSKELETEM –Propojovací komplex tvoří podobné funkční oblasti jako u kadherinů a využívá totožné distální proteiny, významě se od nich však liší v proximální (signální) části komplexu –Kinázy FAK (focal adhesion kinase) a Src – integrinová signalizace –Klíčovým propojovacím proteinem je zde talin A diagram of a structure Description automatically generated with medium confidence Bi7005 Buněčné regulace / 05 Zdůraznit funkční podobnost kadherinových a integrinových domén, popsáno zde: https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0962892416000441 Vypíchnout také rozdíl mezi cadheriny a integriny v přítomnosti aktivní kinázy FAK/Src. https://www.nature.com/articles/s41580-022-00531-5 ‹#› INTEGRINOVÁ SIGNALIZACE A diagram of a cell line Description automatically generated https://doi.org/10.1016/j.ccell.2019.01.007 https://www.nature.com/articles/s41580-019-0134-2 •Integriny regulují buněčnou morfologii a migraci •Mají onkogenní potenciál! • •Fokální adheze: místa clusterování a aktivace integrinů; klíčová role FAK (focal adhesion kinase) a kináz z rodiny Src (SFK – Src family kinases) Bi7005 Buněčné regulace / 05 https://micro.magnet.fsu.edu/primer/techniques/fluorescence/gallery/cells/3t3/images/3t3cellsexlarg e14.jpg Vypíchnout různé downstreamy integrinové signalizace a jejich význam pro buněčnou morfologii a migraci, plus zdůraznit jejich onkogenní potenciál. ‹#› Ustavení fokálních adhezí Bi7005 Buněčné regulace / 05 ‹#› ADHERENS JUNCTIONS JAKO REZERVOÁRY SIGNÁLNÍCH MOLEKUL? –Příklad β-katenin –2 rezervoáry v epiteliálních buňkách: v AJs (kadherinový linker) a cytoplasmatické (Wnt signalizace) –Funkce kadherinové vazby je evolučně starší –oba rezervoáry nelze snadno rozlišit, dosud nebyla identifikována žádná posttranslační modifikace, která by je identifikovala –V průběhu evoluce nedošlo k oddělení obou funkcí duplikací genů, jak bylo pozorováno v jiných případech –Experimentální důkazy o propojení obou poolů A diagram of a cell division Description automatically generated Diagram of a diagram of a cell membrane Description automatically generated Bi7005 Buněčné regulace / 05 Adherens junctions vytváří specializovanou doménu v epiteliálních buňkách, která akumuluje cytoskeletární regulatory. Pooly těchto regulatorů mohou být při různých přiležitostech uvolněny: https://royalsocietypublishing.org/doi/10.1098/rsob.200267 ‹#› Bi7005 Buněčné regulace / 05 Molekuly přechodných adhezí a ERM komplex ‹#› MOLEKULY PŘECHODNÝCH ADHEZÍ –Immunoglobulinové adhezní molekuly –Obsahují imunoglobulinové domény, homofilní i heterofilní interakce –Některé slouží jako ligandy integrinů. –Př. ICAMs (intercellular adhesion molecules), VCAM (vascular), NCAM (neural), PECAM (platelet endothelial) –Selektiny –Váží sacharidové skupiny na površích jiných buněk –Konzervovaná extracelulární lektinová doména (selektiny), ovšem velmi rozdílné intracelulárně –Především na krevních buňkách a endotelu – např. důležité při rolování lymfocytů po povrchu kapiláry –L (leukocyte), E-(epithelial), P-selektin (platelet) Diagram of a diagram showing the process of a cancer cell Description automatically generated with medium confidence Bi7005 Buněčné regulace / 05 Zdůraznit evoluční příbuznost imunoglobulinových adhezních molekul a protilátek. https://www.nature.com/articles/nri2156 ‹#› RODINA PROTEINŮ EZRIN-MOESIN-RADIXIN (ERM) –Propojuje s aktinovým cytoskeletem celou řadu membránových molekul, včetně většiny IgCAMs, L-selektinu aj. (CD44, EGFR, CRB)… –Mají podobnou strukturu: –N-terminální FERM doména - váže cílovou molekulu/EBP50 a PI(4,5)P2 –Centrální helikální doména –C-terminální doména (C-ERMAD) – váže aktin –Fosforylace uvolňuje interakci mezi FERM a C-ERMAD, čímž aktivuje ERM protein a umožňuje jeho vazebnou aktivitu a interakci s b. membránou –Mezi aktivující kinázy ERM protein patří např. různé PKC (Ca2+ signalizace), ROCK (RhoA efektor) –ERM proteiny linkují membránové molekuly přímo anebo přes EBP-50 A diagram of a direct association Description automatically generated PI(4,5)P2 PI(4,5)P2 Bi7005 Buněčné regulace / 05 ‹#› ARCHITEKTURA AKTOMYOSINOVÉHO CYTOSKELETU URČUJE POZICI CENTROZOMU VŮČI GEOMETRICKÉMU STŘEDU BUŇKY A diagram of a network with Ryugyong Hotel in the background Description automatically generated A collage of images of a variety of objects Description automatically generated Pozice adhezí tedy určuje pozici centrozomu a s ním spojených organel (Golgiho aparát). Bi7005 Buněčné regulace / 05 Adheze na periferii tedy mohou skrze svou signalizaci řídit I vnitřní uspořádání buňky. https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0960982221000026 ‹#› Bi7005 Buněčné regulace / 05 Epiteliální polarita ‹#› OSY POLARIZACE V EPITELU –Apikálně bazální – takřka u všech epitelů –Planární – pokud je potřeba funkčně specifikovat směr i v rovině epitelu. A diagram of a cell polarity Description automatically generated Bi7005 Buněčné regulace / 05 ‹#› Bi7005 Buněčné regulace / 05 Apikobazální (AB) polarita ‹#› ERM-vázající CAMs cadheriny EPITELIÁLNÍ BUNĚČNÁ POLARITA –Navzdory funkční propojenosti musí být zachována funkční polarita epiteliálních buněk: –Specifické molekuly musí být orientovány do lumen, zatímco jiné na rozhraní buněk a ECM, jinak epitel nemůže plnit své funkce. –Polaritu buněk můžeme vidět –Na existenci specializovaných struktur (např. microvilli, cilie) –Orientaci vnitřních struktur (např. osa nucleus - Golgiho aparát/centrozom) –Orientaci cytoskeletu (apikobázální orientace mikrotubulů, apikální konstrikce u epitelů vytvářející tubuly) Bi7005 Buněčné regulace / 05 10.1038/nrm3775 ‹#› MOLEKULÁRNÍ ZÁKLAD APIKOBAZÁLNÍ POLARITY – Signální dráha apikálně bazální (Par) polarity –Evolučně konzervovaná síť proteinů řídící buněčnou polaritu (nejen) epitelů. –V epitelech je jejím hlavním úkolem odlišit od sebe apikální a bazální stranu buňky a vytvořit maturované mezibuněčné spoje (TJ a AJ). –Signalizaci lze rozdělit do 3 funkčních domén: –Apikální – CRB, Pals, Patj –Jádro Par signalizace – koordinace a vymezení apikální a bazolaterální domény –Par3 – lokalizuje do apikolaterálního adhezního komplexu (TJ, AJ) –CDC42, aPKC, Par6 – apikální –Par1, Par5 - bazolaterální –Bazolaterální – Dlg (Discs large), Lgl (Lethal Giant Larvae), Scrib (Scribble) A diagram of cell membrane Description automatically generated Bi7005 Buněčné regulace / 05 https://www.tandfonline.com/doi/full/10.4161/21541248.2014.973768 ‹#› Apikální doména Jádro PAR signalizace Bazolaterální doména Bi7005 Buněčné regulace / 05 Není nutno do detailu znát ‹#› APIKOLATERÁLNÍ ADHEZNÍ KOMPLEX –PAR3 (partitioning-defective 3) –Potenciálně klíčová komponenta celé signalizace, unikátní schopnost oligomerizovat (→ phase separation). –Součást PAR komplexu – s PAR6 a atypickou protein kinázou C (aPKC) –PAR komplex je esenciální funkční organizátor A-P polarity Bi7005 Buněčné regulace / 05 ‹#› Význam C. elegans pro objev principů A-P polarity – – •A-P polarity využívá stejné mechanismy jako první asymetrické dělení u zygoty C. elegans. Odtud terminologie PAR = partitioning-defective. Diagram of a cell cycle Description automatically generated Bi7005 Buněčné regulace / 05 https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S153458071730549X ‹#› ROLE PAR SIGNALIZACE V POLARIZACI –Par signalizace neobsahuje komponentu s charakterem receptoru pro vnější signál. V naprosté většině buněčných kontextů tak vnější signál rozhodující o směru polarizace může být různého charakteru: –Preexistující bias –Ustavené spoje s ECM nebo jinými buňkami –Architektura cytoskeletu (např. pozice centrozomu a asociovaných organel) –Lokalizace specifických receptorů na povrchu buňky –Nový poziční signál –Adhezní signalizace (integriny, selektiny…) –Jakákoli jiná mezibuněčná signalizace (EGF, Wnt…) –Mechanický stimulus (např. stlačení) –Gradientové stimuly (chemotaxe, koncentrace živin) –Par systém tedy nejspíše nemá lineární charakter jako jiné signalizace, pouze amplifikuje jiné poziční signály, a realizuje vznik funkční polarity pomocí antagonistických interakcí svých komponent. Diagram of a cell culture diagram Description automatically generated Bi7005 Buněčné regulace / 05 ‹#› ADHEZNÍ SPOJE JSOU Z HLEDISKA AKTINU NEJDYNAMIČTĚJŠÍ ČÁSTÍ EPITELU A collage of images of a cell Description automatically generated •Místa mechanického propojování epiteliálních buněk vyžadují častou přestavbu, aby přizpůsobily mechanické vlastnosti novým podmínkám. K tomu je potřeba různých aktinových regulatorů, typicky malých GTPáz. •Běžné důvody pro přestavbu můžou být: •Buněčné dělení •Růst •Apoptóza •Mechanický stres •Transmigrace leukocytů Skryté (“kryptické”) protruze v místech adhezních spojů, které vznikají jako vedlejší produkt aktivity aktinových regulátorů (Rac, Rho, Cdc42). Bi7005 Buněčné regulace / 05 https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0021925823002132 ‹#› BAZOLATERÁLNÍ DOMÉNA –SCRIB (Scribble), DLG (Discs large), LGL (Lethal giant larvae) –Nejméně známá část polaritní signalizace. –U Drosophily řídí vznik septate junctions, u obratlovců velká míra redundance. –Při KO SCRIB a jeho paralogů (Erbin, Lano) dochází ke kompletní disrupci AB polarity u buněk kol. karcinomu. –Interakce s proteiny planární polarity (viz dále) a mezibuněčnými spoji (beta-katenin) A diagram of a computer Description automatically generated with medium confidence Bi7005 Buněčné regulace / 05 https://rupress.org/jcb/article/218/7/2277/120961/Scribble-Erbin-and-Lano-redundantly-regulate ‹#› Bi7005 Buněčné regulace / 05 Planární buněčná polarita (PCP) ‹#› PLANÁRNÍ BUNĚČNÁ POLARITA V KŘÍDLOVÉM EPITELU DROSOPHILY – – A diagram of a bee Description automatically generated A close-up of a fly Description automatically generated •Drosophila jakožto model mozaikovitého vývoje, obsahuje celou řadu buněčných fenotypů, které vyžadují velice přesnou poziční specifikaci. •Každá z buněk epitelu křídel obsahuje po jednom aktinovém chloupku, jehož pozice je přísně koordinována s okolními buňkami. •Planární polarizaci řídí 2 specializované polarizační signální dráhy. Bi7005 Buněčné regulace / 05 ‹#› HLAVNÍ PLANÁRNĚ POLARIZAČNÍ SIGNÁLNÍ DRÁHY U DROSOPHILY –Fat/Dachsous –Frizzled/PCP core –Obě řídí polaritu z adherens junctions. –Obě obsahují kadherinovou komponentu. –Obě se podílí na stejných procesech, jejich vzájemný vztah však není dosud plně objasněn. Bi7005 Buněčné regulace / 05 Asi 3-4 slidy. Vyzdvihnout kadherinovou povahu Fat/Dachs a Celsru a jejich lokalizaci do adherens junctions. Hierarchie PAR vs. PCP – nejdřív se musí ustavit adherens junctions, pak PCP polarizace. Drosophila jako příklad mozaikovitého vývoje, kde každá buňka musí mít přesnou poziční informaci. Důležitost poziční informace pomocí polaritních signalizací pro vnitřní uspořádání buňky (buněčný kompas). ‹#› FRIZZLED/PCP JÁDRO –Cadherinovou komponentou je atypický kadherin Flamingo (Fmi, u obrat. CELSR), který lokalizuje na oba póly buněk a kotví polarizační komplexy: –Distální – podobný receptorovému komplexu Wnt signalizace –Frizzled (Fzd) – transmembránový GPCR –Dishevelled (Dvl) a Diego (Dgo) - intracelulární –Proximální: –Strabismus (Stbm, u obratlovců VANGL) – transmembránový protein nejasné aktivity –Prickle (Pk) – intracelulární –+ další efektory zodpovědné za polarizovanou tvorbu aktinového chloupku –Charakter signálu orientujícího polarizaci v tomto modelu je v současnosti debatován. A diagram of different types of cells Description automatically generated Bi7005 Buněčné regulace / 05 ‹#› Bi7005 Buněčné regulace / 05 Připomenutí: WNT (WINGLESS/INT) – rodina ligandů – 19 genů pro proteiny Wnt u člověka a u myši – extracelulární proteiny modifikované glykosylací a palmitoylací – působí na krátké vzdálenosti, váží se k extracelulární matrix – pouze u mnohobuněčných živočichů kanonická dráha /závislá na β-kateninu/ (např. Wnt-1 or Wnt-3a) nekanonická dráha /na β-kateninu nezávislá/ (např. Wnt-5a) ‹#› DALŠÍ ROLE PLANÁRNÍ POLARITY: –Orientace mikrotubulového cytoskeletu: Bi7005 Buněčné regulace / 05 ‹#› Bi7005 Buněčné regulace / 05 PCP v epitelu u savců: vnitřní ucho Orientace stereocilií vláskových buněk ve vnitřním uchu Actin Qian et al., 2007, Dev. Biol. inner_ear_hair_cells ear%20cutout ‹#› Bi7005 Buněčné regulace / 05 Poruchy v nekanonické signální dráze Wnt u savců ‹#› Bi7005 Buněčné regulace / 05 Poruchy v nekanonické signální dráze Wnt u savců ‹#› Bi7005 Buněčné regulace / 05 Wnt/PCP dráha a konvergentní extenze frogs-gastrulation Ortology „klíčových“ genů zapojených do PCP signalizace vykazují u obratlovců typické fenotypy související s prodlužováním tělní osy - ‹#› Konvergentní extenze (CE) - video ‹#› Konvergentní extenze (CE) - video ‹#› Konvergentní extenze (CE) - video ‹#› Konvergentní extenze - video ‹#› Bi7005 Buněčné regulace / 05 PCP dráha při konvergentní extenzi ‹#› Bi7005 Buněčné regulace / 05 Buněčný princip konvergentní extenze Konvergentní extenze – migrace buněk směrem ke středu těla – vede k prodlužování tělní osy ‹#› Možnosti studia CE - Kellerovy explantáty (Xenopus) ‹#› Bi7005 Buněčné regulace / 05 Možnosti studia CE - Kellerovy explantáty (Xenopus) XLRP5MO control control XLRP5 MO LRP5MO+mLRP5 XLRP5 MO + mLrp5 ‹#› Změny tvaru buněk při CE ‹#› PCP proteiny aktivují během CE aktino-myosinový cytoskelet ‹#› exencephaly Důsledky narušené konvergentní extenze (CE) Exencefalie Hamblet et al., 2002, Development Syndromy rozštěpu páteře ‹#› Bi7005 Buněčné regulace / 05 Wnt/PCP dráha při morfogenezi Kinesin superfamily protein Kif26b links Wnt5a-Ror signaling to the control of cell and tissue behaviors in vertebrates | eLife Klíčové molekuly: Wnt5a (ligand) ROR1 a ROR2 (receptory) DVL (dishevelled) – cytoplazmatický protein ‹#› Wnt5a knockout embryo E 18.5 +/+ -/- Yamaguchi et al., 1999 Determining the Role of Wnt5a Signaling in Embryonic Limb Outgrowth via Clonal Analysis - defekty v morfogenezi struktur vystupujících z těla (outgrowth) jako jsou končetiny, ocas, hlavové struktury nebo genitálie ‹#› Wnt/PCP ovlivňuje morfogenezi díky kontrole buněčné orientace a asymetrického dělení ‹#› RRS Provided by S. Stricker Mutace v ROR2 (a také WNT5A a DVL3) způsobují Robinowův syndrom Robinowův syndrom – soubor příznaků autozomálně dominantně dědičné dyschondroplazie. Trpasličí vzrůst je disproporcionální, přítomna je brachymelie, vystouplé čelo s hypertelorismem, hypoplazie dolní čelisti s četnými anomáliemi zubů, hypoplazie skrota a penisu, kryptorchismus. Plodnost a duševní vývoj je v normě ‹#› Podobná mutace v DVL2 jako je pozorována u pacientů s RS podmiňuje specifický fenotyp buldoků a buldočků Whole genome variant association across 100 dogs identifies a frame shift mutation in DISHEVELLED 2 which contributes to Robinow-like syndrome in Bulldogs and related screw tail dog breeds Fig 1. Phenotype of screw tail breeds. (A) Photographs of typical representatives of breeds: 1. Boxer (brachycephalic and normal but docked tail), 2. Bulldog (brachycephalic and screw tail), 3. French Bulldog (brachycephalic and screw tail), and 4. Boston Terrier (brachycephalic and screw tail) (photographs courtesy of Nestle Purina PetCare).(B) 3D computed tomography reconstructions of 1) Boxer thoracic vertebrae, ventrodorsal view, 2) French Bulldog thoraco-lumbar vertebrae, ventrodorsal 3) French Bulldog thoraco-lumbar vertebrae lateral view. Pronounced kyphosis of the French Bulldog vertebral column is associated with multiple vertebral abnormalities including shortened vertebrae, hemivertebrae and butterfly vertebrae. 4) Lateral vertebral column radiograph of a Bulldog demonstrating the breed typical "screw tail" associated with multiple caudal vertebral malformations and truncation. (C) Computed tomography images of canine skulls showing the variation of skull morphologies: 1) German Shepherd (dolichocephalic), 2) Boxer 3) Bulldog 4) French Bulldog 5) Boston Terrier 6) Pug. White scale bar is 2 cm for each orientation. https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1007850.g001 ‹#› KONZERVOVANOST FZD/PCP CORE NAPŘÍČ ŽIVOČIŠNÝMI MODELY A diagram of different types of epithelium Description automatically generated A collage of images of different types of cells Description automatically generated Bi7005 Buněčné regulace / 05 https://cshperspectives.cshlp.org/content/1/3/a002964.full https://wires.onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/wdev.32 ‹#› HIERARCHIE EPITELIÁLNÍ POLARITY A BUNĚČNÝ KOMPAS 1.Iniciální signál ustavující apikálně bazální osu → CDC42 2.Stabilizace a vytvoření funkční apikobazální polarity – Par systém 3.Do vytvořených adhezních spojů se lokalizuje Flamingo/CELSR 4.Polarizace PCP na základě vnějšího signálu A white box with colorful pins Description automatically generated with medium confidence Apikobazální a planární polarita představují dvě na sebe kolmé osy, podle kterých je možné v buňce orientovat cytoskelet. Lokální aktivací aktinových regulátorů (obvykle z oblasti adhezních spojů) je možné za pomocí aktomyosinové kontraktility a orientace mikrotubulů organizovat ve 3D vnitřní architekturu buňky. Bi7005 Buněčné regulace / 05 ‹#› SHRNUTÍ –Různé adhezní molekuly tvoří specifické domény na povrchu epitelu, avšak jsou funkčně propojené pomocí aktinového kortexu. –Apikobazální polarita epitelů je řízena evolučně konzervovaným systémem PAR proteinů. –PAR signalizace nejspíše nemá lineární charakter, pouze zesiluje předem existující poziční informaci. –Apikolaterální adhezní komplex (AJ + TJ) je důležitým organizačním centrem polarity epitelů, je dynamický a může sloužit jako iniciační místo protruzivní aktivity. –Apikobazální a planární polarita vytváří 2 osy, podle kterých je vystavěna architektura aktomyosinového cytoskeletu v epitelech. Ten určuje vnitřní organizaci buňky. Bi7005 Buněčné regulace / 05 ‹#› Bi7005 Buněčné regulace / 05 Extra slides ‹#› Bi7005 Buněčné regulace / 05 OSNOVA: –Typy mezibuněčných spojení –Kadheriny –Struktura –Členění –Vazba k cytoskeletu –Integriny –Struktura, aktivace –Interakce s IgCAMs –Vazba k cytoskeletu –Epiteliální adheze k ECM –Fokální adheze (úvod) –Buněčná polarita –Apikobazální polarita –Planární dráhy buněčné polarity –Fat/Dachsous –Fzd/PCP jádro – –Buněčná migrace –Způsoby buněčné migrace –Procesy předního konce –Tok aktinu –Hierarchie signalizace protruze –Vzruchové sítě –Složení fokální adheze –Procesy zadního konce –Vazba na membránu –Kontraktilita aktomyosinu –Rozložení fokální adheze ‹#› EZRIN-VÁZAJÍCÍ MOLEKULY JSOU NEZBYTNÉ PRO APIKÁLNÍ STRUKTURY EPITELU –ERM proteiny jsou důležité pro organizaci aktinového cytoskeletu apikální strany epitelu –Lokalizace do mikrovilů, a jejich absence/dysmorfie při vyřazení ERM –Vyřazení ERM proteinů způsobuje rovněž defekty v mezibuněčných adhezích – funkční propojení aktinového kortexu po celém obvodu buňky. WT Ez-/- Diagram of cell membrane and its components Description automatically generated with medium confidence Bi7005 Buněčné regulace / 05 https://doi.org/10.1016/j.devcel.2004.05.007 Způsoby aktivace integrinů •Outside-in (nízkoafinitní vs. vysokoafinitní) •Inside-out Viz Fyz. Živ. B. – K. Souček – Mezib. Spoje, slide 51 ‹#› FAK/SRC KOMPLEX Diagram of a diagram showing different types of parking Description automatically generated with medium confidence https://www.embopress.org/doi/full/10.15252/embj.2020106234 https://www.nature.com/articles/nrm1549 Bi7005 Buněčné regulace / 05 Mechanismus FAK aktivace a recruitment a aktivace Src. Význam FAK pro buněčné procesy. ‹#› KOMPLIKACE PŘI ZKOUMÁNÍ APIKOBAZÁLNÍ SIGNALIZACE – – •PAR signalizace je přítomná ve většině buněčně polaritních procesů v živočišných tkáních. •U některých modelů řídí už velmi brzké vývojové procesy, například asymetrické dělení u zygoty C. elegans. PAR = partitioning-defective. Diagram of a cell cycle Description automatically generated Bi7005 Buněčné regulace / 05 https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S153458071730549X ‹#› USTAVENÍ APIKÁLNÍ DOMÉNY A diagram of a computer process Description automatically generated 1.PAR6 tvoří komplex s aPKC (u obratlovců PKCζ), čímž se aktivuje. 2.PAR6 s aPKC jsou lokalizovány na apikální membránu. Interakce aPKC s PI4P nebo PIP2. 3.Komplex asociuje s GTPázou CDC42, která jej lokalizuje na budoucí apikální membránu (vnější poziční informace!) 4.CRB/PALS/PATJ komplex stabilizuje apikální doménu (přímá interakce s Par6/aPKC není prokázána) . Kinázová aktivita aPKC odstraňuje jiné polaritní proteiny z apikální domény (PAR3, PAR1, LGL) Bi7005 Buněčné regulace / 05 https://www.nature.com/articles/s41580-022-00465-y ‹#› Bi7005 Buněčné regulace / 05 https://www.nature.com/articles/s41581-021-00395-6 •Model: epitel tenkého střeva • •Střevní epitel je v průběhu života neustále opotřebováván a obměňován. •Umírající enterocyty se uvolňují z horních částí vilů a jsou průběžně doplňovány z kmenových buněk na dně krypt (viz. Fyziologie buň. systémů). •Jak se ovšem buňky dostanou na vrchol vilů? • • •Model: epitel tenkého střeva •Klasický model – tlakem dělících se buněk •Neobstojí – buňky ozářených myší se pohybují i pokud je buněčné dělení zastaveno A close-up of a scientific presentation Description automatically generated https://www.science.org/doi/10.1126/science.aau3429# •Model: epitel tenkého střeva •Aktivní migrace? •Indukcí mozaikové exprese aktinového reportéru se ukázalo, že buňky tvoří na bazální straně (“kryptická”) lamellipodia, závislá na aktinovém regulátoru Arp2/3. • • A collage of images of cells Description automatically generated A collage of images of cells Description automatically generated A collage of images of cells Description automatically generated CK666 = inhibitor Arp2/3 •Model: epitel tenkého střeva •Aktivní migrace •Indukcí mozaikové exprese aktinového reportéru se ukázalo, že buňky tvoří na bazální straně (“kryptická”) lamellipodia, závislá na aktinovém regulátoru Arp2/3. •→ Hypotéza – buňky migrují ve vilech aktivně pomocí kryptických lamellipodií. •→ matematický modelling: •předpověď hustoty, rychlosti buněk a mechanické tenze v jednotlivých kompartmentech → experimentální ověření • • • • • Diagram of a diagram showing a large intestine Description automatically generated •Model: epitel tenkého střeva •Aktivní migrace •Experimenty potvrdily gradient mechanické tenze a rostoucí rychlosti buněčné migrace směrem ke špičce vilu. Z dřívějška rovněž byla známa důležitost mezibuněčných adhezních spojů pro celý process. •Pokud se však buňky pohybují pomocí lamellipodií na bazální straně, proč pro správnou migraci potřebují mezibuněčné spoje? Jak jsou mezibuněčné spoje lokalizované na laterálních stranách propojeny s migračním procesem na bazální straně? • • • • Diagram of a diagram showing a large intestine Description automatically generated Totožnost distálních regulátorů aktinu umožňuje funkční propojení cadherinových a integrinových adhezí •Model: epitel tenkého střeva •Aktivní migrace •Jak jsou mezibuněčné spoje lokalizované na laterálních stranách propojeny s migračním procesem na bazální straně? •Další výzkum zjistil, že kryptická filopodia jsou přítomná i u jiných modelů kolektivní epiteliální migrace. •Adherens junctions (AJ) slouží jako rezervoáry aktinových regulátorů v epitelu, a to včetně Arp2/3. Při vyšší mechanické tenzi, nebo při experimentální disrupci AJ se tyto molekuly uvolňují a dochází k tvorbě kryptických lamellipodií. Směrovaná tenze tak umožňuje orientovanou tvorbu lamellipodií. • • • • • • A diagram of a cell Description automatically generated https://rupress.org/jcb/article/219/10/e202008069/152110/Hands-and-feet-Closer-than-you-think-in-ep ithelial CDC42 •Od kvasinek až po lidské neutrofily, CDC42 je klíčová molekula pro regulaci polarity eukaryotických buněk •https://journals.biologists.com/jcs/article/117/8/1291/28257/Cdc42-the-centre-of-polarity Ústřední role CDC42 v koordinaci polaritních komplexů. Komplikace při zkoumání apikobazální signalizace •U obratlovců existuje redundance mezi komponentami PAR signalizace, čímž se ztěžuje její zkoumání. U bezobratlých modelů, které jsou nejlépe prostudovány, se však morfologie klíčové mezibuněčné adhezní domény liší. •U Drosophily neexistují těsné spoje, místo nich jsou zde tzv. septate junctions (SJ), které však mohou být v různých pozicích vůči AJ v závislosti na typu epitelu. U C. elegans existuje jen jeden kombinovaný typ spoje. A wire with a spiral Description automatically generated with medium confidence C. elegans Drosophila vertebrates midgut jiné epitely Cytoskeletární efektory AB polarity V apikolaterálním adhezním komplexu se schází efektory všech tří domén za účelem maturace a údržby buněčných spojů A diagram of a cell division Description automatically generated A diagram of a diagram of a gene Description automatically generated with medium confidence https://www.tandfonline.com/doi/full/10.4161/21541248.2014.973768 https://www.nature.com/articles/ncb0701_e168 Fat/Dachsous •3 komponenty: •Ft a Dachs – protokadheriny •Four-jointed (Fj) – kináza v Golgi aparátu, modifikuje jejich extracelulární domény, čímž mění jejich vzájemnou afinitu. • Fj a Dachs jsou exprimovány v opačném gradientu ve vyvíjejícím se křídle. Výsledkem přeložení těchto gradientů přes sebe jsou buňky s polarizovanou distribucí Ft a Dachs. • • A diagram of different types of cells Description automatically generated A collage of several images of a cell membrane Description automatically generated