Adobe Systems
11 Buněčné regulace při hojení a imunitní reakci
prof. Mgr. Vítězslav Bryja, Ph.D.
Ústav experimentální biologie PřF MU
Bi7005 Buněčné regulace / 11

‹#›
Obsah obrázku Maso, zranění, místnost, lékařský Popis byl vytvořen automaticky
Bi7005 Buněčné regulace / 11

‹#›
STÁDIA HOJENÍ
1.Hemostáza
2.Zánět
3.Proliferace
4.Remodelace
Bi7005 Buněčné regulace / 11

‹#›
HEMOSTÁZA
–Zastavení krvácení
–Tvorba lešení pro molekuly a buňky dalších fází
–Vazokonstrikce a srážení krve
–Hlavní buněčný typ: krevní destičky
–Hlavní nebuněčná komponenta: fibrinogen/fibrin
–
Bi7005 Buněčné regulace / 11

Vazokonstrikce – velmi rychlá odpověď na poranění vyvolaná látkami z poškozených buněk (endothelin
z endothelia, adrenalin, noradrenalin a prostaglandiny)
    - dočasná – hypoxie a acidóza v místě poranění relaxuje hladkou svalovinu cév

‹#›
ZÁNĚT
–Ochrana před infekcí
–Hlavní buněčné typy: neutrofily, makrofágy
–Hlavní nebuněčná komponenta: komplementový systém
–
–
–
Bi7005 Buněčné regulace / 11

‹#›
NESPECIFICKÁ VS. SPECIFICKÁ IMUNITA
https://www.cusabio.com/Immunology/Innate-and-Adaptive-Immunity.html
Bi7005 Buněčné regulace / 11

‹#›
NEUTROFILY
–Přitahovány – DAMPs (damage-associated molecular patterns), PAMPs (pathogen-associated molecular
patterns), cytokiny, proteiny komplementu
–Diapedézou vystupují z cév do místa poranění
–Fagocytóza nekrotické tkáně a patogenů
–Oxidační vzplanutí (reaktivní formy kyslíku)
–Uvolnění toxických granulí (hlavní náplní proteázy, dále antimikrobialní peptidy)
–Tvorba mimobuněčných sítí (tzv. NETs - neutrophils extracellular traps) - NETóza
–Apoptóza a fagocytóza makrofágy – tranzice do proliferační fáze
Bi7005 Buněčné regulace / 11

24 -36 h po zranění
DAMPs -  DNA, peptidy, komponenty ECM, ATP, kyselina močová
PAMPs – bakteriální endotoxiny – lipopolysacharidy, bakteriální a virové nukleové kyseliny -
nemethylovaný CpG motif v DNA, dsRNA, ssRNA, glykoproteiny, lipoproteiny
NETS – vlákna chromatinu s navázanými histony, cytosolickými proteiny a proteázami, které
vychytávají cizorodé mikroorganismy, proce
Neaktivované neutrofily – délka života 6-8 hodin, spontánní apoptóza
Apoptóza neutrofilů závisí na rovnováze mezi proapoptotickými (fagocytóza mikroorganizmů, TNF-α) a
prosurvival molekulami (chemokiny, DAMPS, PAMPS, proteiny komplementu, integriny – vyšší exprese
Mcl-1 – Bcl2 proteinová rodiny, blokuje vnitřní apoptotickou cestu – spontánní apoptózu)

‹#›
Obsah obrázku diagram, snímek obrazovky, text Popis byl vytvořen automaticky Obsah obrázku diagram,
snímek obrazovky, text, Vykreslený graf Popis byl vytvořen automaticky
Bi7005 Buněčné regulace / 11
NEUTROFILY
PAMP/DAMP

JAK/STAT, Nf-kB a MAP kinázová signalizace
TLR – rozpoznává PAMP a DAMP
Dectin, Mincle – lektinové receptory
Podobně makrofágy

‹#›
MAKROFÁGY
–Z krevních monocytů se v místě zranění stávají makrofágy
–Přitahovány DAMPs, cytokiny, proteiny komplementu
–Fagocytóza
–Produkce růstových faktorů pro proliferační fázi (TGF-β)
–V proliferační fázi produkují matrix metaloproteinázy (MMP) – odstranění fibrinových polymerů
Bi7005 Buněčné regulace / 11

48-72 h po zranění
Změna fenotypu monocyty/makrofágy – změna genové exprese, metabolismu, morfologie

‹#›
HOMING IMUNITNÍCH BUNĚK
–proces založený na interakcích buňka-matrix a buňka-buňka, který (prostřednictvím adhezních
molekul) zabezpečuje ukotvení cirkulujících buněk na specifických místech v poškozené tkáni
–dělí se na 5 hlavních kroků:
1.rolování (rolling)
2.zpomalení (slow-rolling)
3.zastavení (arrest)
4.hledání místa pro transmigraci (crawling)
5.transmigrace (transmigration) – paracelulární nebo transcelulární cestou
Bi7005 Buněčné regulace / 11

‹#›
–selektiny a integriny
–klidová fáze: občasné adheze (rolling, 40 µm/s)
– zánět:
–rolling se zpomaluje kvůli expresi E-selektinu na buňkách endotelu (5 µm/s)
–konformační změna LFA-1 (intermediate à high affinity) – zastavení pohybu
–hledání vhodného místa pro transmigraci (interakce Mac-1 a ICAM-1) a následná transmigrace
paracelulární nebo transcelulární cestou (DIAPEDÉZA)
Salminen et al., 2020
(https://doi.org/10.3389/fmedt.2020.600616)
Bi7005 Buněčné regulace / 11
HOMING IMUNITNÍCH BUNĚK

Neutrophil adhesion and transendothelial migration cascade:
- počas kľudovej fázy neutrofily robia občasné adheze k cievnej stene, čo sa prejavuje tzv. rolling
efektom (rýchlosť cca 40 µm/s) – sprostredkované interakciami P-selektinu a PSGL1
- rýchlosť rolovania neutrofilov je v zápalových podmienkach znížená až na 5 µm/s (skrz expresiu
E-selektinu v cievnej stene blízko zapáleného miesta)
- to nielen navyšuje počet binding miest pre PSGL1 ale spôsobuje konformačnú zmenu LFA-1 (navodzuje
intermediate-affinity až high-affinity) – slow rolling state
- skrz high-affinity LFA-1 a iné molekuly sa neskôr väzba neutrofilu na endotel zosilňuje, až kým
sa úplne nezastaví
- neutrofil sa v tomto bode začne viac a viac pritískať k cievnej stene a po nájdení miesta pre
transmigráciu (interakcia Mac-1 – ICAM-1) migrujú skrz paracelulárne alebo transcelulárne cesty k
miestu zápalu
- leukocyte adhesion deficiencies (LAD) – poruchy imunitného systému, dobre odzrkadľujú rolu
integrinov v sprostredkovaní imunitnej odpovede

‹#›
MOLEKULY PŘECHODNÝCH ADHEZÍ
–Immunoglobulinové adhezní molekuly
–Obsahují imunoglobulinové domény, homofilní i heterofilní interakce
–Některé slouží jako ligandy integrinů.
–Př. ICAMs (intercellular adhesion molecules), VCAM (vascular), NCAM (neural), PECAM (platelet
endothelial)
–Selektiny
–Váží sacharidové skupiny na površích jiných buněk
–Konzervovaná extracelulární lektinová doména (selektiny), ovšem velmi rozdílné intracelulárně
–Především na krevních buňkách a endotelu – např. důležité při rolování lymfocytů po povrchu
kapiláry
–L (leukocyte), E-(epithelial), P-selektin (platelet)
Diagram of a diagram showing the process of a cancer cell Description automatically generated with
medium confidence
Bi7005 Buněčné regulace / 05

Zdůraznit evoluční příbuznost imunoglobulinových adhezních molekul a protilátek.
https://www.nature.com/articles/nri2156

‹#›
ZÁKLADNÍ CHARAKTERISTIKY IMUNITNÍCH BUNĚK
1.Schopnost eliminace patogenu (granula, cytokiny, protilátky, přímý kontakt)
2.Schopnost migrace
3.Schopnost imunitní tolerance vůči buňkám hostitelského organismu
4.Schopnost limitace imunitní odpovědi jenom po dobu přítomnosti patogenu
5.Schopnost imunitní paměti (specifické pro adaptivní imunitní buňky)
Bi7005 Buněčné regulace / 11

‹#›
Tajemství adaptivní imunity
–Jak tělo vytvoří mechanismus, který umožní reagovat (útočit) i na to, co nikdy nepoznalo (tj. na
cokoliv neznámého/nového), aniž by zároveň útočilo na cokoliv vlastního?

‹#›
B- lymfocyty: BCR a protilátky


‹#›
VÝVOJ B LYMFOCYTŮ – KOSTNÍ DŘEŇ
1.Pro-B buňky – probíhají přestavby na těžkém řetězci imunoglobulinů (Ig)
2.Pre-B buňky – probíhají přestavby na lehkém řetězci Ig
3.Nezralé (immature) B buňky – na povrchu mají exprimovaný IgM
4.Zralé (mature) B buňky – mají na povrchu IgM i IgD
–V(D)J rekombinace
–– zdroj heterogenity v repertoáru B buněk
–   (1011 variant BCR)
–– zodpovědná RAG1/2 rekombináza (dělá DSB na specifických sekvencích RSS v jednotlivých lokusech)
–– spojení řetězců pomocí NHEJ
Zhou et al., 2020 (https://doi.org/10.1186/s12967-020-02289-w)
Bi7005 Buněčné regulace / 11

V(D)J recombination – goal is to produce as much heterogeneity in B cell repertoire as possible
In laboratory mice, there are 97 V, 14 D and 4 J segments on Igh locus (chr. 12), 94-96 V and 4 J
segments on Igk locus (chr. 6) and 3 V and 3 J segments on Igl locus (chr. 16)
Igh locus contains 8 exons (for different IgG), Igk just one constant and Igl contains 4 exons for
constant light chain
At this stage, the most proximal C chain gets joined to the mature V exon

‹#›
1.Hematopoietické kmenové buňky (HSCs) – důležitá CXCL12/CXCR4 dráha
2.Multipotentní progenitor (MPP)
3.Společný lymfoidní progenitor (CLP) – aktivace IKAROS, E2A, EBF1 a FOXO1
4.Pro-B buňky – dráha FLT3 + IL-7R (signály pro přežití a V(D)J rekombinaci) + SCF/c-Kit + TF PAX5
5.Pre-B buňky – dráha SCF/c-Kit (exprese genu pro c-Kit se ireverzibilně vypíná)
–fáze velkých pre-BII buněk charakteristická velkým proliferativním potenciálem (přechodná aktivace
Wnt signalizace)
–první checkpoint – jedině buňky s produktivními přestavbami na těžkém řetězci Ig jsou selektovány
dál
–fáže malých pre-B buněk – pre-BCR je odstraněn z buněčného povrchu, probíhají přestavby na lehkých
řetězcech Ig
6.Nezralé (immature) B buňky –  důležitá signalizace přes RANKL
17
Kuby Immunology, Seventh Edition, 2013
Bi7005 Buněčné regulace / 11
VÝVOJ B LYMFOCYTŮ – KOSTNÍ DŘEŇ (detaily, které není třeba znát)

BM stromal cells create distinct microenvironments (niches), which provide support for self-renewal
and Differentiation of HSCs to mature B cells
B cell development regulated by osteoblasts, endothelial cells, reticular cells, sympathetic
neurons (control release of hematopoietic cells from the BM)
With increasing age, 50% of stromal cells gets replaced by adipocytes and this lenghtens
hematopoietic capacity
The lineage commitment of HSCs is largely dependent on their microenvironment and signals that it
receives
Pre-pro-B cells remain in contact with CXCL12-secreting stromal cells in the BM, but once the
D(H)J(H) recombination is over, the early pro-B cells leave on to search for IL-7 producing stromal
cells (also, in this stage, PAX5 is upregulated, which results in repression of non-B lineage
genes)

‹#›
MECHANISMUS B BUNĚČNÉ TOLERANCE
1.Klonální delece
–po rozpoznání vlastního antigenu v BM dojde k vytvoření cross-linků na BCR, což vyšle signál do
buňky
–buňka je skrz tento signál hnána do apoptózy
2.Změny B-buněčného receptoru
–alternativní cesta při vysoké afinitě BCR k vlastnímu antigenu
–B buňka si v reakci na signál z BCR reaktivuje RAG1/2 a spustí opětovně VLJL rekombinaci
–výsledkem je odstranění původního, auto-reaktivního BCR, a exprese nového BCR
3.Anergie
–nastává v případě, že B buňka rozezná vlastní antigen s příliš nízkou afinitou
–dochází k snížení exprese BCR a utlumení BCR signalizace
18
Bi7005 Buněčné regulace / 11

‹#›
VÝVOJ B LYMFOCYTŮ – PERIFERNÍ KREV
–Transitional B buňky
–vývojové stádium s krátkým poločasem života
–přechod mezi nezralými B buňkami kostní dřeně a zralými B buňkami periferní krve
–pořád u nich probíhá intenzivní negativní selekce
–T1 B buňky – vyplavují se z BM a migrují do sleziny
–T2 B buňky – ve slezině zvýší expresi CD21, CD23 a IgD a schopnost cirkulace (pořád mají markery
nezralých B buněk)
–T3 B buňky – neproliferující, pokud nedojde k stimulaci BLNK, PLCγ anebo BAFF, se stávají
anergické a jsou depletovány
–Zralé (naivní) B buňky
–v krvi přežijí 7-8 týdnů, nedojde-li k aktivaci, jsou odstraněny
19
Zhou et al., 2020 (https://doi.org/10.1186/s12967-020-02289-w)
Bi7005 Buněčné regulace / 11

‹#›
Aktivace B lymfocytů přes crosslink BCR
Figure, intracellular events of B-cell activation...] - StatPearls - NCBI Bookshelf

‹#›
AKTIVACE B LYMFOCYTŮ
–dráha B-buněčného receptoru (BCR)
–po rozpoznání antigenu se signál přenese přes nekovalentně vázaný heterodimer CD79A a CD79B (vazba
umožňuje jak signalizaci do cytosolu, tak internalizaci receptoru)
–CD79 obsahuje tzv. ITAM (Immunoreceptor Tyrosine-based Activation Motif) motivy, na které se vážou
Src kinázy Lyn, Fyn a Blk
–fosforylace tyrosinů na ITAM umožňuje vytvoření komplexu BLNK, což ústí v aktivaci BTK, PLCγ2,
GRB2 a VAV
–následně dochází k aktivaci 4 drah, které zajišťují přežití a indukují proliferaci:
1.vápenatá signalizace
2.NFκB dráha
3.PI3K dráha
4.MAPK dráha
–po aktivaci B buňka migruje do lymfatické uzliny (spojené s výraznými přestavbami buněčného
cytoskeletu), kde diferencuje do plasmatické anebo paměťové B buňky
Wang et al., 2020 (https://doi.org/10.1007/978-981-15-3532-1)
Bi7005 Buněčné regulace / 11

‹#›
Aktivace B buněk v lymfatické uzlině
Lymphoid Tissues Lecture 5, 15/9/2015. Peripheral or Secondary Lymphoid Tissues Lymph nodes Spleen
Mucosal lymphoid tissues (MALT) - ppt download

‹#›
Wang et al., 2020 (https://doi.org/10.1007/978-981-15-3532-1)
REAKCE GERMINÁLNÍHO CENTRA
Bi7005 Buněčné regulace / 11
•B buňky zde exprimují aktivací-indukovanou deaminázu (AID), která deaminuje cytidinové zbytky na
IgV a regionech izotypového přesmyku
•~50 % buněk eliminovaných každých 6 hodin (pomocí represe BCL2 a BCL6)
•iniciace reakce GC
•vytvoření zón
•V GC se dějí 2 hlavní procesy:
•somatická hypermutace (SHM) –
v tmavé zóně
•izotypový přesmyk (CSR) –
ve světlé zóně

Initiation – in centre of B cell follicle, in proximity of follicular dendritic cells (FDCs); after
contact both antigen-specific naive B cells and CD4 T cells migrate towards the T-B border in the
follicle and start proliferating (+ form cognate interactions)
- some B cells proliferate extensively and form extracellular foci, and differentiate into
short-lived plasmablasts (secrete low-affinity antibodies) – capable of rapid initial response to
pathogens
Establishment of zones
- after 4 days – nascent GC
- after 7 days – fully developer GC with distinct zones (dark and light)
- dark zone – fully packed with high density of proliferating B cells (centroblasts)
- light zone – several celltypes present, including B cells, Th cells, Tfh cells, Treg, FDCs and
macrophages (here, SHM and CSR happens)
- SHM – centroblasts diversify their IgV genes and express newly generated modified antibodies �
centrocytes
- CSR – part of centrocytes undergoes CSR in order to change their immunoglobulin isotype (most
probably to IgG) and gain new effector functions
- then, some centrocytes differentiate into plasma cells and some into memory cells (unswitched or
class-switched)
GC lifespan can differ greatly depending on the stimulus (normal infections trigger GC that
collapses after ca 1 month)

‹#›
SOMATICKÁ HYPERMUTACE (SHM)  A CLASS-SWITCH REKOMBINACE (CSR)
–SHM
–mění se variabilní úseky těžkých i lehkých řetězců Ig
–produktem tohoto procesu jsou B buňky:
1.s vyšší afinitou k antigenu
2.s nižší afinitou k antigenu
3.se stejnou afinitou k antigenu
–následně ve světlé zóně GC proběhne selekce B buněk s vyšší afinitou k antigenu a ty se pak
dostávají do světlé zóny
–
–CSR
–změna na úrovni DNA způsobující přepnutí z IgM/IgD na jinou třídu Ig (IgG, IgA, IgE)
–iniciace tohoto procesu je typicky závislá na Tfh buňkách
–mění se konstantní části těžkých řetězců beze změny variabilních částí
–ve výsledku původní V(D)J řetězec asociuje s novým C řetězcem (uplatňuje se DNA rekombinace
následovaná NHEJ)
–regulační roli hrají cytokiny, např. IL-4
Bi7005 Buněčné regulace / 11

‹#›
–T-independent antigen (not a peptide) – only IgM, not a memory cell
–T-dependent antigen (= peptide) – isotypový přesmyk

‹#›
INTERAKCE S MIKROPROSTŘEDÍM  GERMINÁLNÍHO CENTRA
–signály Tfh (naivní Th buňky, které po aktivaci upregulovaly CXCR5 a migrovali do uzliny)
– důležitá signalizace přes CD40L/CD40 (CD40L na povrchu T buněk + CD40 upregulované na povrchu GC
B buněk) – vede k aktivaci NFκB dráhy a c-Myc
–Klíčová role BCL6
–
B-T synapse in FL. In GCs, at the B-T cell border, TFH cells interact... | Download Scientific
Diagram
Ochando and Braza, 2017 (https://doi.org./10.18632/oncotarget.22788)
Bi7005 Buněčné regulace / 11

BCL6 = master regulator of GC reaction (BCL6 KO mice fail to produce GCs and high-affinity
antibodies)
BCL6 suppresses G-protein coupled receptor 183 (GPR183) which must be down-regulated by GC
precursor B cells to allow their migration toward the center of the follicle, via its RD2 (moreover
BCL6-RD2 domain inhibits sphingosine-1-phosphate receptor type 1 (S1PR1) to induce confinement of B
cells in the GC
- stays upregulated through stages of centroblasts and centrocytes (allows rapid proliferation and
tolerance towards DNA damage by directly repressing ATR, TP53 snd CDKN1A)
- must be downregulated for GC B cell to exit the GC and undergo terminal differentiation
- in T cells, BCL6 promotes Tfh differentiation

‹#›
DIFERENCIACE PLASMATICKÝCH BUNĚK
–závislost na afinitě BCR (vývoj směrem do GC B buněk, paměťových nebo plasmatických buněk)
–komitment do plasmatických buněk regulují IRF4 (signály pro přežití), Blimp1 (master regulator,
inhibuje Pax5 a Bcl6, aktivuje IRF4 a transkripci Ig), CD69 a c-Myc (regulátor buněčného cyklu)
–důležité rozpoznání antigenu prezentovaného FDC v LZ (množství internalizovaných antigenů přímo
úměrné pomoci Tfh buněk i aktivitě PI3K/Akt dráhy, která inhibuje regulátor DZ fenotypu, Foxo1)
Wang et al., 2020 (https://doi.org/10.1007/978-981-15-3532-1)
Bi7005 Buněčné regulace / 11

- po střetu s CD4+ T buňkou, aktivované B buňky migrují do vnějšího regionu folikulů (intenzivní
proliferace, tvorba extrafolikulárních ohnisk, diferenciace do plasmatických buněk)
- v extracelulárních ohniskách probíhá SHM a CSR jen minoritně (většina krátce žijících
plasmatických buněk je unmutated, typu IgM) – prvotní obrana
- v GC to probíhá tak, že aktivovaná buňka proliferuje v DZ (tam probíhá i SHM pro rozšíření BCR
repertoáru), pak migruje do LZ, kde probíhá kontrola afinity (B buňka je vystavena antigenu
prezentovaného FDC, který pak internalizuje a čím víc ho internalizuje a exprimuje na svém povrchu,
tím víc je pravdepodobné, že dostane signály pro přežití a diferenciaci of Tfh buněk – pokud ty
signály dostává, migruje zpátky do DZ a opětovně proliferuje, resp. GC opouští a diferencuje do
plasmatické/paměťové buňky)
– BCR transgenní myši měli skrz nízkou afinitu depletovanou populaci plasmatických buněk, no žádný
efekt se neprojevil na populaci GC B buněk)
- výrazná hypomethylace (inhibice methylace může stimulovat diferenciaci plasmatických buněk)
- Bcl6(low) CD69(hi) cells are much more dependent on Tfh help and have already downregulated
several GC signature genes (e.g. Bcl6, Bach2, S1pr2, Efnb1) and upregulated marker for exiting
(Gpr183/EBI2)
- plasma cell precursors are more imprinted with BCR- and CD40- activation signatures than other GC
B cells
- BCR-signalling in GC B cells is generally attenuated (BCR-crosslinking results in activation of
Syk-PI3K-Akt pathway and inactivation of Foxo1, the regulator required for GC B cell proliferation
and DZ phenotype)
- strong PI3K-AKT signaling inactivates Foxo1, promoting exit from GC reaction, whereas weaker
signaling maintains active Foxo1, facilitating cell cycle reentry
- cRel critical for GC maintenance
- ablation of Tfr cells induced the generation of self-reactive plasma cells
- Cbl ubiquitin ligases, which are abundantly expressed in LZ B cells, down-regulate IRF4 protein
expression through ubiquitin-dependent degradation (strong BCR/CD40 stimulation somehow – still
unclear how – leads to degradation of Cbl and thus, upregulation of IRF4)
- plasma cell precursors (higher ICOS, also higher expression of adhesion molecules, e.g. ICAM-1,
SLAM supporting long-lasting Tfh-B cell interaction)
- length of the interaction with Tfh cells (2 min vs 5-60 min) can be linked to stronger CD40L/CD40
signalling and induction of plasma cell differentiation
- PD-1 expression on Tfh cells controls the production of IL-21 and also the migration of Tfh cells
to GCs

‹#›
Wang et al., 2020 (https://doi.org/10.1007/978-981-15-3532-1)
Bi7005 Buněčné regulace / 11
DIFERENCIACE PLASMATICKÝCH BUNĚK

‹#›
Shrnutí dění v germinálním centru:
Germinal centres: role in B-cell physiology and malignancy | Nature Reviews Immunology

‹#›
Germinal centres: role in B-cell physiology and malignancy: Ulf Klein & Riccardo Dalla-Favera
–The germinal centre (GC) of lymphoid organs is the main structure where antigen-activated B cells
diversify their immunoglobulin genes by somatic hypermutation (SHM) to generate high-affinity
antibodies. Most of the cells also undergo class-switch recombination (CSR) to generate antibodies
with specialized effector functions.
–The processes of SHM and CSR are associated with DNA-strand breaks. GC B cells use specialized
mechanisms that allow for the activity of those DNA-modifying processes without inducing a
DNA-damage response, foremost by inhibiting the p53-dependent and p53-independent responses.
–Centroblasts, which are GC B cells that undergo active SHM, are programmed to proliferate
extremely rapidly and thereby generate a large number of immunoglobulin mutations in a short time
from which high-affinity antibodies can be selected. Moreover, these cells have a pro-apoptotic
programme that ensures the rapid elimination of B cells expressing newly generated antibodies with
suboptimal binding characteristics.
–The transcription factor BCL-6 (B-cell lymphoma 6) is the master regulator of GC B-cell
differentiation, as it mediates the repression of genes involved in negative cell cycle regulation
as well as the inhibition of genes involved in B-cell activation, plasma-cell and memory B-cell
differentiation, and in the response to genotoxic stress.
–GC B cells that produce high-affinity antibodies are selected to differentiate into plasma cells
and memory B cells through specific gene expression changes that coordinately regulate
proliferation, apoptosis and differentiation. Essential for these processes are several major
transcriptional regulators that, besides BCL-6, include PAX5 (paired box protein 5), NF-κB (nuclear
factor-κB), IRF4 (interferon-regulatory factor 4), BLIMP1 (B-lymphocyte-induced maturation protein
1), and XBP1 (X-box binding protein 1)
–Genes critically involved in the regulation of proliferation, apoptosis and differentiation during
the GC response are occasionally dysregulated by genomic alterations — such as chromosomal
translocations or aberrant SHM in regulatory regions — resulting from errors during antibody gene
modifications. Therefore, the production of high-affinity antibodies comes at the risk of oncogenic
transformation.
–

‹#›
Detekce hypoxie a obnovení krevního zásobení
–

‹#›
REAKCE TKÁNÍ NA ZMĚNY V DOSTUPNOSTI KYSLÍKU A REGULACE ANGIOGENEZE
A.detekce nedostatku kyslíku - Hypoxia inducible factor (HIF)
B.iniciace angiogeneze - vaskulární endotheliální růstový faktor VEGF/VEGFR
C.buněčné mechanismy angiogeneze (role Notch a angiopoetinové signalizace)
Bi7005 Buněčné regulace / 11

‹#›
Výsledek obrázku pro nobelova cena za medicínu 2019
Bi7005 Buněčné regulace / 11

‹#›
Bi7005 Buněčné regulace / 11
HYPOXIE A HIF
–Hypoxie: snížený parciální tlak O2 ve tkáni x normoxie

‹#›
•O2 se difuzí šíří asi na 150 µm
•HIF – Hypoxia-Inducible Factor:
•Heterodimerický transkripční faktor aktivující geny obsahující v promotorové sekvenci HRE (Hypoxia
response element)
•Prozatím je známo 60 -100) genů regulovaných HIF, řada z nich reguluje odpověď na hypoxii
(angiogeneze, proliferace, metabolismus glukózy, migrace, apoptóza, erytropoeza, metabolismus Fe)
•Heterodimer sestává ze tří α podjednotek (HIF1α, 2α, 3α) a jedné podjednotky β (HIFβ=ARNT)
•α podjednotky jsou při normoxii silně labilní, podjednoteka β je na koncentraci O2 nezávislá
Bi7005 Buněčné regulace / 11
HYPOXIE A HIF

‹#›
new-2
http://www.chem.ox.ac.uk/oc/cjschofield/images/new-2.png
VHL (von Hippel-Lindau) - tumor supresorový gen
HIF PŘI NORMOXII A HYPOXII – VÝZNAM HYDROXYLACE PROLINU
Bi7005 Buněčné regulace / 11

‹#›
hypoxia reaction of cell
MODELOVÉ ZMĚNY SPOJENÉ S HYPOXIÍ/HIF SYSTÉMEM
Bi7005 Buněčné regulace / 11
–embryonální vývoj
–angiogenese
–růst chrupavek
–krvetvorba – aktivace EPO genu

‹#›
vegf_rec_ligands
VASCULAR ENDOTHELIAL GROWTH FACTORS (VEGF) A JEJICH RECEPTORY (VEGFR)
Bi7005 Buněčné regulace / 11

‹#›
VEGFR2
Image result for vegfr2 receptor structure
Obr. 5
Bi7005 Buněčné regulace / 11

‹#›
VEGF/VEGFR VE VÝVOJI
–reguluje vznik a vývoj cévní soustavy
–master regulátor angiogeneze (vývoje cév)
–hypoxie ( = nedostatek kyslíku) indukuje HIF (hypoxia-induced factor), který reguluje produkci
VEGF.
–VEGF je schopen regulovat vznik de novo cév v hypoxické části embrya
–podobný mechanismus se uplatňuje i při onkogenezi, kde VEGF podporuje prokrvení nádorů a tím
podporuje jejich růst
Bi7005 Buněčné regulace / 11

‹#›
SHRNUTÍ
–VEGF je signální protein (ligand) schopný indukovat genovou expresi
–Primárním cílem VEGF jsou vaskulární ECs
–VEGF přispívá k zachování stávajících cév a indukuje vznik a růst cév nových
–Významná role VEGF v embryonálním vývoji i v nádorové transformaci
Bi7005 Buněčné regulace / 11

‹#›
ANGIOGENEZE
–v embryogenezi
–iniciovaná:
–poranění tkáně
–menstruační cyklus
–hypoxická tkáň
–sprouting x intususceptive (spliting)
Bi7005 Buněčné regulace / 11

‹#›
ANATOMIE CÉVY
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
Image result for pericytes angiogenesis
Bi7005 Buněčné regulace / 11

‹#›
ZÁKLADNÍ FÁZE ANGIOGENEZE PO PORANĚNÍ
(SPROUTING ANGIOGENEZE)
1.Dilatace cév (eNOS)
2.Kontrakce endotelu
3.„Tip-cell“ selekce (Notch signalizace)
4.Ustavení „stalk cell“ a jejich proliferace
5.Vakuolizace (vytvoření lumenu)
6.Spojení „výhonků“ (anastomóza)
7.Pericytární stabilizace
Bi7005 Buněčné regulace / 11

‹#›
SPROUTING (KLÍČENÍ) CÉV
Image result for hif 1 vasculogenesis
Obr. 2
Bi7005 Buněčné regulace / 11

‹#›
Bi7005 Buněčné regulace / 11
Ilse Geudens, and Holger Gerhardt Development 2011;138:4569-4583
© 2011.

‹#›
SPROUT INDUCTION.
Bi7005 Buněčné regulace / 11
Ilse Geudens, and Holger Gerhardt Development 2011;138:4569-4583
© 2011.

Sprout induction. (A) The initiation of blood vessel formation. The presence of VEGF (blue
gradient) activates the endothelium (yellow cells) of existing blood vessels. A
VEGF/notch-dependent regulatory mechanism ensures the selection of a limited number of tip cells
(green) by blocking tip cell formation in the immediate neighbours (via lateral inhibition). Tip
cells sprout towards the VEGF gradient, and the adjacent stalk cells follow the guiding tip cell
and proliferate to support sprout elongation. (B) VEGF/notch regulatory feedback during tip cell
selection. The activation of VEGFR2 (pink) by VEGF (blue circles) induces the expression of the
notch ligand DLL4 (D; blue). The subsequent activation of notch (N; red) by DLL4 in contacting
cells reduces their expression of VEGFR2 and DLL4, thereby making them less sensitive to
VEGF-mediated activation and limiting their ability to activate notch signalling in neighbouring
cells. The expression of other tip cell-enriched genes, such as UNC5B and PDGFB is reduced in stalk
cells, whereas the expression of the non-signalling VEGF decoy receptors VEGFR1 and soluble (s)
VEGFR1 is increased, further reducing the likelihood of VEGFR2 activation in these cells.
Furthermore, jagged1 (J1; yellow), which is selectively expressed in stalk cells, competes with
DLL4 in cis for binding to notch receptors on tip cells. Jagged1 binds, but does not activate the
notch receptor, thereby preventing notch activation in the tip cells. (C) VEGF signalling during
sprouting. Soluble VEGFR1 (sVEGFR1; brown) produced by the cells immediately next to the outgrowing
vessel branch sequesters VEGF molecules, thereby creating a corridor of higher VEGF levels
perpendicular to the parent vessel. This corridor might act to optimise spreading of the vascular
network and to avoid contact with nearby emerging sprouts.

‹#›
notch Drosophila
Signální dráha NOTCH
–Notch = zářez – podle prvního fenotypu octomilky se zářezy na křídlech (T.H. Morgan, 1919)
Bi7005 Buněčné regulace / 11

‹#›
Transmembránové heterodimerické receptory Notch 1-4
Notch ligandy Jagged a Delta – jsou vázány na buněčný povrch
Bi7005 Buněčné regulace / 11
NOTCH

‹#›
Notch scheme
NOTCH DRÁHA - OVERVIEW
–Vazba ligandu Notch receptor aktivuje dvě proteázy (enzymy specificky štěpící protein)
–Proteázy jsou z rodiny ADAM a gamma-sekretáz
–Štěpení Notch těmito proteázami uvolňuje tzv. NICD (Notch intracellular domain), který se uvolňuje
a do cytoplazmy a následně přesouvá do jádra
–NICD přímo interaguje s transkripčními faktory CBF1/Mastermind a spouští transkripci
Bi7005 Buněčné regulace / 11

‹#›
NOTCH DRÁHA - BIOLOGIE
–Díky přímému působení má význam zejména při diferenciaci
–Typicky např. „Binary decisions“ a laterální inhibici
–Role v nikách kmenových buněk nebo při angiogenezi
Bi7005 Buněčné regulace / 11
Notch scheme

‹#›
LATERÁLNÍ INHIBICE PŮSOBENÍM NOTCH DRÁHY
Neurogenic selection through lateral inhibition. (A) The Notch signaling pathway mediates lateral
inhibition. The neurogenic receptor Notch is activated upon the binding to the Delta ligand that is
anchored on the membrane of a neighboring cell. This triggers the translocation of the Notch
intracellular domain (NICD) to the nucleus, which ultimately inhibits the proneural genes.
Proneural genes drive the expression of Delta and also enable neural differentiation. Hence, a cell
expressing the Delta ligand inhibits the production of the ligand in its neighboring cell. (B)
Mutual lateral inhibition between neighboring cells drives an intercellular positive feedback loop.
The positive feedback amplifies small differences between cells that are initially equivalent
(left) leading to two mutually exclusive fates (right). Normal and blunt arrows within and between
cells denote activation and inhibition respectively. The size of the arrows and the Delta/Notch
labeling indicates the importance of such elements. (C) The classical view of lateral inhibition
proposes that mutual inactivation between cells occurs in a tissue of equivalent precursors with
the same neurogenic potential (left), leading to an ordered salt-and-pepper pattern of two cell
fates. This feedback between equivalent neurogenic precursors enables the proper neurogenic
selection of cells (purple cells) maintaining a pool of neurogenic precursors (white cells) for
successive rounds of neurogenesis.
Bi7005 Buněčné regulace / 11

‹#›
Bi7005 Buněčné regulace / 11
Ilse Geudens, and Holger Gerhardt Development 2011;138:4569-4583
© 2011.
SPROUT INDUCTION.

Sprout induction. (A) The initiation of blood vessel formation. The presence of VEGF (blue
gradient) activates the endothelium (yellow cells) of existing blood vessels. A
VEGF/notch-dependent regulatory mechanism ensures the selection of a limited number of tip cells
(green) by blocking tip cell formation in the immediate neighbours (via lateral inhibition). Tip
cells sprout towards the VEGF gradient, and the adjacent stalk cells follow the guiding tip cell
and proliferate to support sprout elongation. (B) VEGF/notch regulatory feedback during tip cell
selection. The activation of VEGFR2 (pink) by VEGF (blue circles) induces the expression of the
notch ligand DLL4 (D; blue). The subsequent activation of notch (N; red) by DLL4 in contacting
cells reduces their expression of VEGFR2 and DLL4, thereby making them less sensitive to
VEGF-mediated activation and limiting their ability to activate notch signalling in neighbouring
cells. The expression of other tip cell-enriched genes, such as UNC5B and PDGFB is reduced in stalk
cells, whereas the expression of the non-signalling VEGF decoy receptors VEGFR1 and soluble (s)
VEGFR1 is increased, further reducing the likelihood of VEGFR2 activation in these cells.
Furthermore, jagged1 (J1; yellow), which is selectively expressed in stalk cells, competes with
DLL4 in cis for binding to notch receptors on tip cells. Jagged1 binds, but does not activate the
notch receptor, thereby preventing notch activation in the tip cells. (C) VEGF signalling during
sprouting. Soluble VEGFR1 (sVEGFR1; brown) produced by the cells immediately next to the outgrowing
vessel branch sequesters VEGF molecules, thereby creating a corridor of higher VEGF levels
perpendicular to the parent vessel. This corridor might act to optimise spreading of the vascular
network and to avoid contact with nearby emerging sprouts.

‹#›
VESSEL STABILISATION.
Bi7005 Buněčné regulace / 11
Ilse Geudens, and Holger Gerhardt Development 2011;138:4569-4583
© 2011.

Vessel stabilisation. Stalk cells (purple) recruit pericytes (orange) to stabilise the vasculature,
possibly through the production of stabilising factors such as TIMP3 and ANG1. ANG1 signalling
through the TIE2 receptor stabilises the vasculature, in part via inducing DLL4 expression in the
endothelial cells (ECs) and activating notch signalling. Notch activation then plays a dual role in
vascular stabilisation: first, it downregulates VEGFR2 expression, thereby preventing further
sprouting through activation of the VEGF/notch signalling pathway; second, it induces the
expression of NRARP, which promotes WNT signalling leading to increased proliferation and tight
junction (TJ) stabilisation.

‹#›
ANGIOPOETIN-TIE RTK SYSTÉM
Výsledek obrázku pro tie2
Bi7005 Buněčné regulace / 11

‹#›
CURRENT CONCEPTS OF ANASTOMOSIS.
Bi7005 Buněčné regulace / 11
Ilse Geudens, and Holger Gerhardt Development 2011;138:4569-4583
© 2011.

Current concepts of anastomosis. Schematic illustration of tip cell fusion. For simplicity, the
vascular lumen is not illustrated. The formation of new connections between growing vessels is
facilitated by vessel interactions with macrophages (blue) that can act as bridge cells that
promote filopodia contact between tip cells (green). Upon contact, adhesion junctions are formed by
VE-cadherin, first at the tips of filopodia and later also along the extending interface of the
contacting cells. The precise role of macrophages and the molecular regulation of anastomosis are
not understood. Possible candidate pathways involved are the notch, TIE2 and CXCR4 signalling
pathways; the notch receptors (red), the TIE2 receptor (green) and the CXCR4 receptor (yellow) are
expressed on macrophages and their cognate ligands are expressed on tip cells (not shown). A
two-way interaction between ECs and macrophages through (unknown) soluble factors (pink) has been
also described.