Genetika a taxonomie virů
Katedra parazitologie
Přírodovědecká fakulta JU
České Budějovice
MVDr. Jana Kvičerová, Ph.D.
2.-3.12. 2024
Zásady odběru vzorků
pro izolaci nukleových kyselin virů
Druhy vzorků (tkání):
• krev
• trus / stolice
• moč
• sliny
• stěry
• orgány (slezina, ledviny, játra, plíce, srdce, mozek)
V humánní medicíně:
- krev
- stolice
- stěry
U zvířat:
- krev
- trus
- orgány (postmortálně)
Zásady odběru vzorků
pro izolaci nukleových kyselin virů
Obecné zásady odběru vzorků pro izolaci NK virů:
- vzorky co nejčerstvější
in vivo – není problém
post mortem – co nejdříve
- včasné zpracování (krev na sérum – co nejdříve) či fixace/konzervace
- sterilní odběr (sterilní nástroje, sterilní zkumavky,
případně prostředí flowboxu)
- použití rukavic (vždy), případně respirátoru
- (biohazard boxy)
Zásady odběru vzorků
pro izolaci nukleových kyselin virů
Krevní sérum:
- odběr plné žilní krve, její vysrážení a centrifugace
- centrifugace 5-10 min při 1500 otáčkách/min
- odebrat sérum (tj. žlutavou tekutinu vyloučenou na povrch)
- umístění séra do sterilní mikrozkumavky a zamrazení
→ odstranění krevních elementů, fibrinogenu, a většiny koagulačních faktorů
Orgány a zásady jejich odběru
(Mus musculus)
Sterilně vyjmout: 1. slezina, 2. ledviny, 3. játra, 4. srdce, 5. plíce, 6. mozek
Média pro fixaci vzorků tkání pro virovou diagnostiku
• bez fixačního média (tzv. nasucho) – u čerstvých odběrů
výhody: finanční, časová úspora při odběru, bez nutnosti eliminace
média před izolací nukleových kyselin
nevýhody: nutnost okamžitého zamrazení
• RNAlater
výhody: bez nutnosti okamžitého zamrazení (např. při odběrech vzorků
v terénu v delší vzdálenosti od laboratoře)
nevýhody: finanční, časové, nutnost eliminace před izolací NK
• DNA/RNA Shield
výhody: bez nutnosti okamžitého zamrazení (např. při odběrech vzorků
v terénu v delší vzdálenosti od laboratoře),
lze uchovávat až 30 dní při pokojové teplotě (!)
nevýhody: finanční, časové, nutnost eliminace před izolací NK
RNAlater
DNA/RNA Shield
DNA/RNA Shield
Organismus, který chci fylogeneticky
charakterizovat (měl bych vědět proč)
Izolace DNA / RNA, PCR, sekvenování
Vyhledání homologických
sekvencí pro další taxony
(měl bych vědět, pro které)
Vytvoření alignmentu
Fylogenetická analýza zvolenou metodou
To hlavní a podstatné:
interpretace fylogenetických
vztahů
vlastní sekvence 1
vlastní sekvence 2
vlastní sekvence 3
1. nalezení
vhodných
sekvencí
(databáze)
a doplnění
matice
2. příprava
matice:
alignment
outgroup 1
outgroup 2
vlastní sekvence 1
vlastní sekvence 2
vlastní sekvence 3
ingroup sekvence A
ingroup sekvence B
ingroup sekvence C
ingroup sekvence D
fylogenetická analýza matice
prohledávání databáze
multiple alignment
identifikace příbuzenských
vztahů mezi sekvencemi
Fylogenetická analýza
Databáze GenBank
www.ncbi.nlm.nih.gov
Databáze GenBank – PubMed
→ vyhledávání publikací
www.ncbi.nlm.nih.gov
Databáze GenBank – PubMed
→ vyhledávání publikací
www.ncbi.nlm.nih.gov
Databáze GenBank – Submit (BankIt, Sequin, SRA…)
→ vkládání sekvencí (po přihlášení heslem a uživatelským jménem)
www.ncbi.nlm.nih.gov
→ vkládání sekvencí (po přihlášení heslem a uživatelským jménem)
Databáze GenBank – Submit (BankIt, Sequin, SRA…)
Databáze GenBank – Taxonomy
→ vyhledávání sekvencí podle názvu taxonu (viru)
www.ncbi.nlm.nih.gov
Databáze GenBank – Taxonomy
→ vyhledávání sekvencí podle názvu taxonu (viru)
www.ncbi.nlm.nih.gov
Databáze GenBank – Taxonomy
→ vyhledávání sekvencí podle názvu taxonu (viru)
www.ncbi.nlm.nih.gov
rod Orthohantavirus (Elliovirales: Hantaviridae)
- ssRNA
- negativní polarita
- segmentovaný genom
(S, M a L segment)
- M segment → reassortment
- zoonotický potenciál
Databáze GenBank – Taxonomy
→ vyhledávání sekvencí podle názvu taxonu (viru)
www.ncbi.nlm.nih.gov
Databáze GenBank – Taxonomy
→ vyhledávání sekvencí podle názvu taxonu (viru)
www.ncbi.nlm.nih.gov
Databáze GenBank – Taxonomy
→ vyhledávání sekvencí podle názvu taxonu (viru)
www.ncbi.nlm.nih.gov
Databáze GenBank – Taxonomy
→ získávání a stahování sekvencí (data mining)
www.ncbi.nlm.nih.gov
Databáze GenBank – Taxonomy
→ získávání a stahování sekvencí
www.ncbi.nlm.nih.gov
Co lze zjistit:
- druh viru
- sekvenovaný lokus
- Accession number
- (hostitel)
- (tkáň hostitele)
- (lokalita sběru)
- (datum sběru)
Databáze GenBank – Taxonomy
→ získávání a stahování sekvencí (data mining)
www.ncbi.nlm.nih.gov
Lze zjistit:
- nukleotidovou sekvenci
- aminokyselinovou sekvenci
Databáze GenBank – Taxonomy
→ stahování sekvencí (formát FASTA)
www.ncbi.nlm.nih.gov
Taxonomie virů
Jak zjistím, které taxony potřebuji v datasetu?
Jak zjistím druhy virů, které se nacházejí v dané čeledi / řádu?
→ ICTV (International Committee on Taxonomy of Viruses)
www.ictv.global
Taxonomie virů
Jak zjistím, které taxony potřebuji v datasetu?
Jak zjistím druhy virů, které se nacházejí v dané čeledi / řádu?
→ ICTV (International Committee on Taxonomy of Viruses)
www.ictv.global
Taxonomie virů
Jak zjistím, které taxony potřebuji v datasetu?
Jak zjistím druhy virů, které se nacházejí v dané čeledi / řádu?
→ ICTV (International Committee on Taxonomy of Viruses)
www.ictv.global
Databáze GenBank – Taxonomy
→ stahování sekvencí (formát FASTA)
www.ncbi.nlm.nih.gov
Dataset pro fylogenetické analýzy
reprezentativní výběr taxonů do datasetu, tentýž gen
čeleď čtverečků čeleď koleček
čeleď trojúhelníků čeleď kosočtverců
outgroup
Výběr outgroupu pro fylogenetické analýzy
Výběr outgroupu (tj. kořene) - požadavky na outgroup:
• sekvence stejného genu jako u taxonů v datasetu
• vzdálenější, ale příbuzný organismus
(outgroup musí být out-group)
(neměl by ale být příliš vzdálený)
1. Praktická úloha – tvorba datasetu
Postup:
1. Vyhledat sekvence TÉHOŽ GENU (tj. například L segment či jeho synonymum,
RNA dependent RNA polymerase) virů rodu Orthohantavirus
dataset musí být VŽDY složen ze sekvencí stejného genu
2. Vyhledané a vybrané sekvence ve formátu FASTA zkopírovat pod sebe
(Ctrl+C, Ctrl+V) do Poznámkového bloku
3. Pokud je v GenBanku k danému druhu viru více sekvencí téhož genu,
vybíráme:
- nejdelší sekvenci / sekvence
- sekvence pocházející z různých hostitelů
- sekvence pocházející z různých geografických oblastí
4. Vybrat vhodný outgroup a vložit ho do datasetu
www.ncbi.nlm.nih.gov
1. Praktická úloha – tvorba datasetu
Hantavirový genom:
L segment = RNA dependentní RNA polymeráza (RdRp)
GenBank: RdRp, RNA-dependent RNA polymerase,
segment L, L gene
M segment = glykoproteiny G1 a G2 (Gn a Gc)
GenBank: Gc protein, M polyprotein, glycoprotein gene,
glycoprotein precursor
S segment = nukleokapsidový protein N
GenBank: nucleocapsid protein, nucleoprotein S,
nucleoprotein gene
www.ncbi.nlm.nih.gov
www.ncbi.nlm.nih.gov
Tvorba datasetu pro fylogenetické analýzy
www.ncbi.nlm.nih.gov
Úprava datasetu pro fylogenetické analýzy
Alignment
→ seřazení sekvencí obsažených v datasetu
Alignment
→ různé programy, různé algoritmy
BioEdit
Clustal W
T-Coffee
MUSCLE
MegAlign – součást balíčku DNASTAR
MAFFT – online
SeaView – možnost konkatenace
konkatenovaný alignment = spojený alignment 2 a více různých genů
→ další možnosti alignování:
- využití „předalignovaných“ souborů z databází
- alignování zohledňující sekundární strukturu
Alignování za pomoci sekundární struktury
oat
A
UAAACUAU
C
A
C
U
G
CG
C
CUUA
A
U
AG
C
G
G
U
G
GCUU
G
G
G
G
G
A
U
UG
C
C
A
G
C
UA
G
U
G
C
A
A
A
C A
G
A
C
C
U
CU A
A
C
G
C
C
U
C
C
U
G
C
G
U
U
GC
C
C
U
A
U
GUA
U
G
U
A
UG
G
G
A
G
C
G
U
A
G
G
G
G
G
C
G
U
U
U
G
G
U
U
U
U
A
GCU
G
G
A
C
U
G
C
A
AU
G
G
C
UU
C
C
UU
C
C
AUUU
U
UGCU
U U
U
AUAGCA
U
GUGUUACCC
AG
UU UA ACG
UC
U
GGCUUAU GGUUUGGU G C A
G
C
C
G
C
UC
G
U
C
G
C
U
U
U
GC
U
C
GU
U
G
UGU
U
A
G
C
A
U
U
GUA
A
U
U
CCU
G
C
U
G
U
G
A
G
G
G
G
C
G
G
C
G
G
U
G
G
U
U
CCGCU
UGGCCGUGGCUUAGUGUGU
C
UGuG
U
G
U
A
AUGU
G
A
AGCACGCUGAG
UG
U
A
U
G
GA
C
C
A
UGU
A
AG
G
C
G
G
C
AGU
U
C
A
AUCAAACU
U
CA
U
AUAGGCCUGUUA
A
CA
A
GA
AA
GGGUGAC
C
AC
U
A
C
U
U
CAA
U
U
G
G
U
G
U
U
G
A
U
A
A
U
A
A
UG
A
U
GU
U
G
UGG
U
G
U
AG
U
G
U
U
A
U
U
A
U
C
G
G
C
G
C
C
A
A
UGCAUCCU
GA
C
C
U
o
I
II
III
IV
5
67
ENERGY = -168.2
IIIa
IIIb
x
Alignování za pomoci sekundární struktury
o
A
U
A
A
A
CUA U
C
A
C
U
G
U
G
C
A
U A A
U
A
A
G
C
A
G
U
G
GCUUG
G
G
G
G
A
C
UG
C
C
A
G
C
U
A
G
U
G
C
A
U
G
G
G
C
C
U
UC
C
G
C
U
G
G
C
U
A
U
U
A
C
IU
U
G
A G
U
U
G
U
C
U
C
G
U
G
U
GU
A
C
A
C
A
U
G
C
G
U
G
G
U
G G
U
GG
U
U
G
UG U
A
U
U
A
GUU
U
GU
G
A
AU
A
C
A
C
G
U
G
U
G
U
G
U
CC
A
C
G
A
G
U
U
G
A
U
G
A
UG
G
U
G
G
U
A
G
C
A
A
UG
G
C
G
G
U
UG
G
U
U
G
G
U
G
U
A
C
U
G
G
AC T
G
C
AA
U
G
G
C
U
U
C
C
C
U
U
U
A
A
U
G
U A G C
U
G
U U A
U
GG C G U G
UG
U U
A
C C C A U U U GG C G
U
U U
A G C U A
C G
U A U GG U
U
C GG U
G
U G U U G U G C
UG
U
GUCGU
TG
CUG
U
UGU
CUA
CC
G
GC
T T A
TCU
UGCC
CC
UG
G GCC
UCC
UC
UAC
A
A GUG
UG
C
UGA
A
A
UGUA
UA
U
G
U
A
GUA
G
UGU
GG
UGG
AGG
U
GAU
GGG
G
UG
UGGG
AU
UGGU
G
U
UA
U
UGG
GA
GA
UGAUG
GCA
GC
A
G
G
C
G
U
G
G
U
C
C
A
C
C
U
AA
C
C
G
U
GG
C
U
U A
G
U
GU
G
C
U
G
T
A
GT
T
A
C
U
G
U
AA
A
A
G
A
G
C
A
C
G
C
U
A
G
G
U
G
G
A
C
C
U
C
G
UU
G
UG
GCGCAACAACCG
U
AG
U
GCCGTG
U
TIU
U
UGGCUUGCCAAGUG
U
GGGA
UG
UACACC
U
CUU
GCUG
A
C
GACAU
U
AU
UGUC
A
U
UCAUUUUCCU
G
A
C
C
U
o1
2
3
4
5
6
ENERGY = -229.4
o
A
U
A
A
A
C
U
AU
C
A
C
U
G
CG
C
C
U
A AU
A
A
G
C
A
G
U
G
GCUUG
G
G
A
G
A
G
UG
C
C
AGC
U
A
A
C
AG UG
U
C
U
G
A
U
G
U
U
GUGU
G
U
GUGU
G
U
G
U
G
U
GG
U
UG
G
U
G
C
U
GC
U
GC
U
G
C
U
G
C
U
G
C
C
UC
U
G
G
C
G
G
U
A
G
U
U
G
U
GG
U
GG
U
U
UC
U
U
CC
U
GU
U
C
A
U
C
G
G
C
G
U
U
A
G
A
U
U
G
C
A
AU
G
G
C
U
U
C
U
C
U
UUAAU
G
U
A
GC C
UUG
A
U
AUGGC
G U A U G U
UA
G C C GU U A G U U G A C
G
U U
U GG C U U G U GG U U U U G U G U U G C C
A G
U
U
G
U
U
G
U
U
G
U
U
G
U
U
G
U
U
G
U
U
G
U
U
G
U
U
GU
C
U
G
U
C
C
U
CCU
U
A
A
UGU
G
A
G
U
U
G
U
C
U
U
G
U
G
G
U
G
G
C
C
U
A
C
U
A
C
U
U
G
CG A
A
C
C
A
G
UC
A
G
U
C
G
C
A
CU
U
G
UU U
U
G
A
A
U
G
U
AU U
G
U
G
UC
G
U
U
U
G
U
G
C
U
G
C
U
G
C
U
G
G
U
G
G
UG
G
U
G
G
U
G
G
A
C
U
A
C
U
G
A
G
A
C
G
A
C
G
A
G
G
A
CC
A
UG
A
G
G
U
GG
C
G
A
C
G
A
C
G
A
C
G
A
C
G
A
C
G
A
C
G
A
C
G
A
CGUCG
A
C
G
C
A
G
G
G
U
U
C
A
C
U
U
GAC
C
G
U
GG
C
U
U
A G U
G
U
G
U
G
UU
U
C
C
AU
G
UA
U
G
GU
A
CUGU
U
A
G
A
A
G
C
A
C
GC
U
A
A
G
U
G
A
A
C
C
G
U
GA
A
A
GGCGAUGCA
U
G
U G
U
G
UG
U
G
C
G
A
AUGCCAUGUGCCAGUCAA
U
CUA
UU
UG
C
GC
CU
GCGUGC
U
U
GCGUGUGUGUGU
G
UGCGCGCUCGCGU
G
C
G
A
G
G
CU
A
AC
G
U
C
U
C
GG
G
C
C
G
A
A
CU
A
C
A
A
CU
C
UCA
G
U
U
G
U
G
U
U
U
G
G
U
CUU
G
A
U
A
U
AC
U
A
U
C
AUUUUUUCC
U
G
A
C
C
U
o
1
2
3
4 5 67
8
9
10
11
12
ENERGY = -264.5
MAFFT
https://mafft.cbrc.jp/alignment/server/index.html
Alignment
→ ořezání (trimování) alignmentu na jednotnou délku (začátek i konec)
Alignment
→ ořezání (trimování) alignmentu na jednotnou délku (začátek i konec)
Alignment
→ vymazání tzv. gapů, které nejsou informativní
Alignment
Ořezávání alignmentu:
Geny nekódující protein – ořezáváme v nukleotidovém formátu
Geny kódující protein – ořezáváme v aminokyselinovém formátu
(aby nedošlo k porušení čtecího rámce)
Alignment
Alignment
Ukládání alignmentu:
- v různých formátech, v závislosti na účelu dalšího použití
FASTA (.fas) – možnost otevření jak v programu alignmentu,
tak v textové podobě (Poznámkový blok)
– možnost mazání či přidávání nových sekvencí
do již zalignovaného souboru (→ usnadnění práce)
PHYLIP (.phy) – pro maximum likelihood analýzy (PhyML, RAxML apod.)
NEXUS (.nex) – pro Bayesovskou analýzu (MrBayes)
a analýzy maximum parsimony (PAUP)
Úloha – tvorba a úprava alignmentu v programu BioEdit:
- načíst dataset, který mám uložený jako .txt, do programu BioEdit
- Accessory Application – ClustalW Multiple alignment
- Run ClustalW – OK
→ načte sekvence a porovnává každou s každým, řadí dle podobnosti
- převod do aminokyselin pomocí Ctrl+T, zpět do nukleotidů také Ctrl+T
- ořezat začátek a konec alignmentu na vhodnou délku
- zkontrolovat alignment, vymazat gapy
- uložit alignment ve formátech FASTA a PHYLIP (File – Save As)
2. Praktická úloha – alignment
Fylogenetické analýzy
Fylogenetická analýza = klasifikace organismů založená na evoluční historii
Účel:
- zjišťování příbuznosti a vztahů mezi organismy / taxony
- evoluční interpretace fylogenetických vztahů
- taxonomie
- koevoluce
→ pro pozorovaná data hledáme adekvátní vysvětlení
Výstup:
grafické zobrazení pomocí fylogenetického stromu (fylogramu)
fylogenetické vztahy
vnitrodruhové vztahy
(populační genetika)
mezidruhové vztahy
Fylogenetické analýzy
GAATCATCCC
GACCAAACCTA
GAATCATCCC
GACCAAACCTA
?
Fylogenetické analýzy
Fylogenetický strom
A
B
C
D
E
F
Z
A-F taxony
Z outgroup (kořen)
uzel
(node)
větev
(branch)
skupina (klastr) A
(group, cluster, clade)
skupina (klastr) B,
sesterská skupina ke skupině A
dvojcestné větve (dichotomie)
uspořádání větví = topologie
Zobrazení fylogenetických stromů
A
B
C
D
E
F
Z
ZAKOŘENĚNÝ,
S DÉLKOU VĚTVÍ
ZAKOŘENĚNÝ,
BEZ DÉLKY VĚTVÍ
NEZAKOŘENĚNÝ NEWICK FORMÁT
(A ((B C) ((D (E F))(G (H (I J))))))
Zobrazení fylogenetických stromů
n počet taxonů ve stromu
n-2 uzlů
2n-3 větví
Fylogenetický strom
zakořeněných stromů
je více než nezakořeněných
Fylogenetický strom
Zdroje fylogenetické informace
gen A gen B gen C gen A gen C gen B
genom genom
GAATCATCCGGACCAAACTTA GAATCATCCCGACCAAACCTA
amplikonová data z NGS
„multilokusové“ informace
(RFLP, RAPD, AFLP,
mikrosatelity)
pořadí genů
sekvence nukleotidů
Nativní vs. trvalé preparáty
Požadavky na fylogenetická data:
- informativnost (tj. přiměřená variabilita mezi taxony)
- nezávislost
- homologie
- dostatečné množství
Fylogenetická data
Nativní vs. trvalé preparáty
Informativnost (přiměřená variabilita mezi taxony):
Fylogenetická data
Nativní vs. trvalé preparátyFylogenetická analýza
Několik přístupů (algoritmů):
→ pro pozorovaná data hledáme adekvátní vysvětlení
• parsimonie → co nejúspornější uspořádání dat
MP (Maximum parsimony) – počet substitucí
• pravděpodobnostní přístup → co nejpravděpodobnější uspořádání dat
na základě daných předpokladů
ML (Maximum likelihood) – počet substitucí „na pozici“
BI (Bayesian inference)
je nutné „znát“ (stanovit) model, jak probíhá evoluce
→ výběr vhodného modelu molekulární evoluce
Evoluční modely:
→ korekce na opakované substituce
Organismus, který chci fylogeneticky
charakterizovat (měl bych vědět proč)
Izolace DNA / RNA, PCR, sekvenování
Vyhledání homologických
sekvencí pro další taxony
(měl bych vědět, pro které)
Vytvoření alignmentu
Fylogenetická analýza zvolenou metodou
To hlavní a podstatné:
interpretace fylogenetických
vztahů
Nativní vs. trvalé preparátyMaximální parsimonie (MP)
Maximální parsimonie (Maximum parsimony, MP)
- pracuje s délkou stromu a hledá nejkratší kladogram
(tj. co nejúspornější uspořádání dat)
Znaky (pozice alignmentu):
- neinformativní (konstantní)
- variabilní neinformativní
- variabilní informativní
→ délka stromu je množstvím
všech změn na všech pozicích alignmentu
→ sestavení všech stromů
L = li

k
i = 1
Délka stromu Počet pozic
Délka stromu pro danou pozici
Nativní vs. trvalé preparáty
1
2 3
1
2
3
1
2 3
1
2 3
4 4 4
3 taxony → 1 nezakořeněný strom
4 taxony → 3 nezakořeněné stromy
→ a pak to prudce roste...
počet možných kombinací roste jako faktoriál n
Maximální parsimonie (MP)
Například:
• Výchozí strom z libovolných 3 taxonů
• Sestavení tří možných stromů s přidáním 4. taxonu
• Z každého stromu vzniklého v předešlém kroku se postaví pět dalších stromů
přidáním 5. taxonu
• Pokračujeme až do přidání posledního taxonu
Nativní vs. trvalé preparáty
2,027,02510
135,1359
10,3958
9457
1056
155
34
13
No. trees
No.
taxa
Maximální parsimonie (MP)
Nativní vs. trvalé preparáty
Maximální parsimonie (Maximum parsimony, MP)
→ sestavení co nejkratšího stromu (výchozího)
→ jeho následné zlepšování pomocí přeskupování větví (branch swapping)
heuristické metody (různé algoritmy)
Výhody MP:
- jednoduchá, pochopitelná, rychlá
- minimální množství předpokladů o evoluci
- dobře prostudována matematicky
Problémy MP:
- předpoklad parsimonie je zcela jistě nesprávný pro sekvence s rychlou evolucí
Maximální parsimonie (MP)
Nativní vs. trvalé preparáty
- pojem pravděpodobnost nelze definovat, je značně subjektivní
R.A. Fischer (evoluční biolog) → likelihood pro biologická data
Thomas Bayes (matematik) → pravděpodobnost
pravděpodobnost (probability) = věrohodnost (likelihood)
Joseph Felsenstein – přišel na to, že Fischerův přístup by šel napasovat
na fylogenetiku (kniha „Inferring Phylogenies“)
máme data (tj. pozorovaný jev) → chceme ho adekvátně
vysvětlit (hypotéza)
→ pravděpodobnost mezi daty a fylogenezí
Pravděpodobnostní metody
pravděpodobnost vs. věrohodnost
(probability) (likelihood)
vysvětlení (hypotéza) pozorovaný jev (data)
• někdo skládal mince
aby to bylo hezké, a takhle
to dopadlo.
• roztrhl se pytlik s mincemi
a takhle to padlo náhodu
• spodní strana mince je těžsí
a pod stolem jsou magnety
probability(H|D)
že tato hypotéza způsobila tato
data
likelihood
probability(D|H)
že se objeví takováto data, pokud
nastane předpokládaná hypotéza
Pravděpodobnostní metody
Nativní vs. trvalé preparáty
Fylogenetika → hledáme hypotézu s maximální věrohodností
v likelihoodu jsou délky větví velmi důležité
Hypotéza = topologie vč. délky větví a modelu
→ vezmu data, prohledávám topologie, délky větví v každé topologii
na každé úrovni najdu nejvěrohodnější a z nich vyberu ten nejvěrohodnější
(na nejvyšší úrovni)
Model:
- evoluce na jednotlivých pozicích je nezávislá
- evoluce v jednotlivých liniích je nezávislá
Pravděpodobnostní metody
G A C T C A T C C...m
G C A T C A T T C
G C A T C A T G C
G C A T T A T T C
G G A T C A T T C
Nativní vs. trvalé preparátyEvoluční modely
Výběr vhodného evolučního modelu:
různé volně stažitelné nebo online běžící programy, např.
SMS: Smart Model Selection
www.atgc-montpellier.fr/sms/
T
A
G
C
frekvence nukleotidů
(base composition)
transition
probabilities
rychlost substitucí
na různých pozicích matice
(distribution of rates)
A -> G
A -> C
T -> C
.........
.....
AAAGGCTTATAA
Evoluční modely
SMS: Smart Model Selection
www.atgc-montpellier.fr/sms/
Nativní vs. trvalé preparáty
Maximální věrohodnost (Maximum likelihood, ML)
→ hledání hypotézy s maximální věrohodností
Maximální věrohodnost (ML)
A
TG
C
data
model topologie (včetně
délky větví)
matice
hypotéza
Nativní vs. trvalé preparáty
Maximální věrohodnost (Maximum likelihood, ML)
→ hledání hypotézy s maximální věrohodností
- evoluce na jednotlivých pozicích je nezávislá
- evoluce v jednotlivých liniích je nezávislá
Maximální věrohodnost (ML)
G A C T C A T C C...m
G C A T C A T T C
G C A T C A T G C
G C A T T A T T C
G G A T C A T T C
Výhody ML:
→ jednoznačně lepší, pravděpodobnější stromy než MP
Nevýhody ML:
- hledání ML stromu je „optimality criterion“ proces – stejný problém jako u MP
- nastavení parametrů analýzy, výběr vhodného modelu
- výpočetně náročná (hledání nejlepší kombinace modelu a stromu)
- časově náročná
Nativní vs. trvalé preparátyMaximální věrohodnost (ML)
→ různé programy
- volně stažitelné, online běžící, součást balíčků (např. Geneious)
PhyML – zdarma, běží poměrně rychle a efektivně
RAxML
→ načítá soubory ve formátu PHYLIP (.phy)
PhyML
Maximální věrohodnost (ML)
PhyML
Maximální věrohodnost (ML)
PhyML
Maximální věrohodnost (ML)
PhyML
Maximální věrohodnost (ML)
Bayesovská analýza (Bayesian Inference, BI)
→ načítá soubory ve formátu NEXUS (.nex)
Bayesovská analýza (BI)
Thomas Bayes
Bayesovská analýza (BI)
Mr. Bayes
Bayesovská analýza (BI)
Mr. Bayes
Bayesovská analýza (BI)
Mr. Bayes
Bayesovská analýza (BI)
Mr. Bayes
Vizualizace a úprava fylogenetických stromů
TreeView
- vizualizace stromu ve formátu .tre vytvořeného fylogenetickým programem
- možnost vizualizace různých typů stromů (s délkou větví, bez délky větví)
- možnost zobrazení statistických podpor uzlů
- možnost nastavení outgroupu / outgroupů a zakořenění stromu
- možnost uložení ve formátu .emf umožňujícím grafické úpravy v dalších
programech
- možnost tisku hrubého, graficky neupraveného stromu
Vizualizace a úprava fylogenetických stromů
Finální grafické úpravy fylogenetických stromů:
FigTree
Adobe Illustrator
- vizualizace hrubého, graficky neupraveného stromu,
ve formátech .emf, .ai nebo .pdf
- možnost textových úprav
(názvy taxonů, velikost a typ písma)
- možnost barevných úprav a vkládání obrázků
Odkazy
• https://www.ncbi.nlm.nih.gov
• https://ictv.global
• https://mafft.cbrc.jp/alignment/server/index.html
• https://phylipweb.github.io/phylip/software.html
• https://molbiol-tools.ca/Phylogeny.htm