Fyziologiebuň.systémů
Karel Souček
Krvetvorba, systém krevních buněk a
krvetvorné orgány; principy
diferenciace
Fyziologiebuň.systémů
Krev – složení a funkce
Suspenze buněk v roztoku obsahujícím proteiny a
elektrolyty (krevní plazma)
Slouží pro transport plynů, výživných a odpadních
látek, hormonů a dalších regulátorů
Množství krve u dospělého člověka je ~ 4,5 - 5 litrů
(6-8% celkové hmotnosti)
~ 40% objemu krve jsou buňky
Erytrocyty – transport plynů
Trombocyty – srážení krve
Leukocyty (granulocyty, monocyty, lymfocyty) – obranná
funkce
Omezené životnost krevních elementů (3-120 dní)
Krvetvorba zajištuje jejich obnovu, hlavní krvetvorný
orgán (s výjimkou lymfocytů) je kostní dřeň
Fyziologiebuň.systémů
Rychlost obnovy buněk
http://book.bionumbers.org/
Fyziologiebuň.systémů
Jaký podíl našeho těla tvoří krevní buňky?
http://book.bionumbers.org/
Fyziologiebuň.systémů
Jaký podíl našeho těla tvoří krevní buňky?
Fyziologiebuň.systémů
Hematopoéza
proces tvorby krevních buněk proliferací a
diferenciací jejich prekurzorů
Produkce dostatečného množství krevních
buněk vyžaduje
•proliferaci buněk mitotickým dělením
•diferenciaci buněk během jejich specializace
Plně diferencované buňky již většinou
nemohou proliferovat.
Fyziologiebuň.systémů
Hematopoetické orgány
Embryo: žloutkový vak, játra, slezina
Fetus: játra, slezina, kostní dřeň
Po narození:
kostní dřeň
většina krevních buněk (erytrocytů,
granulocytů, monocytů)
Trombocyty
lymfatické uzliny, thymus, slezina a další
orgány s výskytem lymfatických folikulů
lymfocyty
Cell 2008 132, 631-644DOI: (10.1016/j.cell.2008.01.025)
Myeloidní:
erytropoéza
monocytopoéza
granulopoéza
(eosinopoéza, basopoéza)
trombocytopoéza
Větve hematopoézy
Lymphoidní:
produkce T lymfocytů
produkce B lymfocytů
Fyziologiebuň.systémů
Buněčná plasticita
1957, Conrad Waddington
https://www.nature.com/articles/nrm3543/figures/1
Fyziologiebuň.systémů
Buněčná plasticita
https://www.mdpi.com/1422-0067/21/21/8274/htm
Fyziologiebuň.systémů Charakterizace hematopoetických kmenových a
progenitorových buněk - Colony Forming Cell (CFC) Assay
https://www.rndsystems.com/resources/protocols/human-colony-forming-cell-cfc-assay-using-methylcellulose-based-media
Fyziologiebuň.systémů Charakterizace hematopoetických kmenových a progenitorových
buněk – competitive repopulation assay, CRU
Fyziologiebuň.systémů
Immunodetekce
History:
1940 – Conns, imunofluorescenční značení kryořezů
1959 – Singer, vývoj metody konjugující protilátky se značkou
1966 - Graham&Karnovsky, metoda značení protilátek enzymy (HRP)
1974 – Taylor&Burns – rutinní imunohistochemie
1975 – Kohler&Milstein – produkce monoklonálních protilátek pomocí
hybridomů
Fyziologiebuň.systémů
Fyziologiebuň.systémů
Fyziologiebuň.systémů
Imunofenotypizace
stanovení zastoupení jednotlivých subpopulací krevních elementů
(primárně leukocytů) na základě exprese vybraných povrchových
antigenů, případně v kombinaci s intracelulární produkcí cytokinů a
expresí intracelulárních antigenů.
CD („Cluster of Differentiation“)
systém označení povrchových molekul leukocytů. Soubor povrchových
molekul (znaků, antigenů) buněk mající stejný epitop, který lze
identifikovat stejnou protilátkou.
Pojí se s určitými funkcemi a vlastnostmi buňky. Většina CD má proto
alternativní názvy vztahující se k jejich funkci nebo struktuře.
Využívají se pro rozpoznávání buněčných populací při
imunofenotypizaci.
Dodnes definovány CD1 až CD350. Některá CD jsou
skupinami příbuzných molekul – jednotlivé molekuly
se pak označují písmeny (např. CD62L, CD62P, CD62E)
Fyziologiebuň.systémů
CD molekuly
https://www.biolegend.com/cell_markers
http://www.hcdm.org/
Fyziologiebuň.systémů The hematopoietic hierarchy – novel approaches
Fyziologiebuň.systémů
Fyziologiebuň.systémů
Kostní dřeň
Kostní dřeň poskytuje strukturální podporu a udržuje odpovídající prostředí pro průběh
hematopoézy.
Stroma kostní dřeně je pórovitá fibrózní tkáň tvořená fibroblasty, retikulárními buňkami a
kostními buňkami, na kterou adherují vyvíjející se buňky, makrofágy a adipocity.
Stromální buňky, makrofágy a endoteliální buňky spolu s hematopoetickými buňkami
produkují růstové faktory regulující proliferaci a diferenciaci buněk.
Strukturní molekuly vážou tyto růstové faktory, a tak udržují jejich vysokou koncentraci v
kostní dřeni.
Rozlišujeme:
• červenou kostní dřeň – vlastní hematopoéza
• bílou kostní dřeň – tuková tkáň
Fyziologiebuň.systémů
Kostní dřeň a věk
Převažující aktivita:
• mládí – ploché a dlouhé kosti
• stáří – ploché kosti a konce dlouhých kostí
Mladí jedinci: kostní dřeň celá červená, hematopoéza probíhá ve všech částech
Dospělí jedinci: středová část kostí se postupně zaplňuje tukem a vytlačuje hematopoetické
buňky; hematopoéza v těchto částech probíhá pouze v případě zvýšené potřeby krevních buněk
Fyziologiebuň.systémů
Úbytek telomer, délka telomer a telomeráza.
https://doi.org/10.3389/fgene.2020.630186
Fyziologiebuň.systémů Dynamika telomer a telomerázy v lidských
kmenových buňkách.
British Journal of Cancer volume 96, pages1020–1024 (2007)
Fyziologiebuň.systémů
Hematopoetická kmenová buňka (HSC)
Má nejen schopnost sebeobnovy, ale dává vznik všem
krevním specializovaným buňkám
Dlouhodobé (LT-HSC): velké množství telomerázy
Krátkodobé (ST-HSC): nižší hladina telomerázy => životnost 2
týdny
sebeobnova
Hematopoetická
kmenová buňka
proliferace diferenciace
snižující se
proliferace
zvyšující se
diferenciace
Fyziologiebuň.systémů
Vývojová stádia buněk v kostní dřeni
Hematopoetická kmenová buňka
je základní sebeobnovující se buňkou se schopností diferencovat
do různých typů krevních buněk (multipotentní).
Progenitorová buňka
je již částečně diferencována a může dávat vznik
jen dané buněčné linii (CFU).
Téměř a zcela zralé krevní buňky.
Fyziologiebuň.systémů
Hematopoetická kmenová buňka (HSC)
Osteoblastická nika
Vaskulární nika
CXCL12 (stromal cellderived
factor 1, SDF1)
reguluje migraci HSCs
Stromální buňky
podporují hematopoézu
– např. produkcí c-Kit
ligandu
Další cytokiny –
interleukiny (IL),
trombopoetin (Tpo),
erytropoetin (Epo)
ovlivňují funkci
progenitorů
Cell 2008 132, 631-644DOI: (10.1016/j.cell.2008.01.025)
Fyziologiebuň.systémů
Hematopoetická kmenová buňka (HSC)
https://ebmtonline.forumservice.net/
Fyziologiebuň.systémů
Hematopoetická kmenová buňka (HSC)
https://ebmtonline.forumservice.net/
Fyziologiebuň.systémů
Cytokiny v hematopoéze
Fyziologiebuň.systémů
Cytokiny
Nízká MW (< 80 kDa), často bývají glykosylovány
(glykoproteiny)
účastní se imunity a zánětu, kde regulují intenzitu a délku
trvání odpovědi
jsou produkovány - lokálně, po přechodnou dobu
působí zejména autokrinně a parakrinně
jsou vysoce účinné (pM)
interagují vysoce specificky s povrchovými receptory
po vazbě na receptory indukují přenost signálu vedoucí k
transkripci cílových genů, výsledný efekt je závislý na
konkrétním kontextu
působí v síti, kde
svoje efekty vzájemně ovlivňují (zejm. svoji produkci)
indukují transmodulaci povrchových receptorů
mohou působit na buněčné funkce aditivně, synergicky anebo
antagonisticky
Cytokiny jsou multifunkční
+
G-CSF
++
GM
progenitor
cell
mature
granulocytes
GM
progenitor
cell
mature
macrophages
mature
granulocytes
mature
granulocyte
myeloblast
mature
granulocyte
phagocytosis
superoxide
G-CSFG-CSFG-CSF
GM-CSF
M-CSF
IL-6
multi-CSF
SCF
(a) (d)(c)(b)
(a) cell production is dependent on regulator stimulation
(b) induction of commitment to form cells in a restricted lineage
(c) initiation of maturation
(d) Stimulation of functional activity
Fyziologiebuň.systémů
Úloha IL – 1 v hematopoéze
T-cells
endothelial cells
fibroblasts
epithelial cells
IL-1
GM - CSF
ELAM - 1
ICAM - 1
IL - 2
IL - 6
G - CSF
1. monocyte production and activation
2. proliferation of committed
progenitor cells (BFU-E, CFU-GM)
1. neutrophil activation
2. neutrophil production
3. stem cell activation
1. T - cell growth
2. Ig secretion
adhesion of
leukocytes to
other cells
clonal
expansion of
differentiated
B - cells
Fyziologiebuň.systémů Úloha TGF-β v hematopoéze
Fyziologiebuň.systémů
Cytokiny působí v síti vzájemných interakcí
GM - CSF
T cell B cell
macrophage
Bone marrow
IL - 3
IL - 1
IFN - 
IL - 2
IL - 4
IL - 1
LPS
TNF
(-)TNF
G - CSF
Antibody
Cell 2008 132, 631-644DOI: (10.1016/j.cell.2008.01.025) LT-HSC, long-term hematopoietic stem cell; ST-HSC, short-term
hematopoietic stem cell; CMP, common myeloid progenitor; CLP,
common lymphoid progenitor; MEP, megakaryocyte/erythroid progenitor;
GMP, granulocyte/macrophage progenitor; RBCs, red blood cells.
Fyziologiebuň.systémů
Fyziologiebuň.systémů
Fyziologiebuň.systémů
Stárnutí hematopoetických kmenových buněk
Blood (2018) 131 (5): 479–487.
Haematopoiesis in adults less than 65
years of age was massively polyclonal,
with high clonal diversity and a stable
population of 20,000–200,000
HSC/MPPs contributing evenly to blood
production. By contrast, haematopoiesis
in individuals aged over 75 showed
profoundly decreased clonal diversity. In
each of the older subjects, 30–60% of
haematopoiesis was accounted for by
12–18 independent clones, each
contributing 1–34% of blood production.
https://www.nature.com/articles/s41586-022-04786-y
Fyziologiebuň.systémů
Erytrocyty
Buňky (bikonkávní disky, 7,5 µm) bez jádra a dalších
organel (u savců), malé kondenzované jádro a
organely u ptáků plazů, obojživelníků a ryb
Vnikají z jaderných prekurzorových buněk
Obsahují hemoglobin, 95% všech proteinů erytrocytu
Vývoj v kostní dřeni cca 8 dní
Doba života cca 120 dní
Staré erytrocyty likvidovány makrofágy v kostní dřeni,
v játrech a slezině
Fyziologiebuň.systémů
Membránová organizace erytrocytu
Plochá síť filament spektrinu propojena krátkými
filamenty aktinu je ukotvena pomocí adaptorových
proteinů k membráně
Jsou pasivně tvarovatelné, důležité pro prostupnost
kapilárami, stárnoucí buňky ztrácí flexibilitu
Fyziologiebuň.systémů
Vývojová stádia erytrocytů
http://www.mcl.tulane.edu/
kmenová
buňka
proerytroblast
(pronormoblast) basofilní erytroblast
polychromatofil
ní erytroblast
ortochromatofilní
erytroblast
(normoblast,
metaerytroblast)
ortochromatofilní
erytroblast
extrudující jádro
reticulocyt
(polychromatofilní
erytrocyt) zralý erytrocyt
Fyziologiebuň.systémů
Regulace erytropoézy
Obecné faktory
hypoxie –> erythropoietin (embryogeneze - játra, po
narození v peritubulárních buňkách kortexu ledvin)
růstové faktory, hormony (testosteron vs. estrogeny)
vitamíny
Maturační faktory
Vitamin B 12
Folic acid
Faktory nezbytné pro produkci hemoglobinu
Vitamin C – napomáhá absorbci železa (Fe+++ - Fe++)
Proteiny – aminokyseliny pro syntézu globinu
Železo a měď pro syntézu hemu
Vápník, kobalt, nikl
Fyziologiebuň.systémů
Regulace erytropoézy
Shilpa M. Hattangadi et al. Blood 2011;118:6258-6268
Fyziologiebuň.systémů
Erytropoéza a EpoR
Fyziologiebuň.systémů
Fyziologiebuň.systémů
Fyziologiebuň.systémů
https://sportsscientists.com/
2011/03/evidence-that-the-
biological-passport-is-
effective-summary-version/
Fyziologiebuň.systémů
Regulace erytropoézy
Hypoxie koordinuje syntézu EPO s metabolismem železa
Volker H. Haase Am J Physiol Renal Physiol 2010;299:F1-F13
©2010 by American Physiological Society
Fyziologiebuň.systémů
Trombocyty
Krevní destičky, 250 tis./ul
Klíčová role při srážení krve
Bejzaderné fragmenty megakaryocytů
postupné zvětšování buňky jako výsledek tzv. endomitóz (replikace chromosomů bez rozdělení
jádra)
vznik obrovské polyploidní buňky (až 64 sad chromosomů) – megakaryocytu (až 150 µm)
vznik cytoplazmatických granul
odštěpování fragmentů (trombocytů) z periferie (až 8 000 z jedné buňky)
stadia: megakaryoblast, promegakaryocyt, megakaryocyt
V cirkulaci cca 10 dní, likvidace makrofágy sleziny a jater
Tvar bikonvexního disku, 2,5µm
Tvar udržován mikrotubuly
Na membráně receptory pro
adhezi
Obnažený kolagen při poranění
cévy vyvolá adhezi - > aktivace,
vytvoření pseudopodií a uvolnění
granul
Fyziologiebuň.systémů
Trombocyty
Fyziologiebuň.systémů
Aktivace a adheze trombocytů
Henri H. Versteeg et al. Physiol Rev 2013;93:327-358
©2013 by American Physiological Society
Fyziologiebuň.systémů
Trombolýza
léčebný proces, který má za cíl rozpuštění krevní sraženiny vzniklé v
některé cévě (trombus), nebo zanesené do místa uzávěru krevním tokem
z jiného místa (embolus)
Aplikace látek která rozpouští krevní sraženiny, např. rekombinantních
aktivátorů plazminogenu
používá v akutních stavech, kdy je nutné sraženinu rozpustit rychle a
účinně - ischemická mozková mrtvice, tepenný uzávěr na dolní končetině
a klinicky se projevující masivní plicní embolie
Fyziologiebuň.systémů
Leukocyty
Slouží k obraně organismu v intersticiu, 5 tis./ul krve
Granulocyty, monocyty, lymfocyty
Cirkulaci opouštějí po krátké době (kromě lymfocytů) a zůstávají v
extravasálním prostoru
Fyziologiebuň.systémů
Distribuce imunitní buněčné hmoty v lidském těle.
https://www.pnas.
org/doi/10.1073/pn
as.2308511120
Fyziologiebuň.systémů
Granulopoéza
označení pro vývoj všech granulocytů (neutrofilních, eosinofilních a
basofilních) nebo někdy jen vývoj neutrofilních granulocytů.
Počáteční prekurzory neutrofilních granulocytů jsou společné s monocyty.
Na úrovni progenitorů GM-CFU se linie rozdělují.
Granulocyty po dokončení diferenciace zrají v kostní dřeni a potom jsou
uvolňovány do krevního řečiště. V případě zvýšené potřeby neutrofilů se
uvolňují do krevního řečiště nezralé neutrofily – tyčky.
Z krve migrují do různých tkání na základě stimulace chemotaktickými
faktory.
Fyziologiebuň.systémů
Monocytopoéza
obtížná identifikace stadií v běžném krevním nátěru
monoblast, promonocyt, monocyt (vývoj trvá přibližně
55 hod.)
změna tvaru jádra
vývoj azurofilních granul (GER, GA)
zralé vstupují do krve, cirkulují 8 - 16 hod., pak
vstupují do tkání a dozrávají v různé typy makrofágů,
které mají obvykle životnost několik měsíců
kmenová
buňka
myeloblast promonocyt monocyt
Fyziologiebuň.systémů
Lymfocytopoéza
progenitory všech lymfocytů vznikají v kostní dřeni
některé migrují do thymu, kde se diferencují v T-lymfocyty
ty, které zůstávají v kostní dřeni, se diferencují v Blymfocyty
a migrují do periferních lymfatických orgánů, kde
se dále mohou množit (lymfatické uzliny, slezina)
stadia: lymfoblast → 2-3 dělení → prolymfocyt (nemá ještě
povrchové antigeny) → dělení → lymfocyt
Fyziologiebuň.systémů
Lymfatické orgány
Primární
Kostní dřeň
Thymus (brzlík)
Sekundární
Mízní uzliny
Slezina
Slizniční lymfatická tkáň (MALT)
Tonsily (mandle)
Peyerovy pláty
…
Fyziologiebuň.systémů
Lymfatické uzliny
Řetězec filtračních jednotek v systému lymfatických cév
vkleslina = hilus, vstup artérií, nervů, výstup vén, lymfatických cév
na povrchu – pouzdro = capsula – husté kolagenní vazivo → trabekuly
podkladem - retikulární vazivo (retikulární buňky, retikulární vlákna, základní amorfní hmota)
Kůra, cortex, B-zóna
Parakortikální oblast, T-zóna
Dřeň, medulla
Kapilární prostory, lymfatický sinus, vystlány endoteliálními buňkami
V případě aktivace zůstávají lymfocyty v uzlině, proliferují a diferencují do efektorových buněk
Neaktivované cirkulují, 5 mil. buněk/min vstupuje z krve do sekundárních lymfoidních orgánů
Fyziologiebuň.systémů
Slezina
Filtrační a imunitní orgán v krevním oběhu
Funkce
Odstranění zestárlých a poškozených erytrocytů
Červená pulpa (vazivové retikulum protkané venózními sinusy)
Makrofágy pohlcují fagocytované erytrocyty – recyklace
Hemové železo navázáno na ferritin, transport pomocí transferinu do erytropoetických buněk
Z hemu vzniká bilirubin, v komplexu s albuminem transportován do jater, v konjugaci s kys.
glukuronovou vyloučen z jater ve žluči
Sekundární lymfoidní orgán
Bílá pulpa, systém lymfatických folikulů (B- lymfocyty, folikulární dendritické buňky)
Fyziologiebuň.systémů
Slizniční lymfatická tkáň
Patrová mandle
Povrch tvořen nerohovějícím epitelem, rozbrázděn do cca 20ti
krypt
Krypty obsahují epiteliální buňky, leukocyty, mikroorganismy
Pod kryptami – sekundární lymfatické folikuly – B-dependentní
oblast
Interfolikulární zóna – T-dependenntní oblast
Fyziologiebuň.systémů
Slizniční lymfatická tkáň
Lymfatická tkáň střevní sliznice (MALT, Mucosa-associated lymphoid tissue)
Shlukováním lymfatických folikulů v některých částech trávicí trubice vznikají
Peyerovy pláty
B dependentní oblast – folikul, T-dependentní zóna vyplňuje interfolikulární oblasti
Povrh epitelu nad folikulem (FAE) neobsahuje mucinózní vrstvu (nebo jen tenkou),
chybí klky a pohárkové buňky
M-buňky bez mikroklků, dochází na nich k endocytóze antigenů
Enterocyty transportují protilátky transcytózou
Protilátky IgA jsou tvořeny subepitelovými plasmatickými buňkami
IgA spolu se sekretem exokrinních žláz vážou antigeny a mikroorganizmy – shlukování a
opsonizace
IgA i v mateřském mléce – pasivní imunizace trávicího a dýchacího traktu kojence
Fyziologiebuň.systémů
Thymus, brzlík
Umístěn v mezihrudí, za sternem před perikardiem
Maxima rozvoje dosahuje v dětství (cca 20-30g)
S koncem puberty rychlá involuce, zůstavují jen rezidua v
tukovém vazivu
Primární lymfatický orgán systému T-buněk, tvořen retikulárním
epitelem (rozvětvené, navzájem spojené buňky, mezi kterými je
tkáňový mok)
V časném fetálním období je osídlen prekursory T-lymfocytární
linie – thymocyty
Vyzrávání imunokompetentních T-lymfocytů pod vlivem
diferenciačních faktorů a kontaktu s retikulárním epitelu thymu,
autotolerance
Fyziologiebuň.systémů
Thymus, brzlík
Retikulární epitelové buňky –
obsahuji CK vlákna, jsou
spojeny desmosomy,
Vrstva u kortexu – obaluje
thymocyty – ‚pečovatelské‘
buňky
vytváří trojrozměrnou síť
osídlenou thymocyty
Podílí se na pozitivní a
negativní selekci T-buněk
Hassalova tělíska – podoba
eosinofilních agregátů (jejich
počet a velikost roste s věkem)
Fyziologiebuň.systémů
Hemothymová bariéra
ochraňuje T lymfocyty
před antigeny cirkulujícími
v krvi
souvislá endotelová
výstelka kapilár
BL endotelu (perikapilární
prostor) - vazivo +
perivaskulární makrofágy
fagocytují malá množství
materiálu, který pronikne
cévní stěnou)
BL retikulárního epitelu
perivaskulární hraniční
membrána
HTB je vyvinuta v kůře,
chybí ve dřeni
Fyziologiebuň.systémů
Involuce thymu
Fyziologiebuň.systémů
Shrnutí
Krev představuje tkáň s vysokou mírou sebeobnovy,
krvetvorba je hierarchicky organizována,
je precizně řízena prostřednictvím mezibuněčných
interakcí a signalizací prostřednictvím solubilních
faktorů – cytokinů,
všechny zralé krevní buňky vznikají z hematopoetické
kmenové buňky jejíž funkce ovlivňuje prostředí v nice
kmenové buňky v kostní dřeni.
Fyziologiebuň.systémů
Literatura
Histologie, Renate Lullmann-Rauch, GRADA, 2012
Histology – A Text and Atlas, M. H. Ross. W. Pawlina,
Wolters Kluwer, 2011
GUIDE to GENERAL HISTOLOGY and
MICROSCOPIC ANATOMY, Petr Vaňhara, Miroslava
Sedláčková, Irena Lauschová, Svatopluk Čech, Aleš
Hampl, Published by Masaryk University, ISBN 978-
80-210-8453-7
Atlas fyziologie člověka, S. Stefan, D. Agamemnon,
Grada, 2016