Molekulární biologie prokaryot podzim 2024 RNA u prokaryot Adéla Finstrlová adela.finstrlova@mail.muni. cz i RNA (ribonucleic acid) • polymer ribonukleotidů spojených fosfodiesterovou vazbou • primárně jednořetězcová • thymin pouze v tRNA • alkalické prostředí rozkládá RNA na cyklické diestery nebo mononukleotidy • rozdíly oproti DNA MI Uracil 2 Druhy RNA mRNA • do 5% celkové RNA v buňkách • velmi heterogenní délka • průměrně pro bakteriální mRNA 1000-2000 nt • přenos informace pro syntézu proteinů • na 3'a 5'konci se nachází sekvence, které nejsou translatovány • 5'UTR -vedoucí sekvence • Shineova-Dalgarnova sekvence • T-boxy • riboswitche • thermosenzory • 3'UTR-trailor replication (ONA -> ONA) ONA Polymerase ^^P^b^PQ^d DNA transcription (ONA •> RNA) RNA Polymerase j>M4<|>M^^Li>i RNA translation (RNA -> Protein) Ribosome OOOOOOO Protein 4 mRNA charakteristika spojení transkripce a translace poločas rozkladu mRNA je velmi krátký, 2-5 minut 3'UTR podle typu terminace transkripce PfOMryote mRNA Sun Stopl (AUQ -^<1)(UAG. UAA. UGA)| iStart Stopi (Stan Swpi •••■2eh Prol*n3 / t má Eukaryoúc mRNA 5' m' Oppp cap V_ «ESC? -V- 5'UTR v 3' UTR 3poN(A)taí M . caaagcccgccgaaaggcgggcttttct IntnnsiC gtttcgggcggottccg g c t terminátor c a c tctgggcggtgagaattccac gaaaagacatagacccgccactcttaaggtg , uuuucugur gacgcaggccaaa. / fa B Stan stop lAUG -Moll (UAO UAA UGA) 1 ft a C Mfd _ Dh^ cacccacacccacacaccacacccacacccaa rinO gtgggtgtgggtgtgtggtgtg c g a — g g t agggacacggcggaattccat - - gtgggttgtctccogigcígf cttaaggta acccaacaQ cacccacacccacacaccacacccac cacccacacccacacaccacacccacacccaa gtgggtgtgggtgtgtggtgtg c g a c g t agggacacggcggaattccat gtgggttgtctccctgtgccgccttaaggta ACCCAACAfJ CACCCACACCCACACACCACACCCAC Struktura a translace polycistronického transkriptu B poly-cistromc transcript cistron-1 cistron-2 translational coupling • cistron - gen odpovídající jednomu polypeptidovému řetězci společně se start a stop kodonem • AUG (GUG), UAA, UAG, UGA • monocistronická mRNA • polycistronická mRNA-více proteinů, zpravidla v jedné metabolické dráze • oddělení cistronů mezerníkem (spacer) 6 rRNA • 80% buněčné RNA • hlavní složka ribozomů • poměr rRNA a proteinů je 2:1 • tvoří až % hmotnosti buňky • obsahuje 10% buněčných proteinů • sedimentační koeficient 70S • 2 asymetrické podjednotky • 30Sa50S 7 Podjednotky ribozomu 30S • pouze 16S rRNA • 21 proteinů (SI-S21) • Vazba mRNA, tRNA 50S • 5S rRNA a 23S rRNA • 31 proteinů (LI- L31) • Katalytická funkce Spectinomycin Tetracycline 1 Pactamycin Hygromycin B Streptomycin Paromomycin geneticin Tetracycline 2 Thiostrepton Avilamycin Streptogramin A, chloramphenicol, puromycin Pleuromutilins Streptogramin B, lincosamides Macrolides Ribozomy v prokaryotických buňkách patrná lokalizace mimo nukleoid (£. coli, Bacillus subtilis, Pseudomonas putida, Bdellovibrio) Rovnoměrné rozložení (Caulobacter crescentus, Spiroplasma melliferum, Mycoplasma pneumonia, Sinorhizobium meliloti) Charakteristika rRNA • 0,1 - 0,2% bakteriálního genomu zodpovídá za transkripci rRNA • konzervované oblasti s methylovanými rezidui • methylové skupiny se objevují ke 3'konci 16S a 23S rRNA • 3'konec rRNA v 30S podjednotce interaguje s mRNA a iniciuje transkripci • specifické oblasti v 16S rRNA interagují s antikodony tRNA v A a P místě • specifické oblasti v 23S rRNA interagují s CCA koncem peptidyl t-RNA Genes: 16S rRWARWA 235 rRNA 5S rRNA tRNA Promoters Termirators 30S pre-rRNA: Transcription "mít i tun1 1 Cleavage at f I Further trimming +> + -► +> -fr- ies rRNA tHNA 23S rRNA 5S rRNA tRNA 10 16S rRNA 23S a 5S rRNA Peptidyl transferázová aktivita v doméně V Nejčastější cíl AT B 12 16S Spacer Region 23S tRNA 5' 3' • 74-95 nt • vznikají sestřihem prekurzorové RNA • primární struktura • mnoho neobvyklých nukleotidů - asi 50 bazí je modifikováno • methylace • restrukturalizace purinů • sekundární struktura • trojlístek • 5 hlavních ramen (smyček) - Akceptorové, TpsiC, antikodonové, D, extra Diagrammatic representation of a phytoplasma tRNA operon Contains two or three D residues at different positions Py i>.i Wobble position Extra arm Variable in size, not present in all tRNAs Anticodon arm —13' Antitudon 13 a) Terciární struktura tRNA • další složení do L tvaru - H vazba mezi T a D ramenem □ ■Arm p«^A_tRNA 50S mRNA 30S 3 A C 5' • Discrlmlnator base(73) Ío-o o-o o-o o-o o-o l °:° -AOU O O0000°°0 T-Arnn b) O O O o o-o o-o o o Anticodon Anticodůn arm 14 Transferová-mesengerová RNA (tmRNA) • bifunkční molekula • vysvobození ribozomů z vazby na mRNA bez stop kodonu • naváže se na ribozom • krátký Polypeptid označující vzniklý protein k degradaci tmRNA Amino acid MLR tmRNA-SmpB / -> stalled ribosome on truncated mRNA tmRNA recruitment mRNA degradation RNase R released ribosomal subunits tagged protein degradation transpeptidation I release of ■^-1 truncated ■v \ mRNA tmRNA-tagged protein translation of the tmRNA ORF template switching Další druhy nekódujících RNA Eukaryotes Prokaryotes C/S-kÓdOVané _ ^„„niixr- Synthesis • asRNA • nbOSWltCh TT^twim export to cytoplasm • ŕrans-kódované Ä ^^^^ Presentationon • CRISPR AUSA protein scaffold • • Krátké (sRNA) Outcomes • Dlouhé (IncRNA) « 3' -ni w mi— Translation inhibition _ii m ii m t m- mRNA degradation Translation stimulation mRNA stabilization Malé nekódující RNA interagující s chaperonem Hfq Chaperon Hfq • Kružnicová kvartérní struktura • Sm/LSm rodina RNA vazebných proteinů • Stabilizuje sRNA před degradací RNázou E (a) Stress Fe++ limitation Fur derepression sRNA RyhB (b) Oxidative stress OxyR activation OxyS KwhtnckM Mfl IÉMÉ lypiumunum Target Fe++ bindin(J mRNAs proteins B Q Q Outcome Reduced Fe++ requirement RpoS FhIA Reduced oxidative damage (c) Low temperature Promoter activation DsrA (d) Glucose-P SgrR activation SgrS RpoS Increased protection from low temperatures Glucose transporter Reduced glucose entry and phosphorylation TRENDS in Genetics 17 Malé nekódující RNA interagující s chaperonem Hfq C J mRNA ■—i I— Repression by translational inhibition Mechanismus funkce • Inhibice translace • Degradace mRNA • Vazba do blízkosti SD-sekvence a AUG • Vazba na jiná místa v mRNA Mohou mít více vazebných cílů 3+ »RNA It* Al y—I 1—144—QS3- C Activation by an anti-antlsense mechanism mRNA \ ♦sRNA B Repression by mRNA destabilization ( ) ompD mRNA *—11—Ha ■ MicC 1—fiL C J ompD mRNA C e D Potential targeting regions of sRNAs 18 sRNA ryhB • Regulace příjmu železa • E. coli, homology u Pseudomonas aeruginosa a Erwinia Chrysanthemi 3 Iron-tkterophore complex ^ Fcllll) Sidcrophorc N - S ' ' * S — Ft Fe-S Cluster biosynthesis rrRNAs stable and translated AAAAA» tormRNA /VWV\ Mr mRNA A/WW EM mRNA AAAAA, soöß mRNA • AAAAA, *cKSUA mRNA Iron-sidcfophorc Slderophore tufABCDSE mRNA AAAAA, f* sufABCOSE Degradatton of mRNAs by RNasts / \ Apo-hcR AA /scR mRNA rur mRNA MrmRNA ftnAmRNA soöB mRNA /scSUA mRNA 19 sRNA oxyS t oxyR i SH HS HA i S -S A\ Target genes oxyS Temperature Osmolarity AAAM fhlA mRNA FhlA A\ Target genes A/WW rpoS mRNA RpoS A\ Target genes Cell surface stress • Role v ochraně proti oxidativnímu stresu u enterobakterií • OxyR - transkripční aktivátor • Oxidace na cysteinových zbytcích H202 • OxyS - brání translaci mRNA fhlA a rpoS • FhlA-transkripční aktivátor • RpoS - alternativní sigma faktor 20 sRNA dsrA • zvýšená exprese při nízkých teplotách • aktivuje rpoS m RNA rpoS mRNA leader J OFF rpoS translation ON A 21 p sRNA sgrS U" inhibuje příjem glukózy při glukózo-fosfátovém stresu • Reprimuje translaci je ptsG a mcmX RNA, • Transportéry pro glukózu a manózu aktivuje yigL tím, že bráni nukleolytické degradaci RNázou E • YigL fosfatáze defosforyluje karbohydráty, což umožňuje jejich export také kóduje malý peptid, SgrT • Působí synergicky s SgrS metabolism O O ,0 OOOO o o o o o virulence °'o y sugar import ý A ottoirflcätiori ^ t £> activation arm SgrS RNA SopO 22 u S. aureus Activation / expression of exotoxins • není závislá na Hfq • kóduje malý peptid - delta -hemolysin • efektorem Quorum sensing systému 23 78 RNA III u S. aureus Repression of ad lies ins RMAII coa mRNA RMAII H1 5 — -r \ K13 - i" r SD -o—r Ľ Al [■[■[ : ipa; mRNAa RNase III • není závislá na Hfq • kóduje malý peptid - delta -hemolysin • efektorem Quorum sensing systému 24 C/s-kód ova n é regulatorní elementy v mRNA • RNA thermosenzory • Většinou na 5'konci • Při nízké teplotě je SD sekvnece blokována vlásenkovou strukturou • ROSE element u heat shock genů Rhizobiaceae • FourU - u agsA heat shock genu salmonely 25 C/s-kód ova n é regulatorní elementy v mRNA Riboswitch elementy • atenuace transkripce nebo translace • reagují na koncentraci metabolitů - kofaktory, vitamíny, aminokyseliny, nukleotidy, cGMP, Mg2+ • zpětnovazebný mechanismus A Non-Nucleolytic Repression Mechanism (thiM and btuB riboswitches) ON state OFF state Ribosomes B Nucleolytic Repression Mechanism (tysC riboswitch) ON state OFF state Degradosome Degradosome 26 C/s-kód ova n é regulatorní elementy v mRNA T-boxy • tRNA řízené riboswitche • řídí expresi gnů pro tRNA aminoacylaci, transport a biosyntézu aminokyselin • párování mezi antikodonem a kodonu podobné sekvenci • většinou dojde ke stabilizaci antiterminátorové struktury a tím pádem k transkripci genů lokalizovaných za tímto elementem /\ Spec T-box B T-box:tRNA base pairing 3'~A A~ 5' C-G U-A C-G 5'- U U~ 3' 27 Cis-kód ováné regulatorní elementy v mRNA elementy v mRNA řízené vazbou proteinů • kontrolují syntézu rRNA anebo proteinů pro transport a utilizaci karbohydrátů A L19 (rplS) mRNA leader Presence of glucose Absence of glucose Glucose EMC PtsG EIIA Glucose-6-P (VHpr^)ED Active dimeric GlcT HPr©< c hpr M ptsGHI K~ ^Tjlnactive^Í3 GlcT ^) C| D I 'UUUUU-3' A D Antitermination A B Premature termination TSS P2 Beu 1iJhI*wAhI.17 . Bha EE EE-17- Oih EE See EE ffka j^ji EE.17 , Bel M*;VMMlUG■ 05■ 23 ■ AUCACiMflDCiI*CGCUG .CU. .AUAUAUUUGUCG. . ■ AGGCAaT^aVMi>;*GG ■ 04 . 08 .GUACC7TOg?GffaCUCUGUCACA. . . ,GAG, .... .UGUQUUAA^A^^AA. 17 . 09. uAccAAfT*fa»iiiK:Gcua. ga----caggggc......uc.cauEEEH35.gcc. 03. .AAACUAA____AAUG. UAuTElft.'*!',frMtJU . 0 5 . . . .AGGA. .... .QUA. UAATEfoBFffBUA.07. . . CUGGGAA____AGG.UAA??A:*toii»UA. 04 ■ 16. AAAAA_7T?TT? G,77Zc GCUG. C AUU 10 . TJUACGTTTgřGj^CUCUA. UAC. 16 . UUACGf^TC?g1ffC GCUG . CCU. 28 ■ AUACAÍelirTiutTIISCGCUG ■ AGGA. . . .AGAU. . J2j. 2 6 . AAACG7T*Tm;VW*-CGCUG ■ AG. E22E23 EEES3 EEEHE uccu. caaH37ju^9aa . 04. .acagagca.....cu. UAU7£Vi->;Tf['AA. 04 . 21 ■ UUAAC331 CJSCGCUG.AC.....CAGGUU-.....GU■ CACHET gigGQ. 04 ■ 28 . AUUACETTirVi'frCGCUG .UGG ■ CA. .GAAG. . .tlQACCA. UAAfrhMUWmO ■ 06 . 2 5 . UUAUG7TFTT TTTTECGCUG.GCAC____AAG......GaGUUGAU^E tT*WGU ■ 03 . 29 .UAACG5BB TTRCGCUG . AGA. CACAGAGGU - . UGCUCU. DJUVSEE WlAA ■ 03 . 39 ■ UUAU0EE3Mi»CGCUG.ACQ____CUGGUA.....CGUTJGAu7*AlIfrMaiflA■ 03 . 29 .UHACGffgB! 2J5CGCUA.AG. . . .ACAAGUA. . . . . .CU.UAA2S ffiAA. 03 . 26.ACAAC22 53aCGCUG.GCG____CAAGA......CGUUAAUrFT HBUG, 06. 24.AUAAC233 ESECGCUG.C......AACUG........GACAuSE *E7BGG.04. 12 . AAUUCTTTif AmL*CGCUU .UAA____. UAAA. .... . UUA. AAUSh*Al)AU»iPD . 04 . |.0S.2se 1-11 .EBB |.07 .2íe j. 09.22 j. 08.32 |.io.eee j.os.22 1.07.22 |.09.222 1*08.TOE i.09 .rra |.07 -s252 |.07 .22 |.12 .SI I-05.2ss |.07.22 |.09.232 I.0S.q2e |.07 -FTTP |*08.22 ■-10.FTTTČ! |.06.22 |.07.22 |.07.22 |.02.2íe B P2 P1 R Y - R R - U G - Y nucleotide identity nucleotide present N 97% N 90% N 75% • 97% • 90% O 75% O 50% stem loop always present |_| compensatory mutations { i compatible mutations G - C Watson-Crick base pair g • A other base interaction 5—C b. subaiis L19 mRNA leader A A A G U I A G G 28 C-stabilizace vlásenky ribozomálním proteinem L19 6S RNA RNA C niiiiiiiiiiiinniiiiniiiiniii 1?-W™- C inn ii tj*— NTPs llll Eiponentialphase low KS RNA IfvrU K j r i i ar,v ■ . ■ n i Stationary phase High 6S RNA leveh r# v5»"f yrw™ GS-pPNA released 11 in ii mi mi t ii ii miii lit ■ -^- ^ 6S RNA degraded i ................ 6S RNA dependent trantrription of pRNA 6S RNA dependent transcription of pRNA to RNA Cora RNW i 1 rT KNAP y pRNA 29 WWW**** antisense RNA objeveny původně u bakterií, ač jsou u eukaryot známější Funkce asRNA 6 Transcriptional interferenc 5.Transcription termination 2RNase protection RES ' v 6 5' 5' stable products 3' 4. Processing 1 .Inn ibrtion of nbosomc binding - / Ribosome binding site Anti-turrniriBtor t>ä(juancu RNase sensitive site Terminator hairpin as RNA rrnRNA 30 sRNA u Archeí neznáme mechanismus působení popsány pomocí RNomik a bioinformatiky bacterial sRNAs no translation RNA degradation eukaryotic miRNAs no translation RNA degradation archaeal sRNAs IncRNA • delší než 200 nt 32 ncRNA OLE Ornate, Large, Extremophilic, ~600 nt, Firmicutes součástí velkého operonu, který obsahuje geny zapojené do biosyntézy izoprenoidů, opravy DNA, metabolismu koenzymů nebo regulace transkripce Gen ole se nachází proti směru transkripce od genu oapA, který kóduje 21-kDa dlouhý transmembránový protein nazývaný OLE-asociovaný protein A (OapA) homodimery OapA se po rozeznání dvou krátkých palindromatických sekvencí mohou navázat na RNA OLE knockout genu ole, genu oapA a obou genů současně mělo za následek poruchy růstu (v chladu 20°C za přítomnosti etanolu nebo při mírně zvýšené koncentraci Mg2+) o Q, P7 uo'. O*, P8 O- y-r r-y v v i - IP9.3 7[ ) 0-23 1-f •-•P9.2 r-y v»-«„ r-y r-y • -• • -• • -• •:«P9.1 g.u '•VR .0«"aacu- C-g P9 gugccug-.u Rf???TvT? yyyy##yy• o yCV r.» P6 a»uo»ug a-u " P5 g-c y-gr y-r „. r-y P4 C_G c-g a -G0 A A U r-yy" r-y -r P6.1 r-y u-a P10-: TVÍ r r c • P3 u vRAc A P14a 0gu-a, gg-ca ÍYÍf í v 9 y g a u c y gacg u.u g P« ,gg Vysvětlivky Anotace párů bazí - kovariantní mutace - kompatibilní mutace - bez pozorovaných mutac Konektory nulová délka — variabilní délka vlásenka s variabilní w délkou Přítomnost nukleotidů • 97% • 90% • 75% O 50% Identita nukleotidů N 97% N 90% N 75% R: A/G Y: C/U P1 e*. 33 IncRNA GOLLD • Giant, Ornáte, Lake- and Lactobacillales-Derived, ~800 nt • u šesti bakteriálních kmenů Actinobacteria, Bacteroidetes, Firmicutes, Nitrospirae, Proteobacterio a Verrucomicrobia • predikovány u o streptokokových nebo mykobakteriálních fágů • sekvence na plazmidech pseudouzel ŕ oo fy A a' m i A GY R j, GNRA pseudouzel (_~ %1q u y g g g u-a i i I I ac.cc ?.g y « /CCG ' G G _ í _l_g-C ► YR»RAO»AU UYGGG A A U C C A G C C A G G < A-U rrS6 "•o* E-smyčka ■rrrggygu 25-225 nt i l » l ■ ■ ■ l * >YYYCURCA C „o* Y ###G R G R R l l l l l l I l • AAGCRAAAG«CUUYCCC' pseudouzel Anotace páru baxí Přítomnost Identita kovariantni mutace nukleotidů nukleotidu * kompatibilní mutace 9 • 75% N 97% " bez pozorované mutace • BOK 0 50% N 90% konektor (nulová délka) N 75% — úsek s variabilní délkou R - A -G. Y = C — U. • •••Y Y, R* C-G AG"Y. C Y U, „* gr y r r y a 6 nt l l l l l l ^—y u r y y r P y G. c j »raG^" pseudouzel IC-gl u-a Ir-y A U A 34 IncRNA ROOL • 581 nt, Rumen-Originating, Ornate, Large • komplexní struktura, málo konzervovaných nt • na profágách, blízko genů pro tRNA IncRNA HEARO • HNH Endonuclease-Associated RNA and ORF, ~350 nt • Firmicutes, Proteobacteria, Cyanobacteria, and Actinobacteria • selfish genetic element • není jasné, jestli funguje jako RNA nebo ssDNA ROOL pseudouzel u G A • G • i o A A y0-4 nt a a U A ^ 0-5 nt i i X 1 1 1 1 i i i i 86% A a g a c' G' G/ 82% aG- G E-smyčka ' U o R • r r g m i i i i i w Y • Y Y C AY K ........... ooooooo»»«» 82% Y r g a •-• V_K m" oco/ u-*» ni ^ T o-o •-• • YG / %' _ • -0 •-• a / ,«% 0-24 nt 4_i5nt*^* J*\K^* /konektor (nulová délka) \0-9 nt 0Y\^RR z' — oblast s variabilní délkou ^ ^ U C XQ y/ C srT|ycka s variabilní délkou * A #0©^/ n kmen s variabilní délkou cy% \ #a Y *RR / Identita Qll vlásenka s variabilní ä V . . m-m Yv' -•n nukleotidů _ modulární sub-struktura n£) modulární vlásenka ag Identita nukleotidů N 97% N 90% N 75% Přítomnost nukleotidů • 97% «75% • 90% 0 50% anotace párů bazí - kovariantni mutace - kompatibilní mutace bez pozorovaných mutací 35