Histologické techniky v rostlinné embryologii Fixace Zalévání Krájení řezů Barvení řezů Histologie • původ názvu = z řečtiny: • histos = tkáň • logos = slovo, nauka • je vědní disciplína, která se zabývá studiem mikroskopické stavby živočišných tkání a rostlinných pletiv • používá speciální techniky přípravy preparátů a mikroskop Obecný postup klasické histologické metody (parafínová metoda) • odběr materiálu • fixace vzorků • odstranění fixáže propíráním • dehydratace • prosycení rozpouštědlem parafínu • prosycení parafínem • zalití do parafínu • řezání a lepení parafínových řezů • odparafínování řezů • rehydratace řezů • barvení řezů, event. dehydratace • montáž (uzavírání) řezů Odběr materiálu • rychlý • pokud je nutná preparace – raději již ve fixáži • velikost vzorků přiměřená – pro rychlý průnik fixáže do celého objektu • volba segmentů podle plánovaného studia • označení objektů během jejich zpracování - cedulky z tvrdšího papíru popsané obyčejnou tužkou (na rozdíl od inkoustů per a fixů se nerozpouští), provázejí objekty během dalších kroků až k jejich zalití do média Fixace • rozkladné autolytické procesy začínají prakticky ihned po smrti buněk a nenávratně ničí jejich původní strukturu • překonávají se fixací • první znalosti o fixaci živočišných tkání (samozřejmě ne pro mikroskopii) pocházejí již z dob Hippokratových: používal sloučeniny rtuti, byly známy i fixační účinky alkoholu • rozvoj fixace v pol. 19. století hlavně s rozvojem kožedělného průmyslu (různé sloučeniny, např. kyselina octová, alkohol, kyselina chromová, kyselina pikrová) • žádná metoda však nebyla jednoznačně optimální Požadavky na fixaci • zachování buněk a pletiv ve stavu co nejbližšímu k živému stavu • optimální zachování struktury pletiva, buněk a organel beze změny tvaru a objemu - snížení strukturálních změn a změn chemického složení • zafixování (upevnění) buněčných složek a materiálu v dané pozici, tak aby zde zůstaly i během dalšího zpracování = strukturální proteiny a jiné sloučeniny se musí změnit na nerozpustné ve všech reagenciích, se kterými přijdou v průběhu celého procesu do styku • zachování struktury buňky při co nejmenších chemických změnách, tak aby byla zachována enzymatická aktivita pro detekci enzymů, integrita epitopů pro imunodetekce, ... • perfektní fixace = jen teoretická Fixace • fyzikální • vysoušení • vysoká teplota - koagulace bílkovin, tání tuků • chladová • „freeze drying“ • „freeze substitution“ • chemická • fixativa koagulující - etanol, metanol, aceton, kyselina pikrová = denaturace bílkovin změny sekundární a terciární struktury vyvolané koagulačními fixačními činidly ovlivňují funkci bílkoviny, snižují její rozpustnost, koagulace cytoplazmatických proteinů ničí strukturu organel (např. mitochondrie) • fixativa nekoagulující - nedochází ke koagulaci bílkovin, ale k jejich propojení chemickou vazbou - zachovávají se organely (pro EM) Jednotlivá fixační činidla Etanol (metanol, aceton) • odstraňují vodu z bílkovin - štěpí vodíkové můstky a poškozují terciální strukturu = denaturace bílkovin • rozpustné proteiny = koagulované poškození membrán • NK - nevysrážené, zůstávají rozpustné • neproniká rychle, způsobuje objemové zmenšování • v 96% ethanolu materiál křehne a tvrdne Kyselina octová • proniká rychle • koaguluje jaderný chromatin, ale plazmatické struktury poškozuje, mechanismus fixace je nejasný • pletiva zůstávají měkká - použití pro karyologická studia • někdy je nahrazována vyšším homologem = kyselinou propionovou, která nemá tak negativní účinky na cytoplazmu • 96% při 16,6°C „mrzne“ na hmotu podobnou ledu triviální název „ledová kyselina octová“ Kyselina pikrová = trinitrofenol • žluté jehlicovité krystaly - rozpustné ve vodě a alkoholu • v suchém stavu = třaskavina (uchovává se pod vodou) • koagulace proteinů je způsobena tvorbou solí - pikrátů • pikráty jsou rozpustné ve vodě - oplachování se musí provádět alkoholem a ne vodou! • dobře proniká do pletiv a zlepšuje jejich barvitelnost Formaldehyd • 1859 syntetizoval chemik Alexandr Butlerov • o 8 let později jej Hoffman potvrdil jeho definitivní chemickou strukturu • vzhledem ke složitosti syntézy jej histologové těžko užívali před těmito objevy • již koncem 19. století Luis Pasteur fixoval formaldehydem mozky lidí postižených vzteklinou • 1895 Ottův naučný slovník píše o užití formaldehydu v mikroskopii jako o nové metodě Formaldehyd • je plyn s bodem varu -21°C • používá se jako – vodný roztok plynu (37- 40%) formalín – pevný polymer - paraformaldehyd • během skladování se zhoršuje kvalita formalínu vlivem tzv. Canizariho reakce, kdy vzniká kyselina mravenčí = prudké snižování pH („Ca-formol“ nebo pufrování) • po primární vazbě na různé funkční skupiny se vytvářejí křížové vazby („kroslinky“) - dochází k zesíťování molekul proteinů = nekoagulační fixace Glutaraldehyd • bezbarvá kapalina štiplavého zápachu • je toxický a způsobuje vážné podráždění očí, nosu, krku a plic, bolesti hlavy, ospalost a závratě – pracovat v digestoři, dodržovat zásady práce s toxickými látkami! • používá se samostatně nebo ve směsi s formaldehydem • proniká do pletiv pomaleji • zesíťování bílkovin pletiva po fixáži GA je mnohem pevnější způsobuje větší tvrdost pletiv Karnovského fixáž = kombinace formaldehydu a glutaraldehydu v kakodylátovém pufru http://en.wikipedia.org/wiki/Karnovsky_fixative Kyselina chrómová • CrO3 • koaguluje hrubě proteiny a NK • dobře fixuje jádro, chromozomy fixuje výborně chemismus reakce není dobře známý • zlepšuje barvitelnost struktur • musí být dlouhodobě propírána po fixáži tekoucí vodou (24 - 48 hod.), aby se nevytvořil nerozpustný zelený hydroxid chromitý Oxid osmičelý • OsO4 • vysoce toxický, nutno dodržovat bezpečnostní pravidla • nejčastěji se používá při přípravě materiálu pro elektronovou mikroskopii - jako postfixace po aldehydových fixacích při zalévání do pryskyřice Fixační směsi FAA (FPA) formaldehyde-acetic (propionic) acid – aethylalcohol • 50% nebo 70% ethanol 90 ml • ledová kyselina octová 5 ml • 37 – 40% formaldehyd 5 ml • stálá • rychle proniká • vhodná pro studium anatomické stavby Carnoyova fixáž (6 : 3 : 1) ethanol – chloroform - octová 100% (96%) ethanol 60 ml chloroform 30 ml kyselina octová 10 ml proniká rychle - fixuje dobře chromatinové struktury použití v cytologických studiích – např. pro sledování jaderného dělení při vývoji pylu nebo zárodečného vaku Navašinova fixáž a CRAF • 1% CrO3 (kyselina chromová) 75 ml • ledová kyselina octová 5 ml • formaldehyd 37 – 40% 20 ml vhodná pro mladé orgány nutnost dlouhého vypírání v tekoucí vodě Sergej Gavrilovič Navašin (*14.12.1857 – †10.11.1930), ruský botanik. Působil jako profesor univerzity v Kyjevě, byl člen korespondent (od roku 1901), akademik Akademie věd v Rusku (od roku 1918) a Akademie věd v Ukrajině (od roku 1924). Zabýval se cytologií. V roce 1898 objevil princip dvojitého oplození vyšších rostlin. Chromové fixáže (Sass 1951) Podle: Lux et al. 2002 Navašin CRAF I II III IV V 1% kyselina chromová 75 20 20 30 40 50 1% kyselina octová 75 10 % kyselina octová 10 20 30 35 ledová kyselina octová 5 formaldehyd 37 - 40% 20 5 5 10 20 15 destilovaná voda 65 42 20 Volba fixáží podle orgánů Lux et al. 2002 Stonkové a kořenové apexy, pupeny bylin Navašin, CRAF I, II, III Listové pupeny dřevin FAA, FPA Mladé stonky a kořeny CRAF II, III Dřevnaté stonky a kořeny CRAF IV, V, FAA, FPA Mladé, jemné listy CRAF II, III Starší listy FAA, FPA Dužnaté listy sukulentů CRAF I Květní poupata FAA, FPA, CRAF III Tyčinky CARNOY, CRAF III, FAA Semeníky CARNOY, CRAF III Embrya CRAF III Mladé plody CRAF III, FAA, FPA Starší plody CRAF III, FAA, FPA Faktory ovlivňující fixaci • teplota - rychlost penetrace, rychlost chemických reakcí a to nejen reakce fixativa s komponenty buňky, ale i reakce spojené s metabolismem (autolyze, obranné reakce,.... ) • často se používá pro citlivé aplikace fixace při nízké teplotě 4°C • snížením teploty ale dojde i ke snížení rychlosti působení fixace • v některých případech může vést působení nízké teploty k nežádoucím cytologickým změnám (např. rozpad mikrotubulů) • pH ovlivňuje komponenty buňky (např. konformaci bílkovin, stabilitu membrán) • někteří autoři ukazují, že pH ovlivňuje spíše rychlost autolyze a destrukčních procesů než samotný průběh fixace (Johansen,1940) • ale např. rychlost reakce aldehydů s bílkovinami je citlivá k pH (nejefektivnější je obvykle při pH 7 - 7,4) (Pearse, 1980) • u silně kyselých fixáži dochází k výraznému "rozpouštění" některých struktur (např. vakuol) • optimální pH pro fixaci může být variabilní v rámci buněčných komponent (např. bílkoviny cytoplasmy x bílkoviny jádra) a proto se často používá hodnota blízko optima cytoplazmatických bílkovin, tj. okolo pH 6,8 Faktory ovlivňující fixaci • používané pufry - koncentrace pufru by neměla vyvolávat výrazné osmotické změny • pufr nesmí reagovat s fixačním činidlem (např. TRIS nebo EDTA obsahují aminoskupiny které reagují s aldehydy) • nejčastěji používané jsou: • fosfátový pufr (0,025 - 0,1M při pH6,8), • HEPES (0,05M, pH7), • PIPES • čas - doba fixace určuje množství vzniklých vazeb a efektivitu fixace (např.změny aktivity peroxidázy po různých dobách fixace formaldehydem) Faktory ovlivňující fixaci • rychlost pronikání fixace - spolu s rychlostí reakce vedoucí k fixaci určuje celkovou rychlost fixace objektu • závisí na teplotě, typu fixační látky (např. formaldehyd proniká výrazně rychleji než glutaraldehyd) • velikosti a povaze objektu (obtížně proniká impregnovanými vrstvami, kompaktním pletivem, naopak snadno parenchymatickým pletivem s bohatými intercelulárami • dostatečné množství fixáže - zabrání vyčerpání fixující látky a jejímu naředění přidáním objektu; větší objem znáze pufruje změny, obvykle udávané množství se podle autorů pohybuje mezi 20-100x objemu pletiva Faktory ovlivňující fixaci Vypírání fixáže • většina fixativ vyžaduje vyprání z objektu před dalším zpracováním • k vyprání se používá pufr, nebo roztok použitý během fixace (samozřejmě bez fixativa) Dehydratace • během dehydratace dochází často k nejvýraznějším objemovým změnám a deformaci objektů • postupné odvodňovací řady = postupným převáděním objektů sérií roztoků s rostoucí koncentrací organických rozpouštědel dojde k odstranění vody z objektu • odvodňovací řady: • etanolová • butanolová • acetonová Dehydratace etanolovou řadou stupeň % etanolu ve vodném roztoku I 30 II 50 III 70 IV 90 V 96 VI 100 VII 100 VIII 100 začátkem řady je stupeň s koncentrací vody odpovídající koncentraci vody v použité fixáži (např. po FAA s 50% etanolu začínáme od kroku II) doba pobytu objektů v jednotlivých krocích závisí na charakteru a velikosti objektů mladé malé objekty 1-2 hodiny kompaktnější a větší objekty až 24 hod. nutno použít intermédium = xylen Dehydratace butanolovou řadou stupeň % EtOH % ButOH % vody I 20 10 70 II 25 15 70 III 30 25 45 IV 30 40 30 V 25 55 20 VI 20 70 10 VII 15 85 0 VIII 0 100 0 butanol je, narozdíl od etanolu, rozpouštědlem parafínu po fixaci FAA s 50% etanolem začínáme dehydrataci od kroku III Zalévání do médií - historie • zalévacími médii v histologii byly různé materiály, např. mýdlo, celoidin, různé druhy pryskyřice a vosk • za autora techniky zalévání do parafínu je považován Edwin Klebs, vynikající patolog a metodologický průkopník, působící v Praze, Curychu a v Chicagu • 1869 popsal metodu, která spočívala v odvodnění tkáně alkoholem, následném vysušení a pak obalení ve vosku na způsob jakéhosi pláště, tkáň ale ještě nebyla voskem prosycena • postupně se metody stále zlepšovaly Theodor Albrecht Edwin Klebs (1834 –1913) Krájení řezů • vývoj krájecích přístrojů (J.E. Purkyněm nazvaných mikrotomy) nastal ve druhé polovině 19. stol. • prvním mikrotomem byla dobře nabroušená břitva - v jedné ruce se držel bloček, pro bezpečnost zanořený např. do korkové zátky, a v druhé ruce břitva • ruční mikrotomy se posléze zdokonalily v mikrotomy strojové, které snadno a rychle krájí kvalitní a celistvé řezy • mikrotomy podle konstrukce a účelu: – sáňkové – rotační Ruční mikrotom Meopta Praha Mikrotomy strojové sáňkový mikrotom Reichert rotační mikrotom Leitz zalévání do parafínu dehydratace převádění do parafínu zalévání do parafínu Braune et al. 1982 parafínový bloček chlazení Příprava bločku ke krájení dělení bloku parafínu trimování bločku parafínu přitavení bločku parafínu na dřevěný špalík izolovaný bloček parafínu Krájení parafínových řezů Braune et al. 1982 rozdělení na bločky krájení řezů lepení bločku na špalík lepení řezů Fixace vzorků 2011 • prašníky a pestíky z poupat lilie Lilium hybr. • délka poupat: 5, 6 a 9 cm • fixace FAA (s 50% EtOH) 88 hod. • oplach 50% EtOH 2 x 30 min • dehydratace butanolovou řadou • prosycení Paraplast Plus® • zalití Paraplast Plus® Skleněné a porcelánové kyvety s víčkem Hellendahl Coplin Schiefferdecker dóza s držákem skel na 6 skel Sada plastových kyvet na barvení skla v držáku se přenášejí z jedné lázně do druhé najednou Barva barva - vjem světla podle jeho kvality (l) purpurová 700 nm červená 650 nm oranžová 600 nm žlutá 550 nm zelená 500 nm modrá 450 nm fialová 400 nm průchodem světla přes barevné preparáty dochází k absorpci světla komplementární barvy rozklad bílého světla po průchodu hranolem Barvivo • ne všechny barevné sloučeniny mohou být barvivem • barvivo = barevná sloučenina, která může být navázána na substrát • barvivo histologické- barví různé složky pletiv, používá se na základě empirických znalostí, chemismus reakce často není známý • histochemické barvení - barvící proces je vysoce specifický, je známá jeho chemická podstata Teorie barevnosti 1. chromoforová: chromofor – má charakteristické uspořádání atomů, které je zodpovědné za za absopci světla v určité části spektra, auxochrom – část molekuly, která zodpovídá za vazbu na substrát a) kyselé radikály: -OH, -COOH, -SO3H anionická barviva b) bazické radikály: -NH2 kationická barviva 2. chinoidní struktury 3. teorie p – el. páru • přírodní karmín - červec nopálový orcein – lišejníky (Lecanora, Roccella) hematoxylin - dřevo kampešky (Haematoxylon campechianum) brasilin - dřevo druhů rodu Caesalpinia (Caesalpinia sappan, C. brasiliensis) indigo - Indigofera tinctoria, Isatis tinctoria juglon - listy, kořeny, kůra Juglandaceae • syntetická Dělení barviv podle původu Hematoxylin a hematein hematoxylin = sloučenina tmavě modrofialové barvy ze dřeva Haematoxylon campechianum Používá se s mořidly - nejčastěji Fe3+ nebo Al3+ Natural Black 1 nebo C.I. 75290 barví teprve jeho oxidovaná forma = hematein lze barvit regresivní i progresivní metodou – záleží na formě aplikace mořidla Podélný parafínový řez semenem sněženky Galanthus nivalis L. regresivní barvení Heidenheinovým železitým hematoxylinem optimální diferenciace = v jádech buněk embrya i endospermu jsou patrná tmavěji zbarvená jadérka, Fe 3+ jako mořidlo endosperm embryo osemení (testa) suspenzor Kryostat mikrotom pro přípravu řezů zmrazených objektů • barvení progresivní: barvíme do žádané intenzity zbarvení (Mayerův nebo Delafieldův hematoxylin) • barvení regresivní: preparát přebarvujeme a pak postupně odbarvujeme (diferencujeme), podle afinity struktur k barvivu se některé odbarví zcela, jiné zůstanou zbarvené (Heidenheinův železitý hematoxylin, safranin) Druhy a způsoby barvení podle výsledku a aplikace • barvení simultánní: směs barviv v jednom roztoku (složky nesmějí spolu reagovat) (Alexander) • barvení sukcedánní (sukcesivní): dvě barviva po sobě, doplňují se barevné tóny, každé barvivo barví jiné struktury (alcianová modř - pravá jaderná červeň, safranin - Fast Green, bazický fuchsin - pikroindigo karmín /Cajal - Brožkova metoda/) Druhy a způsoby barvení podle výsledku a aplikace • barvení substantivní: barvení samotným barvivem ve vodném nebo etanolovém roztoku • barvení adjektivní: použití mořidel (soli kovů = kamence, tanin) • barvení adjektivní přímé = směs barviva a mořidla (Ehrlichův, Mayerův, Delafieldův hematoxylin) • barvení adjektivní nepřímé = nejprve řezy moříme a pak barvíme a diferencujeme (Heideheinův železitý hematoxylin) Druhy a způsoby barvení podle výsledku a aplikace Postup při podvojném sukcesivním barvení: alcianová modř - jaderná červeň stálá (Kernechtrot, nuclear fast red) 1. odparafínování řezů (xylen) 2. převedení řezů do vody 3. vlastní barvení: a) 3% roztok kyseliny octové 10 min. b) barvení buněčných stěn - 1% alcianová modř v 1% kyselině octové 10 min. c) opláchnutí 3% kyselinou octovou d) praní v tekoucí vodě 10 min. e) barvení buněčných jader - 0,1% jaderná červeň stálá v 5% roztoku Al2(SO4)3, 5 - 15 min. 4. opláchnutí destilovanou vodou 5. odvodnění alkoholovou řadou 6. převod do xylenu 7. uzavření do Eukittu Infiltrace a zalití do média • homogenní prosycení celého objemu objektu zalévacím médiem – postupné a pomalé – laboratorní teplota – 40°C – teplota tání parafínu • podmínkou úspěšného zalití je úplné odstranění rozpouštědel Lepení řezů • 1890 – Mayer: glycerol – bílek + fenol (thymol) • chromová želatina („gelatin and chrome alum“) • poly-L-lysin • podložní skla SuperFrost Ultra Plus® - (pevný elektrostatický náboj) není nutno používat jiná adheziva • sušení řezů na teplé ploténce Montáž řezů • nabarvené řezy je ještě potřeba zakonzervovat pod podložním sklem říkáme „zamontovat“ • 1844 - J. E. Purkyně a jeho asistent A. Oschatz popsali svoji metodu montování tak, že nabarvený řez prostě potřeli lakem. Užívali tzv. kopálovou pryskyřici, získanou z tropických stromů, ale znali již i kanadský balzám • jejich preparáty z té doby jsou stále v dobrém stavu • kanadský balzám se užívá dodnes, ale používají se i syntetické pryskyřice (Eukitt®) http://ziva.avcr.cz/jan-evangelista-purkyne.html Odkazy na zajímavé stránky http://www.bristol.ac.uk/vetpath/cpl/histmeth.htm protokoly imunohistochemie http://www.ihcworld.com/antibody_staining.htm protokoly barvení pro pletiva zalitá v pryskyřici http://www.ebsciences.com/staining/orcein.htm encyklopedie http://en.wikipedia.org/wiki/Staining O'Brien et al. (1964) Polychromatic Staining of Plant Cell Walls by Toluidine Blue O Parker et al. (1984) Toluidine Blue: A Simple, Effective Stain for Plant Tissues https://mmegias.webs.uvigo.es/02-english/6-tecnicas/protocolos/p-tincion-toluidina.php https://mmegias.webs.uvigo.es/02-english/6-tecnicas/1-introduccion.php https://conductscience.com/safranin-staining/ https://www.plantintroduction.org/index.php/pi/article/view/1587 (safranin a astra blue) https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4186213/ (srovnání metod detekce ligninu) Liljegren S. Phloroglucinol Stain for Lignin. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (lignin) https://www.ableweb.org/biologylabs/wp-content/uploads/volumes/vol-19/9-yeung.pdf (A beginner´s guide...)