Histologické techniky II. Barvení Botanická mikrotechnika 2024 Mgr. Hana Cempírková, Ph.D. Postup při podvojném sukcesivním barvení: alcianová modř - jaderná červeň stálá (Kernechtrot, nuclear fast red) •1. odparafínování řezů (xylen) •2. převedení řezů do vody •3. vlastní barvení: • a) 3% roztok kyseliny octové 10 min. • b) barvení buněčných stěn - 1% alcianová modř v 1% kyselině octové 10 min. • c) opláchnutí 3% kyselinou octovou • d) praní v tekoucí vodě 10 min. • e) barvení buněčných jader - 0,1% jaderná červeň stálá v 5% roztoku Al2(SO4)3, 5 - 15 min. •4. opláchnutí destilovanou vodou •5. odvodnění alkoholovou řadou •6. převod do xylenu •7. uzavření do syntetické pryskyřice Eukitt® • Po převodu preparátů do vody je možno započít samotné barvení v barvivech zvolených podle předem stanovených požadavků. Po obarvení jsou řezy uzavírány do kanadského balzámu nebo média pro uzavírání (montování) vzorků (např. Eukitt), který je schopen preparáty zachovat desítky let. Kanadský balzám i ostatní média nejsou mísitelná s vodou, ale s xylenem, proto je nutné obarvené řezy před zamontováním převést vzestupnou alkoholovou řadou zpět do xylenu. Skleněné a porcelánové kyvety s víčkem Coplin kyveta_porcelan Schiefferdecker Doza Hellendahl Coplin Schiefferdecker Dóza s držákem skel na 6 skel Sada plastových kyvet na barvení manualstaining Barvivo •ne všechny barevné sloučeniny mohou být barvivem •barvivo = barevná sloučenina, která může být navázána na substrát •barvivo histologické - barví různé složky pletiv, používá se na základě empirických znalostí, chemismus reakce často není známý •histochemické barvení - barvící proces je vysoce specifický, je známá jeho chemická podstata Typy barviv Chromoforová teorie barevnosti: chromofor – má charakteristické uspořádání atomů, které je zodpovědné za za absopci světla v určité části spektra, auxochrom – část molekuly, která zodpovídá za vazbu na substrát a)kyselé radikály: -OH, -COOH, -SO3H anionická barviva b)bazické radikály: -NH2 kationická barviva 1. Kyselá barviva (acidická, eosinofilní) Zásaditá barviva (bazická) Kyselé komponenty v buňkách a tkáních se barví basickými barvivy, proto se označují jako basofilní. Je to např. jádro, jadérko, granulární endoplazmatické retikulum, Zásadité složky buněk a tkání se barví kyselými barvivy, proto jsou acidofilní nebo eosinofilní (poněvadž eosin je nejčastěji používané kyselé barvivo), např. cytoplazma. Jestliže některé složky mají afinitu k oběma druhům barviv, označují se jako polychromatofilní, heterofilní nebo amfofilní. •přírodní •karmín - červec nopálový •orcein - lišejníky (Lecanora, Roccella) •hematoxylin - dřevo kampešky (Haematoxylon campechianum) •brasilin - dřevo druhů rodu Caesalpinia (Caesalpinia sappan, C. brasiliensis) •indigo - Indigofera tinctoria, Isatis tinctoria •juglon - listy, kořeny, kůra Juglandaceae • •syntetická • • Dělení barviv podle původu •Barvení progresivní: barvíme do žádané intenzity zbarvení •Barvení regresivní: preparát přebarvujeme a pak postupně odbarvujeme (diferencujeme), podle afinity struktur k barvivu se některé odbarví zcela, jiné zůstanou zbarvené (Heidenheinův železitý hematoxylin, safranin) • Druhy a způsoby barvení podle výsledku a aplikace •barvení simultánní: směs barviv v jednom roztoku (složky nesmějí spolu reagovat) (Alexanderova směs) •barvení sukcedánní (sukcesivní): dvě barviva po sobě, doplňují se barevné tóny, každé barvivo barví jiné struktury (alcianová modř - pravá jaderná červeň, safranin - Fast Green, bazický fuchsin - pikroindigo karmín /Cajal - Brožkova metoda/) • Druhy a způsoby barvení podle výsledku a aplikace •barvení substantivní: barvení samotným barvivem ve vodném nebo etanolovém roztoku •barvení adjektivní: použití mořidel (soli kovů = kamence, tanin) Druhy a způsoby barvení podle výsledku a aplikace barvení adjektivní přímé = směs barviva a mořidla (Ehrlichův, Mayerův, Delafieldův hematoxylin), barvení adjektivní nepřímé = nejprve řezy moříme a pak barvíme (Heideheinův železitý hematoxylin) Hematoxylin a hematein Haematoxylin Haematein hematoxylin = sloučenina tmavě modrofialové barvy ze dřeva Haematoxylon campechianum používá se s mořidly - nejčastěji Fe3+ nebo Al3+ Natural Black 1 nebo C.I. 75290 barví teprve jeho oxidovaná forma = hematein lze barvit regresivní i progresivní metodou – záleží na formě aplikace mořidla (https://colour-index.com/about) Haematoxylin, hematoxylin, Natural Black 1, or C.I. 75290 is extracted from the wood of the logwood tree. When oxidised it forms haematein, a compound with rich blue-purple colour, and is used, together with a suitable mordant (most commonly Fe(III) or Al(III) salts), to stain cell nuclei prior to examination under a microscope. Structures that stain with haematoxylin are called basophilic. Podélný parafínový řez semenem sněženky Galanthus nivalis L. regresivní barvení Heidenheinovým železitým hematoxylinem optimální diferenciace = v jádech buněk embrya i endospermu jsou patrná tmavěji zbarvená jadérka, Fe3+ jako mořidlo Image16 endosperm embryo osemení (testa) suspenzor Parafínový řez poupětem máku, Papaver somniferum Delafieldův hematoxilin, progresivní barvení, Al3+jako mořidlo kanadský balzám Indigo Indigo Indigofera tinctoria Isatis tinctoria dnes již vyráběné synteticky pro vlastní barvení řezů se nepoužívá, ale v histochemii jsou často používány tzv. indigogenní metody alternativní popis obrázku chybí Boryt barvířský Indigovník pravý Indigo dye is an important dyestuff with a distinctive blue color (see indigo). The natural dye comes from several species of plant, but nearly all indigo produced today is synthetic. Among other uses, it is used in the production of denim cloth for blue jeans. A variety of plants, including woad, have provided indigo throughout history, but most natural indigo is obtained from those in the genus Indigofera, which are native to the tropics. In temperate climates indigo can also be obtained from woad (Isatis tinctoria) and dyer's knotweed (Polygonum tinctorum), although the Indigofera species yield more dye. The primary commercial indigo species in Asia was true indigo (Indigofera tinctoria, also known as Indigofera sumatrana). In Central and South America the two species Indigofera suffructicosa and Indigofera arrecta (Natal indigo) were the most important. Natural indigo was the only source of the dye until about 1900. Within a short time, however, synthetic indigo had almost completely superseded natural indigo, and today nearly all indigo produced is synthetic. Indigo is among the oldest dyes to be used for textile dyeing and printing. Many Asian countries, such as India, China, and Japan, have used indigo as a dye for centuries. The dye was also known to ancient civilizations in Mesopotamia, Egypt, Greece, Rome, Britain, Peru, and Africa. India is believed to be the oldest center of indigo dyeing in the Old World. It was a primary supplier of indigo to Europe as early as the Greco-Roman era. The association of India with indigo is reflected in the Greek word for the dye, which was indikon. The Romans used the term indicum, which passed into Italian dialect and eventually into English as the word indigo. In Mesopotamia, a Neo-Babylonian cuneiform tablet of the 7th century BCE gives a recipe for the dyeing of wool, where lapis-coloured wool (uqnatu) is produced by repeated immersion and airing of the cloth. Indigo was most probably imported from India. The Romans used indigo as a pigment for painting and for medicinal and cosmetic purposes. It was a luxury item imported to the Mediterranean from India by Arab merchants. Indigo remained a rare commodity in Europe throughout the Middle Ages; woad, a dye derived from a related plant species, was used instead. In the late fifteenth century, the Portuguese explorer Vasco da Gama discovered a sea route to India. This led to the establishment of direct trade with India, the Spice Islands, China, and Japan. Importers could now avoid the heavy duties imposed by Persian, Levantine, and Greek middlemen and the lengthy and dangerous land routes which had previously been used. Consequently, the importation and use of indigo in Europe rose significantly. Much European indigo from Asia arrived through ports in Portugal, the Netherlands, and England. Spain imported the dye from its colonies in South America. Many indigo plantations were established by European powers in tropical climates; it was a major crop in Jamaica and South Carolina. Indigo plantations also thrived in the Virgin Islands. However, France and Germany outlawed imported indigo in the 1500s to protect the local woad dye industry. Indigo was the foundation of centuries-old textile traditions throughout West Africa. The use of indigo here pre-dated synthetics. From the Tuareg nomads of the Sahara to Cameroon, clothes dyed with indigo signified wealth. Women dyed the cloth in most areas, with the Yoruba of Nigeria and the Manding of Mali particularly well known for their expertise. Among the Hausa male dyers working at communal dye pits were the basis of the wealth of the ancient city of Kano, and can still be seen plying their trade today at the same pits. In Japan, indigo became especially important in the Edo period when it was forbidden to use silk, so the Japanese began to import and plant cotton. It was difficult to dye the cotton fiber except with indigo. Many years later the use of indigo is very much appreciated as a color for the summer Kimono Yukata, as the blue sea and the nature are recalled on this traditional clothing. In 1865 the German chemist Johann Friedrich Wilhelm Adolf von Baeyer began working with indigo. His work culminated in the first synthesis of indigo in 1880 and the announcement of its chemical structure three years later. BASF developed a commercially feasible manufacturing process that was in use by 1897, and by 1913 natural indigo had been almost entirely replaced by synthetic indigo. In 2002, 17,000 tons of synthetic indigo were produced worldwide. In the nineteenth century, the British obtained much indigo from India. With the coming of the synthetic substitute, these farmers lost their livelihood. [edit] Developments in dyeing technology Indigo is a challenging dye to use because it is not soluble in water; to be dissolved, it must undergo a chemical change. When a submerged fabric is removed from the dyebath, the indigo quickly combines with oxygen in the air and reverts to its insoluble form. When it first became widely available in Europe in the sixteenth century, European dyers and printers struggled with indigo because of this distinctive property. It was also a toxic substance that, by requiring many chemical processes, had many opportunities to injure many workers. A preindustrial process for dyeing with indigo, used in Europe, was to dissolve the indigo in stale urine. Urine reduces the water-insoluble indigo to a soluble substance known as indigo white or leucoindigo, which produces a yellow-green solution. Fabric dyed in the solution turns blue after the indigo white oxidizes and returns to indigo. Synthetic urea to replace urine became available in the 1800s. Another preindustrial method, used in Japan, was to dissolve the indigo in a heated vat in which a culture of thermophilic, anaerobic bacteria was maintained. Some species of such bacteria generate hydrogen as a metabolic product, which can convert insoluble indigo into soluble indigo white. Cloth dyed in such a vat was decorated with the techniques of shibori (tie-dye), kasuri, katazome, and tsutsugaki. Examples of clothing and banners dyed with these techniques can be seen in the works of Hokusai and other artists. Two different methods for the direct application of indigo were developed in England in the eighteenth century and remained in use well into the nineteenth century. The first method, known as pencil blue because it was most often applied by pencil or brush, could be used to achieve dark hues. Arsenic trisulfide and a thickener were added to the indigo vat. The arsenic compound delayed the oxidation of the indigo long enough to paint the dye onto fabrics. The second method was known as china blue due to its resemblance to Chinese blue-and-white porcelain. Instead of using an indigo solution directly, the process involved printing the insoluble form of indigo onto the fabric. The indigo was then oxidized in a sequence of baths of Iron(II) sulfate. The china blue process could make sharp designs, but it could not produce the dark hues possible with the pencil blue method. Around 1880 the glucose process was developed. It finally enabled the direct printing of indigo onto fabric and could produce inexpensive dark indigo prints unattainable with the china blue method. Kryostatový řez listem tabáku tloušťka řezu 30mm Indigogenní metoda detekce aktivity b-glukosidasy se substituovaným indoxyl glukosidem jako substrátem Metachromatické barvení je takové, při němž se některé struktury nebo látky barví v odlišném barevném tónu, než je použité barvivo. Jestliže se barví ve stejné barvě, jedná se o ortochromatické barvení. Toluidine blue O staining of A. thaliana stem cross-sections. Toluidine... | Download Scientific Diagram Toluidine blue O staining of A. thaliana stem cross-sections. Toluidine blue O staining of a wild type A. thaliana stem section showing the normal lignin deposition in the walls of interfascicular fibers and xylem cells ( A - E ). The positions of the epidermis and cortex (Ep), interfascicular fibers (Fi), pith (Pi), and xylem (Xy) are indicated. Magnifications: Panel A : 5X; Panel B : 10X; Panel C : 20X; Panels D and E : 40X. Bar = 100 μm. Mitra et Loqué 2014 Phloroglucinol-HCl staining of A. thaliana stem cross-sections .... | Download Scientific Diagram Phloroglucinol-HCl staining of A. thaliana stem cross-sections . Phloroglucinol-HCl staining (pink or fuchsia color) of a wild type A. thaliana stem section showing the normal lignin deposition in the walls of interfascicular fibers and xylem cells ( A - E ). The positions of the epidermis and cortex (Ep), interfascicular fibers (Fi), pith (Pi), and xylem (Xy) are indicated. Magnifications: Panel A : 5X; Panel B : 10X; Panel C : 20X; Panels D and E : 40X. Bar = 100 μm. Metachromatické barvení Ortochromatické barvení Biology 252 -- Plant Morphology and Systematics Home Page o-Toluidine Structure thumbnail Fig 2. Combined red and green channel confocal images of acridine orange-stained spruce early wood. The staining conditions were 50 μmol/L acridine orange in phosphate buffer, pH 7. The scale bar is 100 μm. Houtman et al. 2016 Ruthenium red staining of wild-type and mutant seeds. A, Wild-type seed... | Download Scientific Diagram Ruthenium red staining of wild-type and mutant seeds. Western et al 2001 Cross-section of the Pteridium aquilinum leaf, stained with Calcofluor White (confocal microscope). (Wikipedia) AO – pektin červeně, lignin žlutě, RR – pektin červeně, Responsive image Anilinová modř - kalóza, fluorescence Relationship between plant lipid bodies and fungal endophytes Sudan IV – lipidová tělíska červeně Postup při podvojném sukcesivním (sukcedánním) barvení: alcianová modř - jaderná červeň stálá (Kernechtrot, nuclear fast red) •1. odparafínování řezů (xylen) •2. převedení řezů do vody •3. vlastní barvení: • a) 3% roztok kyseliny octové 10 min. • b) barvení buněčných stěn - 1% alcianová modř v 1% kyselině octové 10 min. • c) opláchnutí 3% kyselinou octovou • d) praní v tekoucí vodě 10 min. • e) barvení buněčných jader - 0,1% jaderná červeň stálá v 5% roztoku Al2(SO4)3, 5 - 15 min. •4. opláchnutí destilovanou vodou •5. odvodnění alkoholovou řadou •6. převod do xylenu •7. uzavření do syntetické pryskyřice Eukitt® • Po převodu preparátů do vody je možno započít samotné barvení v barvivech zvolených podle předem stanovených požadavků. Po obarvení jsou řezy uzavírány do kanadského balzámu nebo média pro uzavírání (montování) vzorků (např. Eukitt), který je schopen preparáty zachovat desítky let. Kanadský balzám i ostatní média nejsou mísitelná s vodou, ale s xylenem, proto je nutné obarvené řezy před zamontováním převést vzestupnou alkoholovou řadou zpět do xylenu. Podvojné barvení sukcedánní: alcianová modř - pravá jaderná červeň parafínový řez listem kosatce Iris sp. tloušťka řezu 15mm