Detekce indukce reparačních mechanismů DNA a aktivace apoptózy indukované cytotoxickými látkami u nádorových buněk
Seznam plánovaných experimentů:
1. Sledování vlivu cytotoxické látky poškozující DNA na proliferaci buněk.
2. Detekce indukce reparačních mechanismů DNA metodou nepřímé imunofluorescence.
3. Detekce indukce reparačních mechanismů DNA a aktivace apoptózy průkazem štěpené formy kaspázy 3 a PARP za využitím elektroforézy a westernového přenosu.
4. Měření četnosti mrtvých buněk pomocí barvení sytox green a analýzou na průtokovém cytometru.
5. Stanovení subGo fáze buněčného cyklu průtokovou cytometrií.
6. Transfekce nádorových buněk lipofekcí a stanovení aktivity transkripčního faktoru p53 transaktivačními testy.
/. /. Sledování vlivu cytotoxické látky poškozující DNA na proliferaci buněk
Úvod:
V současné době se při léčbě pacientů s různými onkologickými onemocněními využívají chemoterapeutika, což jsou látky s cytotoxickým nebo cytostatickým účinkem, které působí na specifické buněčné procesy v nádorových buňkách. Jejich hlavním účinkem je zastavení růstu nádorových buněk. Jednou z těchto látek je i Cisplatina (cisdiamino-dichlor platnatý komplex, CDDP) řadící se mezi tzv. alkylační cytostatika. Mechanismus protinádorového účinku cisplatiny spočívá v její interakci s DNA a v tvorbě kovalentních vazeb mezi cytostatikem a purinovými bázemi, nejčastěji s guaninem. Což vede k zastavení replikace a indukci opravných mechanismů, mimo jiné k aktivaci proteinových kináz ATR nebo ATM a stabilizaci p53 nádorového supresoru. Cisplatina působí jako látka nespecifická pro buněčný cyklus a ovlivňuje tedy i buňky ve fázi Go.
Cíl:
Sledovat efekt působení cytotoxické látky, Cisplatina, na proliferaci buněk MDA-MB-231.
Postup a příprava vzorků:
1. Adherentní buňky MDA-MB-231 budou použity do experimentů. Pokud se v protokolu objevuje věta „ Adherentní buňky MDA-MB-231 trypsinizací převést do suspenze, spočítat." Má se tím na mysli následující postup.
a. Například pro buňky pěstované na 10 cm misce.
b. Nejprve odsát médium a buňky opláchnout 5 ml lx PBS.
c. Přidat 2 ml Trypsinu na 10 cm kultivační misku a misku přenést do inkubátoru na 5 -10 minut, dle typu a konfluence buněk.
d. Pak přidat 8 ml čerstvého média (DMEM, s 10% FCS (Foetal calf sérum), antibiotiky a Glutminem L.
e. Odebrat 70 ul a přenést je do zkumavky na měření buněk. Přidat 7 ml PBS a změřit počet buněk na přístroji (Innovatis CASY Cell Counter and Analyzer TT + CASY).
2. Na 6ti-jamkovou kultivační destičku nasadit buňky v koncentraci 4* 105b/jamku/3 ml (bude nasazeno předem).
3. Kultivace buněk 24 hod při 37°C v 5% atmosféře CO2.
4. Přidání zvolené cytotoxické látky Cisplatina (CDDP) o finální koncentraci 100 uM.
5. Kultivace buněk 24 hod při 37°C v 5% atmosféře CO2.
6. Ve zvoleném časovém intervalu (24, 48 a 72 hodin) buňky promyjeme lxPBS, trypsinizací převedeme do suspenze a spočítáme.
1
/. 2. Sledování vlivu zvyšující se koncentrace cytotoxické látky poškozující DNA na proliferaci buněk
Cíl:
Sledovat efekt zvyšující se koncentrace cytotoxické látky, Cisplatiny, na proliferaci buněk MDA-MB-231 buněk.
Postup a příprava vzorků:
1. Adherentní buňky MDA-MB-231 trypsinizací převést do suspenze, spočítat. Nasadit na 5 ml kultivační misky v koncentraci 4* 105b/3 ml (bude nasazeno předem).
2. Kultivace buněk 24 hod při 37°C v 5% atmosféře CO2.
3. Přidání zvolené cytotoxické látky CDDP o koncentraci 0, 1, 5, 10, 50 a 100 uM.
4. Kultivace buněk 72 hodin při 37°C v 5% atmosféře CO2.
5. Buňky promyjeme lxPBS, trypsinizací převedeme do suspenze a spočítáme.
2. Detekce aktivace reparačních mechanismů DNA metodou nepřímé imunofluorescence
Úvod:
Poškození DNA je proces, který vede k poškození DNA řetězce nebo k záměně daného nukleotidu za jiný, a tím pádem ke vzniku mutace. Poškození DNA může být způsobeno fyzikálními, chemickými a biologickými faktory. Mezi chemické faktory způsobující poškození DNA patří i Cisplatina, viz výše, a Doxorubicin, což j e cytotoxické antracyklinové antibiotikum izolované z kultur bakterie Streptomyces peuceutíus, var. Caesíus. Obdobně jako Cispaltina, Doxorubicin se také váže na DNA, a to současně na oba řetězce. Tento proces se nazývá - interkalace, která znemožňuje replikaci DNA při dělení buňky a transkripci. Doxorubicin dále inhibuje enzym topoizomerázu II, která se významně podílí na replikaci DNA a re-ligaci DNA v průběhu oprav poškozené DNA, a tím dochází k endogennímu poškození DNA, a následně i zastavení buněčného cyklu.
V průběhu evoluce si buňky vytvořily reparační mechanismy (z anglického DNA damage repair pathways), které dokáží opravit DNA na různých úrovních. Savčí buňka disponuje nejméně pěti typy oprav DNA, a to: Přímá oprava, Excizní opravy (BER - base excision repair, NER - nucleotid excision repair), Mismatch repair, Homologní rekombinace a Nehomologní spojení konců DNA. Pro každou z oprav je typické zapojení specifických proteinů a signálních drah. Pro potřeby cvičení se zaměříme na proteiny, které se účastní procesu rozpoznání a oprav DNA, jako y-H2A-X. Protein y-H2A.X patří do histonů z rodiny H2A a jeho fosforylace na Ser-139 asociuje s místy dvouřetězcových zlomů v DNA, například po působení DNA interkalujících látek.
Nepřímá ímunoflour e scénce - je metoda, která slouží k
detekci množství, lokalizaci a strukturního uspořádání proteinů ve fixovaných buňkách nebo tkáních
využívá specifické primární protilátky
sekundární protilátky jsou značené fluorescenční molekulou (FITC, texas red, rhodamin, ...), která po excitaci zářením o určité vlnové délce emituje záření o jiné vlnové délce fluorescenční mikroskop - musí být osazen jak excitačním filtrem (zářeni dopadající na preparát) tak i emisním filtrem (filtruje záření vycházející z preparátu) umožňuje detekci více proteinů naráz (více fluorescenčních molekul)
2
lze lokalizovat studovaný protein do buněčných organel, pokud jsou dané buněčné organely značené specifickými sondami.
Fixační média - Fixace je postup, který je prováděn za účelem zastavení všech procesů, probíhajících v buňce, a současného zachování co možná nejpřesnějšího stavu a struktury buňky, tkáně, atd. Fixační činidlo je voleno podle řešeného diagnostického problému, typu a velikosti dostupného materiálu a podle zvolené zalévací a barvicí metody. Nejběžněji se používají roztoky formaldehydu, paraformaldehydu, glutaraldehydu, methanolu.
Montovací média - pro ochranné účely a následné optimální mikroskopické sledování jsou obarvené buňky montovány vhodnými montovací mi činidly. Použitý typ závisí na daném protokolu. Jedním z nej důležitějších parametrů montovacích médií je index lomu (nD); musí být okolo 1,5, čímž odpovídá indexu lomu skla. Glycerol, Mowiol (Calbiochem), Vectashield (Vector), Flouromont-G (Sothern Biotechnology Associates).
Cíl:
Zjistit, zda v buňkách MDA-MB-231 vystavených působení cytostatické látky dochází k aktivaci reparačních mechanismů DNA.
Postup a příprava vzorků:
1. Před vlastním vysetím MDA-MB-231 buněk do jamky 6ti-jamkové kultivační destičky vlož krycí sklíčko opálené v 100% EtOH.
2. Adherentní buňky MDA-MB-231 trypsinizací převést do suspenze, spočítat. Nasadit na 6ti-jamkovou kultivační destičku v koncentraci 6* 105b/jamku/4ml (bude nasazeno předem).
3. Kultivace buněk 24 hod při 37°C v 5% atmosféře CO2.
4. Přidání zvolené cytotoxické látky Cisplatina o koncentraci 100 uM a Doxorubicin 0,4 ug/ml.
5. Kultivace buněk 24 hod při 37°C v 5% atmosféře CO2.
6. Buňky opláchnout PBS a fixovat 30 minut ve 4% paraformaldehydu při pokojové teplotě.
7. Buňky opláchnou 2xPB S.
8. Permeabilizace membrán roztokem PBS/Triton X-100 (0,2% Tritonem X-100 v PBS) po dobu 20 minut při pokojové teplotě a oplach 2xPBS.
9. Inkubace buněk s primární protilátkou naředěnou v PBS/BSA ve 4°C přes noc.
10. Oplach buněk 3x10 minut roztokem PBS/BSA/Tween.
11. Inkubace buněk se sekundární protilátkou, ředění 1:300, v PBS/BSA po dobu 1 hodiny při pokojové teplotě.
12. Oplach buněk 3x10 minut roztokem PBS/BSA/Tween.
13. Obarvení jaderné DNA za pomocí PI (propidium jodid, koncentrace 10 ug/ml) naředěném v roztoku PBS/BSA/Tween po dobu 5 minut při pokojové teplotě. Možná alternativa je, když montovací médium obsahuje barvičku, která je schopna barvit DNA? Jako například DAPI (4',6-diamidin-2-fenylindol).
14. Nakonec sklíčka opláchneme destilovanou vodou. Na podložní sklo nanesu 3 ul Mowiolu (montovací medium od firmy Calbiochem). Opatrně otočím krycí sklíčko stranou s buňkami dolů a položím na kapku Mowiol na podložním skle. Preparáty pozorujeme ve fluorescenčním mikroskopu s vhodným emisním a excitačním filtrem pro FITC.
3
Použité protilátky a roztoky:
PBS - fosfátový pufir, pH = 7,6 Navažte a smíchejte:
- 8 g NaCl
- 0,2 g KC1
- 0,24 g KH2PO4
- l,44gNa2HP04
- doplňte vodou do 800 ml a rozpusťte za stálého míchání
- upravte pomocí HC1 na požadované pH
- doplňte vodou do 1000 ml
PBS/Triton X-100
- Do 100 ml PBS přidejte 200 ul Tritonu X-100.
- Výsledná koncentrace Tritonu X-100 je 0,2%.
PBS/BSA
- Do 200 ml PBS přidejte 200 mg BSA.
- Výsledná koncentrace B SA j e 1 mg/ml.
PBS/BSA/Tween
- Do 500 ml PBS/BSA přidejte 250 ul Tween-20.
- Výsledná koncentrace Tween-20 je 0,05%. Fixační směs: 4% paraformaldehyd v PBS
Montovací médium: Mowiol s DAPI (Calbiochem)
Protilátky:
- myší monoklonální anti - H2A.X - P (Ser 139) protilátka, (cat.n.: 613402), (Biolegend)
- myší monoklonální anti-53BPl protilátka, (cat.n.: SCT-4937), (Santa Cruz)
- anti-myší IgG konjugovaná s FITC (Invitrogen)
3. Detekce indukce reparačních mechanismů DNA a aktivace apoptózv průkazem štěpené formy PAR P a změna hladin faktoru řídící buněčný cyklus za využitím elektroforézv a westernového přenosu.
Úvod:
Pokud buňka není schopna efektivně opravit poškozenou DNA, pak zpravidla aktivně zahájí proces apoptózy. Apoptóza, neboli typ I programované buněčné smrti, slouží k eliminaci nepotřebných či poškozených buněk. Je součástí fyziologických i patologických dějů. Během apoptózy dochází ke kondenzaci chromatinu, fragmentaci DNA a rozpadu buněk na apoptotická tělíska, která j sou následně fagocytována. Apoptóza je charakteristická dvěma signálními drahami - vnitřní - řízená mitochondriemi a vnější - řízená aktivací receptoru smrti.
Cíl:
Zjistit, zda v buňkách MDA-MB-231 vystavených působení chemoterapeutika dochází k indukci reparačních mechanismů DNA a aktivaci apoptózy.
Postup a příprava vzorků:
1.  Adherentní buňky MDA-MB-231 trypsinizací převést do suspenze, spočítat. Nasadit na 6ti-jamkovou kultivační destičku v koncentraci 6* 105b/jamku/4ml (bude nasazeno předem).
4
2. Po 24 hodinách buňky ovlivníme Cisplatinou o koncentraci 0 a 100 uM a Doxorubicin 0,4 ug/ml samostatně nebo společně.
3. Další den buňky převedeme trypsinizací do roztoku, stočíme centrifugací 4min/290g, odsajeme médium.
4. Promyjeme stočený pelet PBS jako v předchozím kroku.
5. Pelet lyžujeme v 50 ul Lyzačním pufru (10 mM Tris pH=8,0; 25 mM EDTA; 1% SDS).
6. Měření koncentrace proteinů (DC™ Protein Assay Kit, Bio-Rad, kat.č.: 5000111):
a. Na mikrodestičku pipetovat 5ul každého vzorku ve třech opakováních.
b. Ke vzorkům přidat 25 ul roztoku A' (obsahuje 20 ul roztoku S na 1 ml roztoku A).
c. Přidat 200 ul roztoku B, zbavit vzorky bublin a ponechat 15 minut stát.
d. Poté změřit absorbanci na ELISA readeru při 750 nm.
e. Vypočítat vhodné ředění vzorků tak, aby na SDS-PAGE bylo naneseno stejné množství proteinů od každého vzorku.
7. Připravené lyzáty o dané koncentraci proteinů smícháme  s odpovídajícím množstvím připraveného 3x Laemmli pufr a povaříme 5 minut při 100°C.
Příprava akrylamidového gelu:
1. S použitím rukavic vyčistit skla, promýt pod tekoucí vodou, umýt detergentem, propláchnout destilovanou vodou, opláchnout ethanolem a utřít.
2. Sestavit skla se spacery a sevřít je svorkami.
3. Připravit roztok pro dolní (separační) gel, jemně promíchat a nalít mezi připravená skla asi do 2/3. Převrstvit gel slabou vrstvou destilované vody. Nechat polymerovat 30 minut.
4. Slít horní vrstvu destilované vody, připravit roztok pro horní (zaostřovací) gel, nalít jej na dolní gel, vsunout hřebínek a nechat polymerizovat 45 minut.
Nanášení vzorků a elektroforéza:
1. Skla s gelem umístíme do elektroforetické aparatury, dolijeme elektroforetický pufr a opatrně vytáhneme hřebínky.
2. Na gel nanášíme 10-20 ul vzorku (množství závisí na koncentraci proteinů v buněčných lyzátech).
3. Připojíme aparaturu ke zdroji. Pro průchod horním gelem aplikujeme 80V, poté zvýšíme napětí na 120V.
4. Elektroforézu zastavím v momentě, když čelo barvičky v gelu opouští gel.
Sestavení blotovací/transferové aparatury:
1. Nastříháme 4 kusy papíru Whatman 3MM a PVDF (polyvinylidene difluoride) membránu stejné velikosti jako je proteinový gel.
2. PVDF membránu aktivujeme MetOH.
3. Plastikovou svorku umístíme do vaničky s transferovým pufrem černou plochou dolů. Na ní položíme porézní podložku a vytlačíme bubliny.
4. Na podložku umístíme 2 navlhčené filtrační papíry Whatman a opět vytlačíme bubliny.
5. Na papíry Whatman položíme gel a na něj opatrně navlhčenou PVDF membránu.
6. Na membránu pak opět položíme dva papíry Whatman, vytlačíme bubliny a na ně druhou porézní podložku. Opět vytlačíme bubliny.
7. Takto sestavený sendvič sevřeme do plastikové svorky a umístíme do vaničky s transferovým pufrem a chladítkem.
5
8.  Blotujeme 1 hod při 100 V.
Detekce proteinů na membráně pomocí protilátek:
1. Po skončení blotingu/transferu promyjeme membránu v 5% roztoku sušeného mléka v TBS-Tween po dobu 30 minut při pokojové teplotě nebo přes noc při 4°C.
2. Inkubujeme membránu s primární protilátkou ředěnou 1:1000 v TBS-Tween 1 hod při pokojové teplotě nebo přes noc při 4°C.
3. 3x promyjeme v TBS-Tween (cca 5 minut každé promytí).
4. Inkubujeme membránu 1 hod se sekundární protilátkou s konjugovanou peroxidázou (anti-mouse IgG ředěná 1:5000 v TBS-Tween) při pokojové teplotě.
5. Promyjeme třikrát 5min TBS-Tween.
6. Opláchneme membránu v destilované vodě.
7. Na membránu nakapeme substrát ECL a inkubujeme 5 min při pokojové teplotě.
8. Detekce signálu v temné komoře nebo za využití detekčního zařízení s citlivou kamerou.
9. Po vyvolání signálu membránu obarvíme v 0,2% roztoku amidoblack - nespecifické barvení proteinů, potvrzení srovnání hladiny celkových proteinů
Použité roztoky
TBS:
50 ml lMTris-ClpH=8.0 57,6 ml 5MNaCl doplnit vodou do 2 litrů
Transferový pufr: 48mM Tris 39mM glycin 20% methanol
Odbarvovací roztok: 500 ml metanolu 400 ml destilované vody 100 ml kyseliny octové Barvící roztok: (barvení proteinů na gelu)
2,5 g Coomassie Blue na 1L odbarvovacího roztoku
- pro barvení proteinů na membráně:
lg amidové černi na 1L odbarvovacího roztoku
TBS-Tween:
přidat 1,5 ml Tween 20 do 2 litrů TBS
Tris-glycin elektroforetický pufr (ph=8.3): 25mM Tris 250mM glycine 0,1% (w/v) SDS
Dolní (dělící) gel - 10% (lOml) Horní (zaostřovací) gel - 4% (7.5ml)
H20 4,9 ml H20 5,62 ml
40% Akrylamid 2,4 ml 40% Akrylamid 0,79 ml
1,5M Tris-Cl (pH=8,8) 2,5 ml 1,5M Tris-Cl (pH=6,8) 0,94 ml
10% SDS 0,1 ml 10% SDS 75 ul
Ammonium persulfate 75 ul Ammonium persulfate 30 ul
TEMED 7,5 ul TEMED 10 ul
Lyzační pufr
10 mM Tris pH=8,0; 25 mM EDTA; 1% SDS
4. Měření četnosti mrtvých buněk pomocí barvení sytox green na průtokovém cytometru.
Úvod:
Sytox green je barvivo, které se váže na nukleové kyseliny v buňce a po ozáření světlem o vlnové délce 488 nm emituje záření o vlnové délce 523 nm. Sytox green nedokáže procházet přes buněčné membrány živých buněk, jenom přes porušené membrány mrtvých buněk, je proto vhodným barvivem pro detekci buněčné smrti.
6
Cíl:
Zjistit, zda-li dochází k indukci buněčné smrti u buněk prsního karcinomu vystavených působení sledovaných chemoterapeutik.
Postup a příprava vzorků:
1. Adherentní buňky MDA-MB-231 převést do suspenze, spočítat. Nasadit na 2ml misky v koncentraci 3* 105b/2ml.
2. Kultivace buněk 24hod při 37°C.
3. Ovlivnění buněk Cisplatinou o koncentraci 0 a 100 uM a Doxorubicin 0,4 ug/ml samostatně nebo společně.
4. Kultivace buněk 24 a 48 hodin při 37°C.
5. Sklizení buněk včetně buněk plovoucích v médiu.
6. Stočit a odsát supernatant.
7. Suspendovat pelet v 0,2 ml lx PBS se sytox green (ředění 1: 10 000).
8. Měření na průtokovém cytometru FACSVerse.
5. StanovenísubGo fáze buněčného cyklu průtokovou cytometrií
Úvod:
Ovlivnění nádorových buněk chemoterapeutiky může být doprovázeno změnami v regulaci buněčného cyklu. Tyto změny lze sledovat analýzou obsahu DNA v buňkách po obarvení propidium jodidem pomocí průtokového cytometru FACSVerse. Propidium jodid (PI) je interkalující barvivo, které se váže k nukleové kyselině a po ozáření světlem o vlnové délce 488 nm emituje záření o frekvenci vyšší než 560 nm. Pro proniknutí do živých buněk je potřeba buňky nejdříve fixovat (nebo do barvicího roztoku přidat slabý detergent). Množství navázaného barviva je úměrné množství DNA v buňce. Z jednoparametrové analýzy fluorescenčního signálu propidium jodidu je možné určit obsah DNA v buňkách a tím i fázi buněčného cyklu, ve které se buňky nacházejí. Při indukci apoptózy můžeme buňky detekovat v subGo fázi buněčného cyklu.
Cíl:
Zjistit, zda-li sledované chemoterapeutikum indukuje vstup buněk do subGo fáze buněčného cyklu a vyhodnotit změny v distribuci ostatních fází buněčného cyklu.
Postupa příprava vzorků:
1. Adherentní buňky MDA-MB-231 převést do suspenze, spočítat. Nasadit na 5ml misky v koncentraci 0,8* 106/5ml (bude nasazeno předem).
2. Následující den přidat k buňkám Cisplatinu o koncentraci 0 a 100 uM a Doxorubicin 0,4 ug/ml samostatně nebo společně.
3. Kultivace buněk 24 a 48 hodin při 37°C v 5% atmosféře CO2.
4. Buňky trypsinizovat a médium s buňkami pipeto vat do 15ml zkumavek, sklidit buňky 1 mM EDTA v PBS, centrifugace 500g/5min.
5. Buňky promýt 1 xPB S.
6. Pelet rozsuspendovat v 0,25 ml PBS a přikapat 2 ml vychlazeného 70% etanolu.
7. Fixace min. 30 min v 4°C nebo v -20°C.
8. Centrifugace 500g/5 min, odsát supernatant.
7
9. Promýt4ml lxPBS.
10. Rozsuspendovat ve Vindelově roztoku (obsahuje proprium Jodid a RNázu).
11. Barvit 30 min, 37°C, ve tmě.
12. Analýza množství DNA průtokovým cytometrem.
6. Transfekce nádorových buněk lipofekcí a stanovení aktivity transkripčního faktoru p53 transaktivačními testy
Úvod:
Protein p53 jako transkripční faktor je ve funkci nádorového supresoru aktivovaný různými stresovými podmínkami. Protein p53 se váže na specifické sekvence a ovlivňuje tak expresi svých cílových genů. Některé z cílových sekvencí, například p21/wafl, jsou zodpovědné za stresem indukované zastavení buněčného cyklu v přechodu z fáze Gl do S. Jiné, například box nebo puma, indukují apoptózu. Detekce aktivity p53 je možná pomocí přechodné transfekce metodou lipofekce, s použitím konstruktu pRGC-luc, který obsahuje syntetickoup53 vazebnou sekvenci RGC (ribosomal gene cluster) zařazenou před promotor tk-luc (Kern et al., 1991). Tento konstrukt umožňuje sledovat aktivitu p53 pomocí luciferázové aktivity.
Lipofekce je metoda při níž dochází k vytvoření komplexů záporně nabité plazmidové DNA skationickým lipidovým činidlem. Takto vytvořené komplexy jsou schopny pronikat přes lipidovou membránu do eukaryotických buněk.
Postup - lipofekce:
1. 4x105 buněk LM5 nasadit do 3 ml kultivačního média a kultivovat 24 hod při 37°C v 5% atmosféře CO2.
2. Do 200 ul média Opti-MEM přidat 2 ug transfekční plazmidové DNA a 2 uL Plus reagentu a lehce promíchat. Inkubovat 5 minut při pokojové teplotě.
3. K naředěné DNA přidat 4 uL Lipofectamine 3000 připraveného v 200 ul média Opti-MEM, lehce promíchat a inkubovat při laboratorní teplotě 30 minut.
4. Transfekční směs nakapat na buňky a inkubovat 24 hod při 37°C v 5% atmosféře CO2.
5. Vyměnit médium, ošetřit buňky Cisplatinou o koncentraci 0 a 100 uM, Doxorubicin 0,4 ug/ml samostatně nebo společně, a inkubovat 24 h při 37°C v atmosféře 5% CO2.
6. Stanovit aktivitu luciferázy z extraktů přechodně transfekováných buněk transaktivačním testem, stanovit koncentraci proteinů.
Použité roztoky:
Pufr (2) pro aktivitu luciferázy: 25 mM gly-gly - 0,5 ml 15 mM K-fosfátu-75 ul 15mMMgS04-75 ul 4 mM EGTA - 50 ul 2 mM ATP - 100 ul 1 mM DTT - 5 ul ddH20 -4,195 ml
Postup-stanovení aktivity luciferázy z extraktů přechodně trans fetovaných buněk transaktivačním testem:
1. Odsát médium, promýt buňky v lx PBS, sklidit a centrifugovat 5 min/500g/pokojová teplota.
2. Odsát supernatant, pelet suspendovat v 50 ul roztoku 0,25M Tris.Cl pH 7,5.
8
3. Lyžovat buňky třemi cykly prudkého zamražení v - 80 °C a rozmražení. Extrakt zbytečně nevystavovat pokojové teplotě a světlu - ztráta aktivity luciferázy.
4. Centrifugace 5 min/4 °C/max. výkon.
5. Přenést supernatant do nové zkumavky, umístit na ledu pro provedení testu nebo v - 80 °C pro dlouhodobé uchování.
Postup - Měření aktivity luciferázy:
1. 10 ul lyzátu přenést do 90 ul 0,25 M Tris pH 7,5 a 360 ul pufru 2.
2. Přenést zkumavky do luminometru, přidat 200 ul roztoku luciferinu, který se připraví smícháním 1,2 ml H20, 0,3 ml 5mM Luciferinu a 2,5 uM 1 M DTT (1 mM luciferin s 10 mM DTT ředěný ve vodě v poměru 1:4).
3. Změřit aktivitu luciferázy.
4. Relativní luciferázovou aktivitu spočítat jako aktivita luciferázy na množství proteinu v lyzátu.
Stanovení koncentrace proteinů:
Koncentrace proteinů buse stanovena jako v úloze 3. Působení Cisplatiny na buněčné procesy.
Informace k účinku cis-platiny.
Cisplatin Cisplatin
Aktivace cisplatiny a indukce poškození DNA. A) Proces aktivace cisplatiny probíhá výměnou jednoho nebo   dvou  jejích   chloridů   za  molekuly vody (monoaquated a diaquated).
B) Cisplatina může vytvářet kovalentní vazby s DNA. Hlavní léze DNA jsou vnitrořetězcové adukty DNA a meziřetězcové křížové vazby (ICL). Procenta představují frekvenci každého typu poškození DNA vyvolaného cisplatinou.
Clinics (Sao Paulo). 2018 Sep 6;73(suppl l):e478s. doi: 10.606 l/clinics/2018/e478s.
9
Poškození DNA - určení zvýšeného počtu míst reparace pomocí yHA2.X za využití nepřímé imunoflueoresce. Přítomnost hladiny yH2A.X pomocí western blotu.
Zjištění aktivace p53 za využití reportérového systému p53-dependentních sekvencí a luciferázy.
Průkaz apoptózy detekcí štěpenou formou PARP.
Vliv na buněčný cyklus hladina p21, počet mrtvých a živých buněk, množství DNA -Sytox green a propidium jodid.
Oncogene. 2003 Oct 20;22(47):7265-79. doi: 10.1038/sj.onc. 1206933.
NH, Cl
Cisplatin
t
DNA adducts
+
Damage Recognition Proteins
Apoptosis
10