Neurální kmenové buňky – NSCs (Neural stem cells) lokalizace NSCs a) b) a) subventrikulátní zóna (SVZ), postranní komory b) subgranulární zóna DG Gl – glomerularní vrstva Gr – granulární vrstva EPl – vnější plexiformní vrstva Mi – vrstva mitral buněk IPL – vnitřní plexiformní vrstva cc - corpus callosum LV - lateral ventricle CPu - caudate putamen (striatum) DG - dentate gyrus SN - substantia nigra Neurogeneze v dospělosti! (hlodavci (savci obecně??), zpěvní ptáci) v neurogeneze v důsledku březosti ♀ v neurogeneze v době vábení ♂ v při rozvoji motorických fcí (SGZ) v neurogeneze regulovaná hormony v RMS – rostrální migrační tok (rostral migratory stream) (- u člověka neověřeno?!) C (TA) A (neuroblast) migrace E (ependym) ? radial glia* astrocyt glia prekursor neurony oligo- dendrocyt Shh; Delta/Notch -> Hes Sox1, 2, 3; Emx2; Zic1; Pax6 Oblast s NSCs obsahuje čtyři typy buněk 1) pomalu proliferující, astrocytům podobné (GFAP+/nestin+/SSEA1+/CD133+) buňky - typ B = NSCs (přesný fenotyp není dosud úplně objasněn - ±GFAP??, ± nestin ??) 2) spící, případě potřeby intenzivně proliferující buňky vzniklé z buněk B - typ C (TA progenitory, přechodně/transientně se dělící progenitory) 3) z buněk typu C vznikají buňky A = neuroblasty 4) ependymální buňky - typ E B (NSC) *radiální glie – embryo a časně postnatálně EGF (in vitro) embryo EGF+FGF2 (in vitro) STAT3 -> Delta Fenotyp neurálních kmenových buněk „Niche“ neurálních kmenových buněk Architektura v subventrikulární zóně (SVZ) Architektura v subgranulární zóně (SGZ) rA – radiální astrocyty hA – horizontální astrocyty D – nezralá granulární buňka G – nová granulární buňka NSC přisedají na krevní kapiláry - přísun živin, růstových faktorů? - NSC exprimují HIF. (hypoxií indukovaný faktor) Původ NSC - pozůstatek neurogenní populace z časné embryogeneze Huttner 2005 Vertikální a horizontální dělení v neurogenním epiteliu Haydar 2002 Proporční změny v symetrii buněčného dělení mezi neurálními kmenovými buňkami (stem) a neurálními progenitory (neurogenic, transientně se dělícími buňkami – TA) v půběhu neurogeneze u myši radial_glial_cell Full-size image (83 K) Vývoj CNS Lui et al., 2011 Radiální glie (RG) jako embryonální NSC Nestin+, Vimentin+, GFAP+, Sox2+, Pax6+ vRG – bipolární RG, ventrikulární zóna oRG – unipolární radial glia-like cells, vnější ventrikulární zóna IP – přechodné progenitory A) Buňky exprimující znaky/markery charaktristické pro časné progenitory (Sox2) a neurony (NeuN a CTIP2) ve ventrikulární zóně neokortexu. B) Dělení oRG ve vnější vertikulární zóně C) RG/vRG dávají vznik jak vRG tak oRG, zda je vždy zachována délka radiál. fibril není známo D) oRG produkují přechodně/transietně se dělící buňky schopné dále diferencovat E) Diferenciace potomků oRG, ztráta exprese Sox2 a snižení aktivity Notch (snížení HES1), zvýšení exprese TBR2 oRG na rozdíl od vRG neexprimují CD133 (Prominin), Par3 (PARD3), aPKCl , tj. součásti apikální membrány charakteristické pro apikálně-bazálně polarizovaných buněk. Schéma kortexu hlodavců (A) a člověka (B) Lui et al., 2011 Stratifikace buněk v germinální zóně neurogeneze Quiescentní NSC1 neexprimují nestin na rozdíl od aktivních NSC2 (1 aktuální SC; 2 potencionální SC) Wang 2011 Figure2 Regulace NSC V–SVZ NSCs (dark blue), give rise to activated B1 cells (B1a, light blue) that actively divide. Activated B1 cells generate the transit-amplifying C cells (green) which, after three rounds of divisions, give rise to A cells, the migrating neuroblasts. Note that B1 cells contact the ventricle with an apical process. This adult VZ is also populated by ependymal cells E1, multiciliated cells that together with the apical endings of B1 cells from pinwheel structures on the surface. Coursing along this ventricular surface is a rich network of serotonergic axons (5HT, bright green). The basal processes of B1 cells have endings on blood vessels. Choline acetyltransferase (ChAT)-positive neurons (olive brown) found in the region have endings in the SVZ. Dopaminergic terminals (DAt, purple) are also observed in this region. Lim 2014 Cells born in different subregions of the adult V–SVZ migrate along the rostral migratory stream (RMS) into the olfactory bulb to give rise to unique types of interneurons. Examples of three types of granular cells (GC) [green: superficial; yellow: calretinin (CalR)superficial; blue: deep], three subtypes of periglomerular cells [pink: tyrosine hydroxylase (TH); orange: calretinin (CalR); purple: calbindin (CalB)] and four novel subtypes (type 1–4) of interneurons derived from the most anterior V–SVZ [27] are indicated in the top section of the olfactory bulb. Abbreviations: CalB, calbindin; CalR, calretinin; TH, tyrosine hydroxylase; PGC, periglomerular cell; GC, granule cell; GL, glomerular layer; EPL, external plexiform layer; ML, mitral cell layer; IPL, internal plexiform layer; GRL, granular layer. Lim 2014 Mechanismus regulace RG buněk – Notch dráha - neurální progenitory/IP aktivují Notch dráhu u RG buněk a tím blokují jejich diferenciaci - Notch je dále regulován hladinou volného a s Par3 vázaného NUMB (úloha bazální membrány) Lui et al., 2011 Neurogeneze – Notch dráha DLL1 – Delta-like 1 / ligad Notch Hes1 – Notch target /TF Tbr2 – Eomesodermin (EOMES) / T-box brain protein 2 Regulace klíčových signálních drah komponentami asociovanými s vazbou na bazální membránu + (Wnt) GSK3 signalizace Lui et al., 2011 1-s2 Dvojitá úloha Notch a gp130/STAT3 signalizace v neurogenezi - Notch a STAT3 aktivita se vzájemně podporují (STAT3 reguluje expresi ligandů Notch, Hes aktivuje STAT3) - oba v závislosti na dalších faktorech a statusu buněk podporují sebeobnovu NSC a indukci gliogeneze - V průběhu ontogeneze intenzivní proliferace NSC (radiální glie) a TA progenitorů, stimulováno LIF a CNTF v mozkomíšním moku, produkovaných zejména z plexus choroideus, důležitá a dosud neobjasněná interakce s Notch drahou/signalizací. - LIF/gp130 signalizace působí pleiotropně, u zralejších progenitorů indukuje diferenciaci do glií, zejména astrocyty (důležitá demethylace gliálních genů), a celkově podporuje maturaci neuronů, zejména motoneuronů. c-fig1a c-1ab a_Plexus_choroideus1 Plexus choroideus V průběhu embryogeneze jsou NSC tzv. radiální glie ventrikulární zóny (vRG + oRG) Adultní NSC jsou: 1) radiálním gliím podobné buňky, jako v průběhu embryogeneze 2) adaptované/pozměněné časné přechodné progenitory (IP)? 3) v dospělém mozku nejsou kmenové buňky s neomezenou schopností sebeobnovy, existují pouze IP schopné několika cyklů dělení a939f6aee8c8141099a90b0afe657117_LARGE v NSCs jsou široce multipotentní a experimenty s chimérami ukázaly, že NSCs dávají vznik buňkám všech tří zárodečných listů (netvoří pohlavní buňky, nebylo prokázáno) v u chimér se také NSCs nepodílí na hematopoéze i přesto, že v případě likvidace hematopoézy zářením, injikované NSCs ji obnoví (obojí děláno s myšmi ROSA26) v na druhou stranu není jasné, zda NSCs tvoří všechny typy neronů a glií (SC x TA) v neurální multipotentní progenitory byly izolovány i z retiny, optického nervu, hypothalamu, čichových laloků, čichového epitelu, a míchy v tyto směsné populace nejsou schopné dlouhodobé proliferace in vitro tak jako NSCs a také si zachovávají některé epigenetické znaky podle místa původu v po poškození mozku je možno neurogenezi detekovat i v striatu, neokortexu nebo v místech kortiko-spinálních motoneuronů v NSCs s věkem ubývá, podobně jako ostatní adultní SSCs, každopádně je lze izolovat z mozkové tkáně i několik hodin (4-6h) po diagnóze klinické smrti v in vitro se NSCs kultivují v podobě tzv. „neurosfér“ ve speciálních médiích určených pro expanzi neurálních progenitorů, bez séra, ale s nadbytkem FGF2 a EGF v LIF-gp130 / Notch blokují diferenciaci NSC, a podporují jejich proliferaci v „neurosféry“ jsou plovoucí útvary s navýšeným množstvím neurálních progenitorů a NSCs, lze v nich detekovat již i množství zralejších typů nervů i glií v i neurální progenitory (TA) lze dlouhodobě kultivovat Zobecněné vlatnosti NSCs Příprava neurosfér, primární a sekundární neurosféry (Dirks, 2008) Chimerická blastocysta vytvořená po smíchání blastomer normální a ROSA26 myši a myší embrya (11 dpc) normální a s ROSA26 chimerické myši. Clarke 2000 In vitro kultivace NSC – neurosféry c) EGFR + nestin; d) BrdU + buněčná jádra NSC jsou také schopny rekonstruovat hematopoézu (Bjornson 1999) A – kolonie ze zdravé kostní dřeně; B,C kolonie z kostní drěně NSCs (ROSA) transplantovaných myší po ozáření; D,E – GM-CFU z transplantovaných NSCs (ROSA); G,H - M-CFU z transplantovaných NSCs (ROSA); D,G a E,H – bez a s X-Gal; F – granulocyty + makrofágy & I – makrofágy, stanovení May-Grunwald-Giemsa Muller glia regenerate neurons in retina, no in adult, base in Ascl1 expression