Hypoxie a buněčný metabolismus anoxie - 0% kyslíku tkáňová hypoxie – 0-3% kyslíku tkáňová normoxie – 3-5% kyslíku atmosféra – 21% kyslíku In the human organisms, O2 concentration varies significantly between the tissues: in the lung parenchyma and in circulation (McKinley and Butler, 1999; Saltzman et al., 2003; Johnson et al., 2005; Wild et al., 2005), as well as in well irrigated parenchymal organs (liver, kidneys, heart; Wo¨ lfle and Jungermann, 1985; Jungermann and Kietzmann, 1997; Roy et al., 2000; Welch et al., 2001; Mik et al., 2004) it is comprised between 14% and 4%. In other tissues, relatively less irrigated, O2 concentration is even lower: in the brain, it varies from 0.5% to 7% (Whalen et al., 1970; Nwaigwe et al., 2000; Hemphill et al., 2005) in the eye (retina, corpus vitreous), from 1 to 5% (Buerk et al., 1993; reviewed in Yu and Cringle, 2005), in the bone marrow, from 0% to 4% (Tondevold et al., 1979; Chow et al., 2000). > Organismus (tepová a dechová frekvence) > Orgány / Tkáně (krevní tlak, angiogeneze, erytropoéza) > Buňky (hypoxická odpověď a metabolická adaptace buněk) Různé adaptace dle hierarchie, primární rozpoznání a odpověď vždy začíná na buněčné úrovni Regulace využití a dostupnost kyslíku: -Energetickou bilanci (hladina ATP x AMP => tvorba energie, …) -pH, aktivitu kanálů a transportérů (transformace energie, gradienty, …) -Pool intermediálních metabolitů (tvorba/transformace energie, výstavba buněk, ... -Genovou expresi -…. Co ovlivní změna hladiny O2 dostupného pro buňky / reakce buňky na změnu hladiny O2 -Energetický metabolismus (OXPHOS) -Hydroxylace (postranslační modifikace, detoxikace,..) -Produkce ROS a NOS (oxidativní vzplanutí, vazokonstrikce, transdukce signálu,..) -…. - Buněčné procesy vyžadující O2 -Pokles produkce ATP, nárůst koncentrace AMP – aktivace AMPK (AMP-activated protein kinase) -Nedostatek substrátu pro produkci –OH & ROS/NOS -Stabilizace hypoxií indukovaných faktorů – HIFs (hypoxia-inducible factors) -…. Mechanismy rozpoznání množství dostupného O2 buňkou - sensoring Výsledek sensoringu hladiny O2 u buňky (intenzita a význam odpovědi je buněčně specifický) -Adaptace metabolismu (O2↓ glykolýza x O2↑ OXPHOS, využití lipidů) -Produkce signálů a regulátorů vedoucí k celkové adaptaci (VEGF/angiogeneze; EPO / erytropoésa; změna membránového napětí / tepová a dechová frekvence) -Adaptace funkcí buňky (změny v expresi „pracovních“ proteinů) -Změna osudu buněk (proliferace, diferenciace/(transformace), apoptósa,…) - Základní cesta energetického metabolismu A) 1xglukóza + 2xATP => 2xpyruvát (laktát) + 4xATP + 2xNADH + 2xH+ (-2x NADH + 2x H+) C) 2x acetyl => 2x (1xATP + 3xNADH + 1xFADH2+ 2xCO2) D) 8xNADH + 2xFADH2 + 6xO2 => 34xATP B) 2x pyruvát => 2xCO2 + 2xNADH + 2xH+ A) B) C) D)↓ [USEMAP] v Krebs. cyklus => dostatek NADH a FADH2 pro tvorbu protonového gradientu v mitochondriích jako pohonu ATPsyntáz https://www.youtube.com/watch?v=zJNx1DDqIVo D) D) 8xNADH + 2xFADH2 + 6xO2 => 34xATP OXPHOS fphar-02-00049-g001 Inhibice glykolýzy v důsledku oxidativní fosforylace Produkty aktivity mitochondrií inhibují aktivityu enzymů glykolýzy Zapojení sacharydů, proteinů a lipidů v jednotlivých krocích energetického metabolismu b-oxidace mastnývh kyselin probíhá v mitochondriích, vazba na děje elektronového transportu na mitochondriální membráně Zapojení aminokyseliny (proteinů) do energetického metabolismu I. na O2 závislé – OXPHOS (dominantní) II. na O2 nezávislé, alternativní (relativně malé zastoupení) Zjednodušená sumarizace produktů anaerobní glykolýzy H+ - redukované kofaktory cytoplasma mitochondrie Gln – glutamin Glu – glutamát/kyselina glutamová Alternativní přeměny jsou spojeny s utilizací NH4+ -Využití glutaminu (Gln) / glutamatu (Glu) -Alternativy v energetickém metabolismu -Syntéza AA -Zpracování NH4+ -… Sumarizace úlohy a možnosti využití glutaminu (Gln) v metabolismu buňky -zdroj a-ketoglutarátu, alternativní tvorba ATP -utilizace NH4+ -… mitochondrie cytosol Ornitinový cyklus 2xNH4+ + CO2 +4xATP => CO(NH2)2 + 2xH+ + H2O + 4xADP + 4xPi Odbourání NH4+ - energeticky náročné ÞKomplikace při sníženém energetickém metabolismu Þ ÞVázáno na mitochondrie http://www.dietaken.cz/images_galerieobr/0_1.jpg Aminokyseliny v energetickém metabolismu Duplikace předchozího + vznik ketolátek a glukósy z oxalacetátu HYPOXIE ↓O2 Zajištění chodu buňky vyžaduje přeměnu chemické energie spojenou: -se s potřebou substrátů (glukósa, aminokyseliny, mastné kyseliny,...) -s regenerací kofaktorů – NADH/NAD+, FADH2/FAD, NADPH/NADP+ -s tvorbou ATP, GTP,… -se spotřebou O2 -s uvolněním finálních produktů (H2O, CO2, NH4+, laktát, ketolátky, vybraných AA,… -se syntézou potřebných molekul -… Pokles O2 pro OXPHOS => pokles ATP / nárůst AMP => aktivace AMPK (AMP-activated protein kinase) CaMKK2 - Ca2+/Calmodulin-dependent protein kinase LKB1 – Liver kinase B1 Energetický sensoring poklesu O2 ACC - Acetyl-CoA carboxylase Aktivace AMPK v závislosti na intenzitě stresu (acetyl-CoA => malonyl-CoA, 1st krok v syntéza FA) FBP - Fructose-1,6-biphosphate Syntéza lipidů a pentózový cyklus -Význam acety-CoA -Regenerace NADP+/NAD -Syntéza nukleových kyselin Aktivní AMPK zvyšuje uptake glukósy a potlačuje syntézu mastných kyselin Další regulátory aktivity AMPK a jí regulované procesy - obecně podpora tvorby ATP, uvolnění energetických substrátů - Inhibice anabolických procesů / syntézy ■ jsou součástí obecné odpovědi na hypoxii ■jsou konstitutivně exprimovány přítomnost ■ kyslíku indukuje jeho degradaci ■ nedostatek kyslíku způsobuje jeho akumulaci HIF – hypoxií indukované faktory Syntetický sensoring poklesu O2 20129101146154719 Prolyl hydroxylásy ( PHD) Asparagin hydroxylásy (FIH) - sensory kyslíku a regulátory stabilizace HIF-Xalpfa - substráty a-ketoglutarát (2-oxoglutarát), O2, kofaktor Fe2+,... Citric_acid_cycle_noi PHD+ PHD- Regulace HIF Degradace HIF v přítomnosti O2 - hydroxylace prolyl hydroxylásami PHD, asparagin hydroxylázami FIH - degradace v proteasomu zprostředkovaná pVHL faktorem - všechny podjednotky HIF prakticky konstitutivní exprese - regulace zejména degradací podjednotek HIFa (- částečně i regulací transkripce) (Von Hippel–Lindau tumor suppressor) Podpora glykolýzy prostřednictvím HIF-1 05f02 - zvýšení expresse GLUT1,4 - zvýšení exprese enzymů glykolýzy - inhibice přeměny pyruvátu na AcetylCoA Glykolýza – substráty intermediální produkty => růst buněk OXPHOS – energie => práce, produkce HIF – hypoxií indukovaný faktor HIF1b (ARNT) / HIF1a => HIF1 (obecná buněčná odpověď na hypoxii) - (-) exprese c-myc / cD1 => cell cycle arrest - stabilizace NICD (Notch)/ b-cat (Wnt) => (+) glykolýza - (+) glykolýza (PDK, Glut1/3, LDHA, HK,..) - (+) MTC4 (eflux laktátu) - (-) mitochondrie = (-) oxid. fosforylace (-) ROS - .... / HIF2a => HIF2 (částečně buněčně specifické, EPO) (EPAS1) - podpora buněčného cyklu (+) exprese c-myc / cD1 - syntéza FA - ... / HIF3a => HIF3 (kompetuje s HIFa, buněčně specifické) - inhibitor akce HIF (?) - … 1-s2 Stabilita a transaktivační aktivita HIF je také regulována dalšími postranslačními modifikacemi včetně fosforylace (vazba na buněčné signalizace) F7 1705872f1 Exprese a stabilita HIF-Xalpha jsou regulovány i methylací a acetylací, jak na DNA tak proteinové úrovni - Acetylace protein podporují degradaci přes interakci s pVHL Příklady dalších partnerů a substrátů PHD Další příklady významu O2 a hydroxylace Hydroxylace systémem cytochromu (součást detoxikace) Zralejší mitochondrie => víc ATP => víc ROS (reaktivní kyslíkové radikály) => poškození DNA => peroxidace lipidů, deregulace signálních drah HYPOXIE => stresované mitochondrie (bez O2 a Acetyl-CoA) => přechodně víc ROS (=> stabilizace HIF1) => přechodně akumulace fumarátu a sukcinátu (=> inhibice PHD => stabilizace HIF1) MITOCHONDRIE x HYPOXIE Produkce ROS mitochondriemi HIF1 - indukuje autofagii mitochondrií - potlačuje biogenezi mitochondrií => snížení ROS - potlačuje maturaci mitochondrií Life-cycle-of-MT- Na buněčné úrovni je množství a maturace mitochondrií regulována: A) Aktuální dostupností kyslíku – PHD / HIF -> částěčně i ochrana před ROS -> hospodárnost systému B) Anabolické pochody / syntéza – AMPK, PHD / HIF F2 Zástava Krebsova cyklu => pokles produkce citrátu => pokles Acetyl-CoA pro acetylasy histonů => inhibice epigenetické regulace genové exprese Hypoxie a na HIF nezávislá regulace genové exprese Signální dráhy podporující glykolýzu - Wnt a Notch -Indukce exprese c-myc + enzymů glykolýzy + příjmu a metabolismu glutaminu -Stabilizace HIF1a s b-cateninem (Wnt) a nebo s NICD (Notch) Úloha c-myc ve využití glutaminu v buněčném metabolismu (transkripční faktor, pro-onkogen, regulátor proliferace buněk) Patologie v souvislosti s hypoxií a HIFs - -Ischemie /reperfúse -Tumorigeneze (glykolýza,..) -Choroby krve (EPO, anemie,…) -Metabolické choroby -Vaskulogeneze (VEGF, PDGF) -… - Ischemie / reperfůse Summary of the effects of HiF1α, HiF2α and HiF1β on metabolic disease Akutní hypoxie Bioenergetické sensory – klíčová úloha mitochondrií - AMP (adenosin monofosfát) kinázy, energetický stav buňky (citlivost na poměr AMP:ATP) AMPK reguluje metabolismus i aktivitu iontových kanálů (Towler a Hardie, 2007 ) (Peers et al., 2010) Buněčná úroveň – jednotlivé molekulární mechanismy citlivé ke změnám koncentrace O2 ; Intenzita a význam reakcí je buněčně specifická - ROS (reactive oxygen species), redoxní teorie (Ward, 2008) Biosyntetické sensory - NADPH oxidásy - Hem oxygenása-2 - Cytochrom p-450 monooxygenásy Chronická hypoxie Sensorem jsme zejména prolyl-hydroxylásy => stabilizace / degradace hypoxií indukovaného faktoru (HIF) Příklady otázek Co je hypoxie a jaký je její dopad na buňku a tkáň. Jak buňka reaguje na hypoxii a jak se na ni adaptuje? Na jakých principech je buňkou zaznamenán pokles hladiny dostupného kyslíku? Co se vše podílí na regulaci HIF? Co jsou prolylhydroxylázy a co se podílí na regulaci jejich aktivity?