Metabolismus buněk obecně -Glykolýza -> (b-oxidace FA) -> Krebsův cyklus -> OXPHOS Vždy balancování v rámci potřeb energie x stavebních látek/intermediálních metabolitů x substrátů x stimulů Specifické požadavky buněk -Quiescence – kmenové buňky; udržovací metabolismus, malá spotřeba, malá produkce -Proliferace – aktivované kmenové buňky, progenitory, nádorové buňky,... ; produkce intermediálních metabolitů a anabolismus (syntéza) upřednostněny nad tvorbou energie štepením substrátů (katabolismus) -Práce – myocyty, neurony, epitelie,… ; hlavně produkce ATP (energie) -“Speciality” – erytrocyty, trombocyty, fagocyty, hnědé adipocyty,... ; specifické meziprodukty, ROS/RNS, teplo Metabolismus specifických buněčných typů glykolýza OXPHOS Alternativní Krebsův cyklus Krebsův cyklus glykolýza OXPHOS Alternativní Krebsův cyklus Krebsův cyklus b-oxidace FA glykolýza OXPHOS Krebsův cyklus Alternativní Krebsův cyklus Spící/ quiescentní buňky Ovlivněno: - dostupností substrátů (O2, AA, lipidy, glukóza/glutamin,…) - vnějším řízením (růstové faktory / cytokiny / hormony,…) Glykolýza => tvorba ATP, prekurzory pro pentózový cyklus, intermediální metabolity pro syntézu některých AA, tvorba acetátového zbytku jako substrátu pro Krebsův cyklus, syntézu FA,… Pentózový cyklus => tvorba ribóz/nukleotidů, redukované kofaktory NADP,… b-oxidace FA => tvorba acetylových zbytků jako substrátu pro Krebsův cyklus, redukované kofaktory NAD, FAD,… Krebsův cyklus => redukce kofaktorů NAD a FAD, tvorba ATP, intermediální metabolity pro syntézu AA,... Alternativní (+reversní) Krebsův cyklus => tvorba ATP, intermediálním metabolitů pro syntézu AA, tvorba acetylového zbytku pro syntézu FA, redukované kofaktory NAD a FAD,… OXPHOS => oxidace kofaktorů NADH a FADH2, tvorba ATP,.. Kmenové buňky Somatické adultní kmenové buňky jsou pomalu proliferujicí/quiescentní, často v „hypoxickém“ prostředí -> udržovací metabolismus: - glykolýza = tvorba ATP - pentózový cyklus = tvorba nukleotidů - tvorba AA z glykolýzy a alternativního Krebsova cyklu minimální - silně potlačený OXPHOS, minimum nezralých mitochondrií (hypoxie/HIF1) -Rychle proliferující, potřeba materiál pro buněčné dělení => glykolýza, pentózový + modifikovaný Krebsův cyklus, potlačený OXPHOS -Pro-proliferační transkriptom pod regulací vnějšími factory/faktory ontogeneze*, => mitogenní (FGF, EGF, IGF, Wnt…,), diferenciaci inhibující působky (Notch, LIF..) -Wartburgův efekt, často hypoxické prostředí –> podpora glykolýzy, alternativního Krebsova cyklu -UPC** – regenerace NAD+ pro štěpení substrátů a oxidaci produktů bez produkce ATP. -Podoba s buňkami nádorů - Progenitory, potenciální (aktivované), embryonální (pluripotentí) a somatické embryonální kmenové buňky, obecně nezralé buňky => intenzivně proliferující buňky *Faktory ontogeneze – růstové faktory / morfogeny / cytokiny => regulace osudu buněk **UPC (1,2,3) – uncoupling protein, tvoří póry ve vnitřní membráně mitochondrií pro H+ = inhibice tvorby ATP Rychle proliferující, metabolismus podobný* jak progenitory a proliferující kmenové buňky *Fenotyp není nastaven/regulován faktory ontogeneze, ale: -Změna exprese a/nebo aktivitu modulující mutace příslušných komponent drah transdukce signálu a regulace genové exprese -Změna exprese a/nebo aktivitu modulující mutace příslušných enzymů metabolických drah Nádorové buňky = nezralé buňky Základní rozdíl v energetickém metabolismu u diferencovaných/zralých proti nezralým buňkám Zralé buňky – metabolismus se řídí hlavně dostupností a kapacitou pro využití O2 Nezralé buňky – metabolismus je řízen požadavky na buněčné dělení, proliferaci Zajištění oxidace/redukce kofaktorů A) Quiescentní buňky bez vnějších pro-metabolických stimulů, Nízká úroveň metabolismu, snížený příjem nutrientů (substrátů), častá autofagie, při přístupu O2 jeho využití pro OXPHOS. B) Proliferující buňka pod instrukcí vnějších stimulů (růstové faktory), zvýšený příjem substrátů, Krebsův cyklus hlavně produkce intermediálů pro výstavbu, OXPHOS potlačen Indukce metabolismu vnějšími stimuly (růstové faktory) A) Nepřímo indukcí exprese genů zprostředkovávající příjem a přeměnu substrátů B) Přímo aktivací/translokací transportérů zajišťující přísun substrátů (typicky Insulin x přenašeč glukósy) Onkogení* stimulace příjmu substrátů a syntézy zprostředkované signalizací tyrosinkinázy receptoru růstového faktoru a dráhy PI3K>>Akt(PTEN**)>mTORC1 *Účast prooncogenů / oncogenů **PTEN – Phosphatase and tensin homolog, nádorový supresor Úloha isoforem pyruvát kinázy (PKM1,2) pro buněčnou proliferaci & Watburgův efekt PKM1,2 – pyruvát kináza1,2, koncový krok v glykolýze PKM1 – vysoce aktivní, podpora glykolýzy, velká produkce pyruvátu pro Kreb. cyklus/pro laktát* u zralých, neproliferujících buněk PKM2 – nízká aktivita, zpomalení glykolýzy = nárůst koncentrace intermediálních produktů pro pentózový cyklus a syntézu AA * V závislosti na dostupnosti O2 Exprese a aktivita PKM2 je regulována Vnějšími stimuly a metabolismem mitochondrií Inhibována tyrosin kinásami, ROS, acetylací => Zvýšení příjmu substrátů a zvýšení intermediálů z glykolýzy a Krebsova cyklu pro anabolismus (nukleotidy, AA pro proteiny) A) Isocitrát dehydrogenáza (IDH1,2) –> isocitrát na a-ketoglutarát* B) Mutované, s nádory asociované IDH1 (cytoplasmatická) a IDH2 (mitochondriální) - > a-ketoglutarát na 2-hydroxyglutarát (oncometabolit)** *a-ketoglutarát substrát zde pro enyzmz epigenetických regulací: - TET2 DNA hydroxyláza –> 5-methylcytosine na 5-hydroxymethylcytosine = demethylace CpG -JmjC domény histonových demethylás **2-hydroxyglutarát obecně inhibuje dioxygenázy, zde TET2, JmjC = inhibice změn v genové expresi a diferenciace -asociován i s hypoxickou odovědí a s utilizací glutaminu -v normoxii u zdravých buněk praktiocky nepřítomen Redukční metabolismus glutaminu aktivovaný hypoxií/HIF1 A) Normoxie – glutamin utilizovaný v Krebsově cyklu za tvorby redukovaných kofaktorů a tvorby ATP v OXPHOS + citrát pro syntézu FA, a-ketoglutarát -> sukcinát B) Hypoxie - alternativní dráha Krebsova cyklu, reverzní syntéza citrátu prostřednictvím IDH2 (mitochondriální isocitrát dehydrogenáza 2) ÞPodpora syntézy lipidů u proliferujících buněk z a-ketoglutarát -> citrát (kmenové, progenitory, nádorové) Výše zmíněné procesy jsou spojeny s tzv. WARTBURGOVÝM EFEKTEM => potlačený OXPHOS i za dostatky O2 => „podpora“ glykolýzy, zvýšený příjem glukózy a glutaminu => zvýšený příjem FA* => posílená tvorba intermediálních metabolitů pro syntézy látek potřebných pro buněčnou proliferaci – nukleotidy, FA -> lipidy, AA-> protein => potlačena epigenetické regulace vedoucí ke změně transkriptomu = Inhibice diferenciace * Zvýšená utilizace FA proliferujícícmi nádorvými/kmenovými buňkami - Příjem FA prostřednictvím CD36 (glykoprotein vázající FA) - Tvorba Acetyl-CoA b-oxidací z FA v mitochondriiích - Tvorba citrátu citrát syntázou z Acetyl-CoA CPT1 Karnitin palmitoyltransferáza 1 – vazbou Acetyl-CoA/FA na karnitin, umožnujě jejich transport do mitochondrií Zapojení ostatních tkání v proliferaci buněk Příklady transkripčních faktorů spojených s regulací metabolismu V IV III II I Alosterická regulace laktát dehydrogenázy (LDH) laktát <=> pyruvát na tkáňové úrovni (savci) Fagocyty – fagocytósa/oxidativní vzplanutí -Stimulace fagocytů (protilátky s antigenem, komplement, cytokiny, opsoniny, LPS,…) -Tvorba reaktivních kyslíkových radikálů a oxidů dusíku (likvidace patogenu ve fagosomu) -Nárůst spotřeby O2 -Zvýšení příjmu glukósy (pentózový cyklus) -Utilizace argininu (NO, ONOO) -Zvýšení produkce NADPH (např. pentózový cyklus) -Nárůst spotřeby energie -Zvýšení ochrany proti ROS/NOS – antioxidační mechanismy (metabolismus glutathionu a thiredoxinů) - -Úloha na NADPH závislých oxidáz (NOX1-4, DUOX1,2), fagocyty NOX2 -Úloha NO syntásy (NOS; e-endoteliální, n-neurální, i-indukovaná), fagocyty iNOS http://dl1.cuni.cz/file.php/2953/sacharidy_2/pentosovy_cyklus_souhrn.jpg http://www.biocarta.com/pathfiles/pentosePathway.gif Pentózový cyklus Na NADPH závilá oxidása -Tvorba superoxidu O2- a peroxidu vodíku H2O2 Výběr ROS produktů oxidativního vzplanutí Superoxidový anion - O2- (NOX) Peroxid vodíku - H2O2 (superoxid dismutása) Singletový kyslík - 1O2 (superoxid dismutása) Kyselina chlorna - HOCl (myeloperoxidása) Hydroxylový radikál – OH- Myeloperoxidása - MPO NO syntása – produkce NO -superoxid dismutáza -kataláza -glutathione peroxidáza -… Detoxikace ROS - enzymy GSH GSSG oxidace GSH reduktáza Detoxikace ROS – neenzymatické antioxidanty Glutathion (g-glutamyl-cystinyl-glycine; GSH) Thioredoxiny (Trx1,2,3) a glutaredoxiny (Grx1,2) - malé peptidy s aktivním disulfidovou skupinou) - Trx reduktázy (3): Trx1 a TrxR1 – cytosol, nukleus Trx2 a TrxR2 – mitochondrie - Grx reduktázy (2): Grx2 a GrxR2 – mitochondrie, nukleus 4401830f4 + kys. Askorbova (vit. C) + tocoferol, (vit. E) + kyselina močová +… Erytrocytysavčí - přenos O2 a CO2, zapojení do acidobazické homeostáze Nemají jádro, mitochondrie, endoplasmatické retikulum => Nemají možnost proteosyntézy (120 dnů) a OXPHOS Metabolismus erytrocytu -Glykolýza (ATP) -Pentózový cyklus (regenerace a produkce glutathionu,..) -Metabolismus adenosinu (ATP; aktivace trombocytů) -Rapoport-Leubering cyklus (Rapoport-Leubering shunt) -(Syntéza hemu/porphyrinu – erytroblast/retikulocyt) Metabolické dráhy v erytrocytu AK-adenylátkinasa, HK - hexokinasa, GPI - glukosa-6fosfátisomerasa, PFK - fosfofruktokinasa, GAPDH - glyceraldehyd-3-fosfátdehydrogenasa, PGK - fosfoglycerátkinasa, PGM - fosfoglycerátmutasa, PK -pyruvátkinasa, LDH - laktátdehydrogenasa, TPI - triosafosfátisomerasa, Cb5R - cytochrom-b5-reduktasa, BPGM - bisfosfoglycerámutasa, MPGM - monofosfátglycerátmutasa, GGCS - g-glutamylcysteinsynthetasa, GS - glutathionsynthetasa, GPx - glutathionperoxidasa, GR - glutathionreduktasa, G6PD - glukosa-6-fosfátdehydrogenasa, 6PG - 6-fosfoglukonolakton, ADPRT - adeninfosforibosyltransferasa, ADK - adenosinkinasa, ADA - adenosindeaminasa, 5´N - 5´-nukleotidasa, AK - adenylátkinasa, GSH - redukovaný glutathion, GSSG – oxidovaná forma glutathionu (upraveno dle Kaushansky et al., 2010). Rapoport-Lueberingův cyklus 2,3-B(D)PG – podporuje uvolnění O2 z hemoglobinu - Intenzita syntézy závisí na pH Produkce ATP erytrocytem Myocyty RLC – regulační lehký řetězec ELC – esenciální lehký řetězec Preference produkce ATP => práce, dominuje OXPHOS -Ale různé podmínky / dostupnost zdrojů + různé požadavky -Rychle, silné svaly x pomalé vytrvalé => nastavení metabolických drah – glykolýza x OXPHOS -Nastavení buňky - isoformy myozinů, četnost a zralost mitochondrií +/- mitochondrie – Glykolýzy (rychlost) x OXPHOS (vytrvalost) => nároky na redoxní rovnováhu Různé myoziny – isoformy težkých řetezců – různá sensitivita na hladinu ATP, Ca2+, pH (laktát) + odpovídající isoformy lehkých řetězců - Isoformy těžkých řetězců myosinu u člověka Zastoupení MHC6/7 (a/b) myokardu u potkana a králíka během vývoje MYOKARD Pomalý myokard – dominance MHC-(7)b – vysoká afinita k ATP a k Ca2+, ale pomalejší reakce Rychlý myokard – dominance MHC-(6)a - nízká afinita k ATP a k Ca2+, ale rychlejkší reakce -Specifita druhová: rychlý myokard malí savci, pomalý myokard velcí savci -Specifita lokální: předsíně (rychlý MHC) x komory (pomalý MHC) - V průběhu embryonálního/fetálního vývoje převaha pomalého myokardu, The myosin heavy chain (MHC) region of a silver-stained SDS gel on which were loaded 3 fetal samples of the following: right atrium (RA) at gestational (from left to right) day 87 (fetus 328), day 94 (fetus 323), and day 101 (fetus 321); left atrium (LA) at gestational day 87 (fetus 328), day 94 (fetus 323), and day 108 (fetus 322); right ventricle (RV) at gestational day 87 (fetus 300), day 105 (fetus 289), and day 87 (fetus 328); and left ventricle (LV) at gestational day 82 (fetus 329), day 87 (fetus 328), and day 87 (fetus 300). A set of molecular weight standards (MW St) containing myosin was loaded in the first lane. The MHC region of a silver-stained SDS gel on which were loaded samples of adult left atrium from 2 nonfailing (NF) individuals and 2 individuals with dilated cardiomyopathy (DCM) or ischemic cardiomyopathy (ICM). Reiser et al., 2001 Struktura a mechanismus tepelné produkce hnědou tukovou tkání buněčná ultrastruktura BAT normální tuková tkáň hnědá tuková tkáň FFA – volné mastné kyseliny (free fatty acid) NE – norepinefrin (noradrenalin - buňky dřeně nadledvin) TG – termogenin HSL – hormony aktivovaná lipáza (hormone-sensitive lipase) Hnědé adipocyty (BAT – brown adipose tissue) INDUKTOR katecholaminy / noradrenalin / norepinefrin (stressové mediátory) ZDROJE induktoru - nervová zakončení sympatiku - dřeň nadledvin - makrofágy v tukové tkáni (induktor – IL4 a další cytokiny) Nguyen et al. 2011 Regulace netřesové termogeneze v BAT Trombocyty -Nemají jádro, bez možnosti transkripce -Mají mitochondrie, endoplasmatické retikulum,… -Metabolismus – glykolýza-OXPHOS -Aktivace trombinem, integriny, TXA, serotonin, ADP… => aktivace OXPHOS = produkce ATP => agregace, vylití granulí,… = trombus Modulace OXPHOS Þmodulace aktivity trombocytů Þ Aktivace trombocytů je závislá na indukci jejich OXPHOS metabolismu a produkci ATP Modulace OXPHOS Þmodulace aktivity trombocytů Þ Díky závislosti na OXPHOS, lze aktivaci trombocytů modulovat inhibitory pochodů spřaženými s OXPHOS ROS – podporují koagulaci – nadprodukce ROS = patologická koagulace Příklady otázek Charakterizace energetického metabolismu buňky a preference jednotlivých metabolických drah Metabolismus zralé a nezralé buňky, preference drah a proč. Principy regulace metabolismu zdravé a nádorové buňky. Wartburgův efekt a jeho význam. Úloha glukózy a glutaminu v metabolismu buňky. Co podporuje metabolismus nádorové buňky a jaké jsou důsledky. Specifický metabolismus vybraných buněk, jak a proč.