Cytoskelet •- mikrofilamenta •- intermediární filamenta - během vývoje - vimentin nahrazen neurofilamenty • - klesá exprese nestinu •- mikrotubuly • •- vysoce asymetrický tvar neuronů – nutno hodně cytoskeletu •- i neuron specifické cytoskeletární a cytoskeleton-interagující proteiny • •- dynamický systém – transport • - tvorba a modulace synapsí • - růst a maturace neuritů • - vliv na funkci iontových kanálů • - mechanická podpora • - prostorová organizace buněčných struktur • - ukotvení proteinů, jejich sorting a sekrece • - buněčné signalizace • - role v neuropatologiích • Mikrofilamenta •- průměr 7 nm •- polymerizace aktinu • •G-aktin – solubilní forma •F-aktin – polymerizovaná forma • •„treadmiling“ – na jednom konci vlákna je ATP a na druhém ADP • - k ATP se připojují monomery aktinu a od ADP se odpojují (depolymerizace) • •Neurony – mikrofilamenta v cytoplazmě (hlavně v blízkosti cytoplazmat. membrány) • - hodně v presynaptických i postsynaptických terminálech • - ve vyvíjejících se neuronech dlouhá vlákna ve filopodiích „growth cones“ • Mikrofilamenta •- přestavba mikrofilament - úloha actin binding proteins (ABPs) • •ABPs – aktivita některých ABP regulována Ca2+ signalizací • •Příklady ABP: • •N-WASP + Arp 2/3 – kontrola růstu mikrofilament - důležité pro růst neuritů •VASP/Ena – anti-caping protein – podpora polymerizace aktinu – růst neuritů •Tropomyosin – stabilizace F-aktinu, blokuje interakci s aktin depolymerizujícími faktory • • - bundling a crosslinking proteiny – spektriny – tvorba svazků • - různé v dendritech a různé v axonech • •- synapsiny - časté v presynaptických terminálech • - fosforylace CaMK • - schopnost vázat synaptické váčky k mikrofilamentům • - fosforylace ← akční potenciál → uvolněni váčků a jejich transport k membráně • •- ukotvení F-aktinu k membráně – ankyriny, vinculin, … 002.jpg Mikrofilamenta a synapse •- v synaptických terminálech hlavně aktin – jeho přestavby ovlivňují sílu synapsí • •Mikrofilamenta - tvorba, eliminace, stabilita, změny tvaru a velikosti synapsí • - organizace PSD, ukotvení PSD proteinů, lokalizace translace • - hlavní cytoskelet v synapsích • •LTP – zvyšuje poměr F-aktinu vůči G-aktinu •LTD – naopak • -velká dynamika, větvení v synapsích • - úloha řady ABPs - -Dynamika – ovlivňována signalizacemi • (NMDAR, AMPAR, G-proteiny, RTKs) - - • • Mikrofilamenta a synapse •LTP: • •Arc – akumulace v dendritech v blízkosti synapsí (i jeho mRNA v dendritech u aktivních synapsí) • - link mezi stimulací synapse a proteosyntézou/přestavbou synapse • - regulace endocytózy AMPAR • - KO – problémy s pozdní fází LTP a dlouhodobou pamětí u myší – konsolidace LTP • • - exprese Arc – vede k expanzi F-aktinu – přestavba synapse – dlouhodobá paměť • • • - inhibice polymerizace aktinu – blokuje LTP udržení (dlouhodobou paměť) • • • • • • Intermediární filamenta •- rodina proteinů se strukturou head-rod-tail, průměr 10 nm • •- specifická exprese v buňkách určitého typu a v určitém stádiu diferenciace ch11f31 Intermediární filamenta 003.jpg Intermediární filamenta •Neuroblasty – exprimují vimentin, který během diferenciace nahrazen neurofilamenty • •- některé vyvíjející se neurony - alpha-internexin, peripherin, většina nestin • -neurofilamenta hodně v axonech (více než jiný typ cytoskeletu) -množství neurofilament – vliv na průměr axonu a rychlost vedení vzruchu • - fosforylace neurofilament spojená s myelinizací - •IF III - dynamická struktura – regulace fosforylací, fosforylace ovlivňuje i jejich stabilitu • •IF IV – dynamika menší – ještě zmenšená po maturaci axonů (tam naopak značná stabilita) • - fosforylace ovlivňuje i jejich transport a citlivost k proteázám (calpain) • •KO myši v NF-M – axony s menším průměrem (NF regulují radiální růst axonů) • - snížení konduktivity axonů • - s věkem progresivní atrofie axonů motorických neuronů v míše • • – neurofilamenta důležitá pro strukturní integritu některých axonů při stárnutí • Mikrotubuly •- průměr 25 nm •- heterodimer z alpha a beta-tubulinu •- polarizace (plus a minus end) • •savci – vice izoforem pro alfa beta-tubulin (některé neuron-specifické) • •- četné posttranslační modifikace – acetylace, fosforylace, polyglutaminace, … • •sGTP-tubulin - klesne li jeho hladina na konci mikrotubulu → rychlá depolymerizace • - zvýší-li se hladina → polymerizace = „dynamická nestabilita“ • •Treadmiling – polymerizace na + konci a depolymerizace na - konci • •- svazky v cytoplazmě neuronů • -jsou klíčové pro morfologii neuronů - látky depolymerizujicí mikrotubuly – axony a dendrity se stáhnou do těla neuronů - -Inhibitory polymerizace – inhibice růstu neuritů - -Stabilizace mikrotubulů (taxol) – indukce vzniku axon(ů) - -Větvení neuritů - -Transport látek (obousměrný) • Mikrotubuly •Microtubules-binding proteins • •– proteiny podporující sestavovaní a stabilizaci mikrotubulů • • MAP proteiny - regulace fosforylací • • MAP1B – exprese během diferenciace neuronů a růstu axonů, pak mnohem méně • - KO myš embryonální letalita • - snížená exprese u myší – poruchy ve vývoji NS • • MAP2 – více izoforem • - vysokomolekulární forma pouze v dendritech (selektivní transport mRNA) • • tau – nízkomolekulární forma jen v CNS, vysokomolekulární v periferní NS • - převážně v axonech, podélná stabilizace mikrotubulů • - hyperfosforylace v některých patologiích • • DCX a LIS1 – mutace – poruchy migrace neuronů • • • 005.jpg Mikrotubuly -molekulární motory – mikrotubuly-aktivované ATPázy - kinesiny, dyneiny - -proteiny ukotvující mikrotubuly k membráně – role při klustrování GABAC receptorů - -vazba signálních proteinů – kinázy, fosfatázy, G-proteiny - -u neuronů i signalizace na dlouhou vzdálenost • • •- složky cytoskeletu jsou navzájem propojené – dynamická síť • Cytoskelet a polarita neuronů • •Axony – mikrotubuly plus koncem k terminálu •Dendrity – smíšená polarita (hlavně v proximální části) 006.jpg Transport proteinů v neuronech -často na velké vzdálenosti – tělo neuronu – 50 um • - nejdelší axony – i více než 1 m • -porucha transportu a jeho regulace → choroby - Výsledek obrázku pro cellular transport neuron disease Cytoskelet a neurodegenerativní choroby •aberantní akumulace některých cytoskeletárních proteinů • •porucha cytoskeletu – poruchy transportu, signalizací • - mitochondriální dysfunkce, oxidativní stres, až smrt neuronů - •Tautopatie – heterogenní skupina demencí • - depozity tau bez depozitů beta-amyloidu (oboje je Alzheimer) • - neurodegenerace • - i mutace v tau genu – konformační změna • - změny ve fosforylaci - •Amyotropická laterální skleróza (ALS) • - degenerace motorických neuronů – paralýza • - abnormální akumulace neurofilament - •Charcot-Marie-Tooth disease 2 (CMT2) – mutace NF-L, mutace v KIF1Bbeta • - porucha axonového transportu - neurodegenerace Transport proteinů v neuronech • •Regulace na úrovni ER • •- receptory a iontové kanály – složeny z podjednotek – některé kombinace podjednotek zůstávají v ER – např. GABA receptory (pentamer ze 16 možných podjednotek) –165 možných kombinací, v buňce jen 20-30 kombinací, některé kombinace zadržovány v ER • •- ER chaperony – interakce s hydrofobními doménami proteinů (normálně nejsou na povrchu) → zadržení v ER → oprava nebo degradace • •- proteiny mohou nést ER retenční signály – (RxR signál) – dostupnost regulována fosforylací nebo může být zamaskován vazbou správné podjednotky • •- proteiny mohou nést také ER exportní signály (dileucine, diphenylalanine ….) • • - mutace těchto signálů – transport/retence z/v ER • Transport proteinů v neuronech • Polarita • • • vývoj - růst neuritu nepolarizovaného neuronu (neurity mají axonové i dendritické markery), • - následná exprese specifických markerů • • •- dendrity a axony vykonávají různé funkce – různé proteiny • • •- pro vývoj polarity důležitá AIS (axonal initial segment) bariéra • - aktinová síť (+ spectrin a ankyrin), vysoká koncentrace proteinů • - snížená rozpustnost, snížená prostupnost pro proteiny • - narušení aktinové sítě – ztráta schopnosti selektovat transport • - pokusy s dextranem – jen molekuly o určité velikosti projdou do axonů • protein_targeting-2.jpg •Transport proteinů po síti mikrotubulů • - v dendritech obousměrné (plus i minus konce) • - v axonech plus konec směrem ke konci – i jen několik málo opačně • orientovaných vláken mikrotubulů – množství se liší ve vývoji, plasticitě … • - pokud váček s proteiny se naváže na dynein (motor směřující k minus konci) • - transport do dendritu • - vazba na kinesin – do dendritu i do axonu • • • • • • • • • • • • • • • • • • •Signály pro polaritu (specifické i nespecifické) • – axonal exclusion a axonal targeting signály • - dileucinové signály, YxxO, NPxY – sortrování do specifických váčků – ty asociace s • určitým typem molekulárního motoru • - palmitoylace, navázání AP1 clathrin komplexu, interakce s lipidy • - někdy stejný signál a u různých proteinů různá lokalizace - důležitá i kombinace signálů • - kromě signálů pro transport i signály pro endocytózu (některé typy Na kanálů) a docking • •Specifické transportní proteiny • •- specifické transportní proteiny receptorů pro neurotransmitery (GABA, NMDA a AMPA) • •- GABA receptor-associated protein – interaguje s γ2 podjednotkou GABA a tubulinem – role při sortrování GABA receptoru do transportních váčků → transport po mikrotubulech • • - proteinové interakce - homer proteiny – homer 1b+mGluR5 do dendritů • homer 1a+mGluR5 do axonů i dendritů • • Transport mRNA v neuronech •mRNA targeting – ekonomičnost proti protein targetingu • – z 1 molekuly mRNA mnoho molekul proteinu • • v tělu neuronů asi 10000 mRNA x v dendritech jen 400 • •- v dendritech (i axonech) ribozomy a lokální proteosyntéza • •- existence specifických adaptorových proteinů – napojení mRNA na molekulární motory (ribonucleoprotein particles RNPs – až 42 proteinů) • •- regulační nekodující sekvence mRNA důležité pro targeting (5´ i 3´ konec) • •Trans-acting factors (TAF) – pr. Staufen, FMRP, ZBP1 proteiny – vazba na mRNA i na motory (kinesiny, myosiny) • •Transport – CamKII, Arc, beta-actin, MAP2 … • • •Možnost dodáni mRNA i trans-endocytózou z gliových buněk • Transport proteinů v neuronech •Transport axonem • •rychlý (20-40 cm/den) – velké sekretorické váčky (neuropeptidy), membránové proteiny • - podél mikrotubulů – kinesiny (k plus konci) • - dyneiny (k minus konci) • - podél aktinu – myosiny • •střední (5-10 mm/den) – mitochondrie podél mikrotubulů • •pomalý (1-8 mm/den) – transport složek cytoskeletu, malé sekretorické váčky • - typu A (do 1 mm za den) – neurofilamenta a mikrotubuly • - typu B (2-8 mm za den) – mikrotubuly a mikrofilamenta • - cytoskeleton-asociované proteiny • - pohyb složek NF – kinesiny • - regulace jejich fosforylací • - cykly – rychlý pohyb a pak pauza • •zpětný transport – materiál endocytovaný ze synaptické štěrbiny, růstové faktory … • -některé organely – bidirectional transport • (mitochondrie, sekretor. váčky …) Molekulární motory •ATPázy – mikrotubuly – kinesiny, dyneiny • - mikrofilamenta – myosiny • •Kinesiny – pohyb od minus konce k plus konci • - 45 genů v lidském genomu (Kinesin superfamily proteins) – 38 exprimováno v mozku • - liší se ve tom co schopny přepravovat (KIF5B – lysosomy, mitochondrie) • KIF1A – prekursory synapt. váčků • • - některé kinesiny jen do dendritů (DN KIF5 – neurony s více axony) • • - specifitu ovlivňují i „linking“ proteiny • kinesin I – s JIP proteiny – váčky s LDL receptory • s APP – váčky s beta-sekretázou, presenilinem, • synapsinem • Molekulární motory •Dyneiny – od plus k minus konci mikrotubulů • - specifita přenosu dána s dyneinem-asociovanými polypeptidy • (ARP1 – interakce se spektrinem – transport synaptických. váčků) • • - důležitý ve vývoji NS – migrace neuronů a axon pathfinding