Funkční analýza NS Elektrofyziologické metody - rychlost - celá řada metod měření proudu, napětí, potenciálů – využití mikroelektrod a) Intracelulární měření – měří se jediná buňka, i malé změny potenciálu b) Extracelulární měření – single unit recording (měří se jedna buňka) - multi-unit recording (měří se skupina buněk najednou) - EEG Intracelulární měření Intracelulární měření Metoda vnuceného napětí (voltage clamp technique) obvykle 2 mikroelektrody – intracelulární snímá membránové napětí proti extracelulární - buňku vystavíme konstantnímu napětí a toto napětí udržujeme - měříme velikost/četnost proudů v závislosti na nastaveném konstantním napětí Intracelulární měření Metoda vnuceného proudu (current clamp technique) 2 mikroelektrody – intracelulární a referenční extracelulární - buňku stimulujeme různými pulsy proudu – měříme její odpověď - měříme změny membránového napětí - měření spontánní a indukované aktivity Patch clamp technique = technika terčíkového zámku - umožňuje měření proudů vyvolaných aktivací iontových kanálů - umožňuje snímání celé buňky i jediného iontového kanálu v izolovaném terčíku - k buněčné membráně je přisáta elektroda (mikropipeta) - pevné spojení s vysokým odporem - během měření lze měnit složení roztoku v okolí buňky a sledovat kinetiku iontových kanálů. - antibiotiky indukované póry - posun po membráně a měření více míst - projdou pouze malé monovalentní ionty nižší sací síla - - vyšší sací síla Sharp electrode technique - malý průměr elektrody - intracelulární měření - minimální výměna iontů mezi elektrodou a vnitřním prostředím buňky (minimální vliv elektrolytu v elektrodě) Extracelulární měření Single unit recording - mikroelektroda (skleněná, kovová) zavedená do mozku - rozlišení na 1 neuron – monitorování aktivity 1 neuronu Multi unit recording – větší elektroda nebo systém více elektrod Funkční analýza NS • EEG • záznam časové změny elektrického potenciálu způsobeného mozkovou aktivitou • tento záznam je pořízen elektroencefalografem • neinvazivní metoda funkčního vyšetření elektrické aktivity CNS • Sumační signály z neuronů jsou snímány elektrodami z povrchu skalpu • EEG signál vzniká jako důsledek sumace aktivity extrémně vysokého množství neuronů Optogenetika v neurobiologii • využití světla/laserů pro stimulaci neuronů a) exprese iontových kanálů aktivovaných/inhibovaných světlem - modulace aktivity určité skupiny neuronů (GMO, promotory, inducibilita …) - channelrhodopsiny (Na+, H+) - halorhodopsiny (Cl-) - archaerhodopsin (inverzně H+) - bacteriorhodopsin - rychlost, přesnost Optogenetika v neurobiologii https://www.addgene.org/optogenetics/guide/ b) exprese optogenetických senzorů pro – neurotransmitery, ionty, membránové napětí … Ca2+ - single proteiny Optogenetika v neurobiologii Optogenetika v neurobiologii Ca2+ - dva proteiny (FRET) Optogenetika v neurobiologii Ca2+ - bioluminiscence Měření aktivity neuronů pomocí fluoroforů (chemických senzorů) Neinvazivní • In vitro – tkáňové kultury, řezy mozku, buněčné kultury … • In vivo – zvířecí modely Měření aktivity neuronů pomocí fluoroforů (chemických senzorů) – fluorofory citlivé na změny napětí, koncentrace iontů… Aplikace flouroforu - mikroinjekcí (jsou-li buňky dost velké) - ve formě esterů (ester loading) Fluorofory obvykle nepřecházejí přes membránu – hodně nabité převážně na karboxylových skupinách – jejich esterifikací vzniká nenabitá sloučenina, může se dostat do buňky a tam je aktivována esterázami – trošku problém pak je že indikátor se dostane všude do buňky, v různých částech různě aktivní esterázy a tedy různé množství aktivní latky - lze dlouhodobé monitorování změn v reálném čase Funkční analýza NS Functional brain imaging – neinvazivní, simultánní měření více struktur najednou CT (počítačová tomografie) – rentgenový paprsek, detektor, rotace, až 3D - vysoká rozlišovací schopnost - rozdíl mezi vstupní a výstupní intenzitou záření Funkční analýza NS PET – pozitronová emisní tomografie - využívá pozitronových zářičů a detektoru záření - positrony-emitující isotop (např. v glukóze) do krve – akumulace v metabolicky aktivních místech - hodnocení - regionálního metabolizmu - prokrvení mozku jako ukazatele neuronální aktivity - účinek psychofarmak in vivo - detekce malých funkčních abnormalit mozku u psychických poruch Funkční analýza NS SPECT – single-photon emission computerized tomography - opět injekce nebo ihnalace radioaktivního izotopu a detekce gamma-záření - izotopem je zde zdroj gamma-zaření Funkční analýza NS MRI – magnetická rezonance - působení vysokofrekvenčního magnetického pole na atomová jádra (protony a neutrony) - osa otáčení (spin) se podle magnetického pole orientuje – paralelně a antiparalelně - po odpojení vysokofrekvenčního magnetického pole – jádro se vrací do klidové polohy - používá se více magnetických polí s různou orientací a frekvencemi - při určité frekvenci působení určité atomy poskytují rezonanční signál (radiofrekvenční energie) – klasicky pro vodík 42,58 MHz (pro indukci 1 Tesla) - rozdílná intenzita signálů u různých tkání Funkční analýza NS Funkční MRI (fMRI) oxyhemoglobin/deoxyhemoglobin – MRI rozliší zda hemoglobin má navázaný kyslík – podle toho ovlivní rezonanční signál vodíkových jader v blízkosti - aktivace určité části mozku speciálním úkolem – určitá část mozku potřebuje více kyslíku, zvýší se průtok krve k ní, změna v rezonančním signálu – nepřímé sledování mozkové aktivity Funkční analýza NS Magnetoencefalografie - mapování mozkové aktivity pomocí citlivých magnetometrů - elektrická aktivita neuronů vede i ke vzniku malého magnetického pole - pro měření nutné stínění od okolí