Molekulární genetika člověka, PřF MU 20241 Genetika onemocnění s komplexní dědičností doc. RNDr. Petra Bořilová Linhartová, Ph.D., MBA RECETOX, SCI MUNI ̶ charakteristika komplexních nemocí – příklady ̶ problematika studia komplexních chorob ̶ základy genetiky komplexních chorob – modely ̶ design genetických studií – statistická analýza ̶ metody molekulární genetiky při studiu těchto chorob Obsah Komplexní choroby Genetika onemocnění s komplexní dědičností2 ̶ multifaktoriální, často polygenní ̶ roli hrají interakce různých vlivů: • genetických, • epigenetických, • behaviorálních, • psychosociálních a • environmentálních podílejících se na výsledném stavu – vzniku, rozvoji a průběhu onemocnění Charakteristika Komplexní choroby Genetika onemocnění s komplexní dědičností3 Charakteristika Komplexní choroby Genetika onemocnění s komplexní dědičností4 geny další faktory Monogenní Komplexní Nemoci způsobené zevními vlivy ̶ pokud choroba má prokazatelně familiární výskyt, musíme očekávat podíl genetického podkladu na její manifestaci ̶ epidemiologickou charakteristikou komplexních chorob je statistická kumulace v rodinách ̶ fenotyp nevykazuje klasickou mendelistickou dominantní či recesivní dědičnost jako důsledek změn v jediném lokusu (tzv. jednolokusových) ̶ predisponující „geny” zvyšují pravděpodobnost onemocnění, ale nedeterminuje jednoznačně jeho přítomnost • je nutné spolupůsobení negenetických faktorů (prostředí) = dieta, fyzická aktivita, kouření, …. • a interakce genů mezi sebou ̶ stojí na vrcholu pomyslné pyramidy složitosti celé genetiky Charakteristika Komplexní choroby Genetika onemocnění s komplexní dědičností5 ̶ dědičný znak nebo postižení, které buďto je nebo není přítomno ⇒ diskrétní (kvalitativní) znak ̶ měřitelné vlastnosti (fyziologické nebo biochemické veličiny – TK, výška, hladina cholesterolu, BMI) ⇒ kvantitativní znaky ̶ pochopení dědičné podstaty variability kvantitativních znaků je základem pro porozumění tomu, jak se geny podílejí na vzniku komplexních nemocí Charakteristika Komplexní choroby Genetika onemocnění s komplexní dědičností6 • diabetes • esenciální hypertenze • dyslipidémie • alergie • obezita – hypotéza typu „thrifty genotype“ oselekce alel, které favorizují přírůstek váhy a skladování tuků Příklady Komplexní choroby Genetika onemocnění s komplexní dědičností7 ̶ neúplná penetrance patologického fenotypu • u určité části osob, přestože zdědí nevýhodný genotyp (zde ve smyslu souboru vícero genů) se patologický fenotyp nerozvine ̶ imprinting • modifikace maternálních a paternálních genů během gametogeneze tak, že mají odlišnou expresi v zygotě • většinou pouze maternální nebo paternální alela daného genu je exprimována, druhá je utlumena Problematika studia komplexních chorob Komplexní choroby Genetika onemocnění s komplexní dědičností8 ̶ spolupůsobením dalších mechanizmů přenosu • mitochondriální dědičnost ̶ existence fenokopií • patologický fenotyp může být přítomen u lidí, kteří nejsou nosiči zmíněného genotypu • navozeno vnějšími faktory - např. kortikoidy indukovaný DM ̶ genetická heterogenita klinický obraz není specifický, ale může se rozvinout v důsledku záměn: • v genech ležících na různých lokusech (= lokusová heterogenita) • v jednotlivých genech může být přitom vícero mutací či polymorfizmů (= alelická heterogenita) Problematika studia komplexních chorob Komplexní choroby Genetika onemocnění s komplexní dědičností9 ̶ genetická heterogenita Problematika studia komplexních chorob Komplexní choroby Genetika onemocnění s komplexní dědičností10 https://www.researchgate.net/figure/47812495_fig3_Figure-3-Genetic-and- allelic-heterogeneitya-Genetic-heterogeneity-When-alternative ̶ vysokou populační frekvencí alel zodpovědných za rozvoj patologického fenotypu • každá jednotlivá predisponující alela pravděpodobně není sama o sobě výrazně patogenní ̶ polygenní dědičností • predispozice k rozvoji patologického fenotypu se zvyšuje pouze při simultánním výskytu určitého souboru alel - více faktorů - tzv. „malé“ faktory Problematika studia komplexních chorob Komplexní choroby Genetika onemocnění s komplexní dědičností11 ̶ jev, kdy jeden gen ovlivní organizmus mnoha způsoby se nazývá pleiotropie Problematika studia komplexních chorob Komplexní choroby Genetika onemocnění s komplexní dědičností12 http://www.grossmont.edu/people/bo nnie-yoshida-levine/online- lectures/genetics-mendel.aspx ̶ frekvence různých typů dědičných onemocnění Základy genetiky komplexních stavů Komplexní choroby Genetika onemocnění s komplexní dědičností13 Typ dědičnosti chorob Incidence při narození (na 1000) Prevalence ve věku 25 let (na 1000) Prevalence v populaci (na 1000) genomové a chromozomové mutace 6 1,8 3,8 monogenní mutace 10 3,6 20 multifaktoriální ~ 50 ~ 50 ~ 600 ̶ 1918 R. A. Fisher - polygenní model Základy genetiky komplexních stavů – modely Komplexní choroby Genetika onemocnění s komplexní dědičností15 ̶ v polovině 60. let přišel s tzv. prahovým modelem D.S. Falconer (limitní počet recesivních alel způsobí vznik onemocnění) Základy genetiky komplexních stavů – modely Komplexní choroby Genetika onemocnění s komplexní dědičností16 ̶ prahový model s pohlavně rozdílným prahem Základy genetiky komplexních stavů – modely Komplexní choroby Genetika onemocnění s komplexní dědičností17 ̶ současný model ̶ se od těch klasických v několika ohledech dost zásadně liší • je jasné, že genotypová složka komplexních znaků není tak rozsáhlá, jak se předpokládalo (nezahrnuje stovky, max. desítky genů) • genotypová složka není homogenní ve smyslu rozsahu účinku jednotlivých genů (zahrnuje geny jak relativně velkého, tak i malého a středního účinku) • vzájemný vztah jednotlivých predisponujících genů není v žádném případě uniformně aditivní  vyjádřeno multiplikativním modelem Základy genetiky komplexních stavů – modely Komplexní choroby Genetika onemocnění s komplexní dědičností18 ̶ multiplikativní model ̶ souhrnný účinek predisponujících genů je roven součinu jejich dílčích účinků (interakční efekty) ̶ uvažuje existenci dvou a více rizikových lokusů, kdy dispozice k nemoci je zvýšena při současném působení obou či více rizikových genotypů Základy genetiky komplexních stavů – modely Komplexní choroby Genetika onemocnění s komplexní dědičností19 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC138948/ ̶ Podklady pro hledání genetické determinace • Zvýšený výskyt v rodinách • Zvýšená incidence u dvojčat: MZ > DZ • Dědičnost intermediárních fenotypů oneúplná dominance (heterozygot je intermediárním fenotypem) omezi nejčastěji používané intermediární fenotypy patří profily genové exprese (transkriptom), variabilita v množství proteinů (proteom), metabolitů (metabolom), atd. Základy genetiky komplexních stavů Komplexní choroby Genetika onemocnění s komplexní dědičností20 ̶ Familiární výskyt nemocí – Familiární agregace • je charakteristikou komplexních nemocí, protože příbuzní sdílejí větší podíl genů navzájem mezi sebou než s nepříbuznými osobami • obráceně to platit nemusí – FA neznamená, že se na chorobě musí podílet dědičnost ⇒ rodina nesdílí jenom stejné geny, ale i vnější prostředí, kulturní návyky, vzorce chování apod. • nutno posoudit podíl genetických a negenetických faktorů Základy genetiky komplexních stavů Komplexní choroby Genetika onemocnění s komplexní dědičností21 ̶ Familiární výskyt nemocí • měří se relativní riziko  (R) – vyjadřuje, kolikrát vyšší pravděpodobnosti onemocnění čelí definovaný příbuzný nemocného jedince ve srovnání s obecným rizikem populace prevalence nemoci u příbuzných „r“ postižené osoby R = -------------------------------------------------------------------------------------- prevalence nemoci v populaci • r – znamená obecně příbuzný („relative“), v praxi se měří např. λs („sibs“), λp („parents“) • čím vyšší je hodnota , tím snazší je genetická analýza daného komplexního znaku Základy genetiky komplexních stavů Komplexní choroby Genetika onemocnění s komplexní dědičností22 ̶ Familiární výskyt nemocí • definovaný příbuzný – 1. stupně (dítě, rodič, sourozenec - S) Např. u DM 1. typu - =15 u DM 2. typu - =3,5 u astmatu - =3,5 u cystické fibrózy má  kolem 500 • hlavní příčiny rozptylu hodnot  mezi jednotlivými chorobami nejsou v absolutní velikosti geneticky podmíněného rizika, ale v obecné populační zátěži, která např. u DM 1. typu činí 0,4 %, u 2. typu 6-7 % (ve věku 80 let je kumulativní riziko kolem 17 %) Základy genetiky komplexních stavů Komplexní choroby Genetika onemocnění s komplexní dědičností23 ̶ Konkordance a diskordance • mají-li 2 příbuzní jedinci v rodině stejnou nemoc – konkordantní • je-li jeden postižený a druhý ne – diskordantní ⇒ lze vysvětlit vlivem dalších faktorů nutných k nastartování patologického procesu • naopak – konkordantní fenotyp může vzniknout i při rozdílných predisponujících genotypech ⇒ nemoc u jednoho z nich je genokopií nebo fenokopií druhého Základy genetiky komplexních stavů Komplexní choroby Genetika onemocnění s komplexní dědičností24 ̶ Konkordance a sdílení alel mezi příbuznými • čím blíže jsou si 2 rodinní příslušníci, tím více alel zděděných od společných předků mají totožných • pokud geny přispívají ke vzniku onemocnění významně, stoupá konkordance pro dané onemocnění s rostoucím stupněm příbuznosti oextrémní případ: MZ dvojčata opříbuzní 1. řádu: rodič + dítě (společná 1 alela s každým z rodičů) opár sourozenců vč. fraternálních (DZ) (25% má stejnou dvojici alel nebo žádnou alelu, 50% má stejnou 1 alelu) 0,25 (2 alely) + 0,5 (1 alela) + 0,25 (0 alel) = 1 alela Základy genetiky komplexních stavů Komplexní choroby Genetika onemocnění s komplexní dědičností25 ̶ Pokud tedy geny k nemoci predisponují, lze očekávat, že λr bude nejvyšší pro MZ dvojčata, nižší pro příbuzné 1. stupně a dále klesá úměrně počtu sdílených alel Základy genetiky komplexních stavů Komplexní choroby Genetika onemocnění s komplexní dědičností26 ̶ Podíly relativního rizika λr příbuzných probandů s vybraným onemocněním • hodnota λr = 1 znamená, že příbuzný nemá větší pravděpodobnost vzniku nemoci než kterýkoliv jedinec v populaci Základy genetiky komplexních stavů Komplexní choroby Genetika onemocnění s komplexní dědičností27 http://www.the-scientist.com/?articles.view/articleNo/15199/title/The-Infection-Connection-in-Schizophrenia/ ̶ Studie dvojčat • „experiment přírody na lidech“ • základním přístupem je tradičně stanovení stupně fenotypové shody u MZ a DZ dvojčat → minimalizace relativních vlivů zevního prostředí • čím vyšší je fenotypová shoda MZ oproti DZ dvojčatům, tím vyšší je relativní genetický příspěvek studovaného komplexního znaku • výhody: umožňují abstrahovat od variability prostředí Základy genetiky komplexních stavů Komplexní choroby Genetika onemocnění s komplexní dědičností28 ̶ Studie dvojčat • omezení: oMZ dvojčata i přes totožný genotyp nemají stejnou genovou expresi (např. náhodná Xinaktivace u žen) ove skupinách lymfocytů se MZ budou lišit díky somatickým chromozomálním přestavbám v lokusech pro Ig a T-buněčný receptor onitroděložní prostředí nemusí být pro obě stejné oexpozice faktorům zevního prostředí nemusí být stejná (zejména u chorob s pozdní manifestací) Základy genetiky komplexních stavů Komplexní choroby Genetika onemocnění s komplexní dědičností29 ̶ Porovnání konkordance u MZ a DZ dvojčat • vyšší konkordance u MZ dvojčat oproti DZ dvojčatům je silným argumentem pro přítomnost genetických faktorů (zejména u onemocnění s časným výskytem) Základy genetiky komplexních stavů Komplexní choroby Genetika onemocnění s komplexní dědičností30 ̶ Heritabilita (H2) • je definována jako relativní podíl variability podmíněné geneticky na celkové variabilitě znaku H2 = VG/VP • variabilita fenotypu (VP) = genetická variabilita (VG) + variabilita zevních faktorů (VE) • čím je vyšší a blíží se jedné, tím vyšší je obecný příspěvek genetické složky ve fenotypu • nejjednodušší způsob odhadu znaku H2 je  dvojnásobek rozdílu korelačního koeficientu MZ a DZ dvojčat Základy genetiky komplexních stavů Komplexní choroby Genetika onemocnění s komplexní dědičností31 ̶ Odhad heritability 1. pomocí rozptylu F1 a F2 generací rozptyl u F1 – rozptyl u F2 H2 = -------------------------------------------------------------- rozptyl F2 ̶ je-li variabilita znaku určena zejména prostředím, je rozptyl u F2 blízký rozptylu u F1 a čitatel, a tím i hodnota H2, se bude blížit 0 ̶ pokud je variabilita dána pouze genetickým složením, rozptyl u F1 je nulový a H2 je rovna 1 Základy genetiky komplexních stavů Komplexní choroby Genetika onemocnění s komplexní dědičností32 ̶ Odhad heritability 2. pomocí sledování inbredního kmene pokusných zvířat 3. ze studií dvojčat ̶ dle Holzingerova indexu heritability (H) relativní zastoupení konkordantních párů ve skupině MZ dvojčat – DZ H = --------------------------------------------------------------------------------------------------- 1 – relativní zastoupení konkordantních párů ve skupině DZ dvojčat Základy genetiky komplexních stavů Komplexní choroby Genetika onemocnění s komplexní dědičností33 ̶ Heritabilita běžných komplexních nemocí (znaků) Základy genetiky komplexních stavů Komplexní choroby Genetika onemocnění s komplexní dědičností34 ̶ Genetická analýza komplexních nemocí • důležité je definovat studovaný fenotyp komplexní choroby  konglomerát fenotypů nižších úrovní  intermediární fenotypy • vágní stanovení fenotypu  komplikace při porovnávání různých nezávislých studií Základy genetiky komplexních stavů Komplexní choroby Genetika onemocnění s komplexní dědičností35 ̶ Genetická analýza komplexních nemocí • má vždy statistický charakter  zdědění jednotlivé patologické alely není ani nezbytné, ani dostatečné pro manifestaci komplexního fenotypu FENOTYP = ZEVNÍ FAKTORY + GENETICKÉ FAKTORY • dosud se nepodařilo charakterizovat žádnou komplexní polygenní chorobu ve formě úplného souboru „patologických“ alel a jejich interakcí (navzájem a se zevními faktory) Základy genetiky komplexních stavů Komplexní choroby Genetika onemocnění s komplexní dědičností36 ̶ Genetická analýza komplexních nemocí – fáze studia: • formulace hypotézy • selekce kandidátních genů os intermediárním fenotypem os klinickou manifestací nemoci os klinickou závažností nemoci os odpovídavostí nemoci na léčbu • studium FA (studie na dvojčatech) • asociační studie (case-control studie) Design genetických studií Komplexní choroby Genetika onemocnění s komplexní dědičností37 ̶ Genetická analýza komplexních nemocí – fáze studia: • tvorba modelu dědičnosti • hledání oblasti, kde se gen nachází (vazebná nerovnováha, haplotypy) • analýza struktury a fce genu • odhad frekvence různých mutací a zhodnotí se rizikovost každé z nich, a to v kombinaci s dalšími faktory, například věk nebo prostředí • určení míry asociace – statisticky významná závislost dvou proměnných. Sílu asociace zjišťujeme pomocí statistického testu, např. t-testu, chí-kvadrát test, analýzou variance nebo mnohočetnými lineárními nebo logistickými regresemi. Design genetických studií Komplexní choroby Genetika onemocnění s komplexní dědičností38 ̶ Metodologie genetického výzkumu komplexních nemocí Design genetických studií Komplexní choroby Genetika onemocnění s komplexní dědičností39 ̶ Genetické studie • strategie výběru tzv. kandidátních genů ojednodušší u mendelisticky děděných nemocí • studie na modelových organizmech • studie na lidech (jednotlivci, rodiny, populace) Design genetických studií Komplexní choroby Genetika onemocnění s komplexní dědičností40 ̶ Studie na modelových organizmech • identifikace genetických determinant komplexních onemocnění u experimentálních modelů • vycházíme ze dvou inbredních kmenů (potkana, myši), tedy takových kmenů, kde všichni jedinci (téhož pohlaví) každého z kmenů jsou geneticky identičtí • tyto dva parentální kmeny se liší ve zkoumaném znaku - např. hypertenzní kmen vs. normotenzní kmen • pokud jedince těchto dvou kmenů navzájem křížíme, jejich potomstvo (F1) je heterozygotní v rozsahu celého genomu Design genetických studií Komplexní choroby Genetika onemocnění s komplexní dědičností41 ̶ Studie na modelových organizmech • dále postupujeme přes zpětné křížení (F1 s P) nebo křížíme navzájem dvojice F1 a získáme populaci druhé filiální generace (F2, zpravidla několik set jedinců) • nejčastěji se používá sada několika set tzv. mikrosatelitních markerů, které jsou rovnoměrně rozmístěny po celém genomu • u každého jedince F2 zjistíme, jestli zdědil obě alely daného markeru od jednoho či druhého progenitora (parentálního kmene), příp. jestli má po jedné alele od každého a je tedy pro daný úsek genomu heterozygotní (u zpětného křížení samozřejmě připadá v úvahu jen jeden typ homozygota nebo heterozygotní stav) Design genetických studií Komplexní choroby Genetika onemocnění s komplexní dědičností42 ̶ Studie na modelových organizmech • za pomoci specializovaného softwaru zkoumáme, jestli některé alely nejsou výrazně předávány potomkům současně s dispozicí pro vysoké nebo naopak nízké hodnoty sledovaného kvantitativního znaku • nejjednodušší variantou je porovnání hodnot • např. inzulinémie - mezi skupinami rozdělenými podle genotypu postupně v každém markeru Design genetických studií Komplexní choroby Genetika onemocnění s komplexní dědičností43 ̶ Studie na modelových organizmech • "marker regression„ - pokud budou jednotlivé genotypové třídy vykazovat signifikantně rozdílné parametry sledované charakteristiky (např. krevního tlaku), lze předpokládat, že daný marker, případně variace DNA v jeho blízkosti nějakým způsobem ovlivňuje tuto charakteristiku • nevýhody: oFP - náhodně odlišná distribuce markeru kvantitativního znaku (! P-hodnota) otestujeme asociaci jen přímo v místech, ve kterých se nacházejí námi typizované markery, což v experimentu běžných parametrů znamená pomíjení desítek megabází DNA mezi nimi Design genetických studií Komplexní choroby Genetika onemocnění s komplexní dědičností44 ̶ Studie na modelových organizmech • metoda tzv. intervalového neboli QTL (quantitative trait locus) mapování oumožňuje odhadovat genotyp i v úsecích mezi námi genotypizovanými markery opokud se QTL (tedy lokus, který výrazně ovlivňuje variabilitu ve zkoumaném znaku) podaří identifikovat, nastává fáze pozičního klonování, která je v principu velmi podobná strategii popsané u studií lidských Design genetických studií Komplexní choroby Genetika onemocnění s komplexní dědičností45 ̶ Studie na lidech • zhodnocení síly asociace genů s chorobami olinkage (vazebná) analýza – para a neparametrická oasociační studie – retro, prospektivní a TDT studie např. case-control – studium několik SNPs např. celogenomové asociační studie (GWAS = Genome-Wide Association Study) – vyhledávají SNPs nebo běžné genové variace, které se typicky chovají jako ukazatelé genových oblastí s malým efektem u stoupajícího rizika nemocí Design genetických studií Komplexní choroby Genetika onemocnění s komplexní dědičností46 ̶ vazebné vs. asociační studie Design genetických studií Komplexní choroby Genetika onemocnění s komplexní dědičností47 http://www.intechopen.com/books/type-1-diabetes-pathogenesis-genetics- and-immunotherapy/genetics-of-type-1-diabetes ̶ Linkage (vazebná) analýza – dva základní principy: • geny umístěné na různých chromozomech segregují nezávisle a není tedy mezi nimi žádná vazba • čím blíže u sebe lokusy na stejném chromozomu leží, tím je pravděpodobnost rekombinace θ mezi nimi menší, přičemž může dosahovat maximálně hodnoty 0,5. Jestliže jsou dva lokusy na jednom chromozomu příliš blízko u sebe, mezi těmito lokusy existuje vazba a dochází ke společné segregaci alel. Pokud například zjistíme, že rekombinační poměr genetického markeru s určitou nemocí je nízký, můžeme usoudit, že se tento marker nachází blízko genu pro nemoc. Design genetických studií Komplexní choroby Genetika onemocnění s komplexní dědičností48 ̶ Linkage (vazebná) analýza • testuje kosegregaci genového markeru a fenotypu nemoci v rodině • marker a nemoc se v dané rodině mají vždy vyskytovat spolu oparametrické metody - je-li stanoven model dědičnosti ovs. neparametrické metody Design genetických studií Komplexní choroby Genetika onemocnění s komplexní dědičností49 ̶ Linkage (vazebná) analýza – parametrické metody • je-li stanoven model dědičnosti (při genetickém mapování monogenních nemocí) odostatek rodin, ve kterých daná nemoc postihuje alespoň dvě generace, a jasně definovaný fenotyp ohodnocení dle LOD skóre – logaritmus šance (odds), že tato vazba existuje. Konvenčně je LOD skóre 3 (šance 1000:1 ve prospěch existence vazby) přijímáno jako důkaz vazby a LOD skóre – (minus) 2 (1:100 proti) jako důkaz, že lokusy nejsou vázány oporovnání NULOVÉ HYPOTÉZY (neexistuje vazba, θ = 0,5) s alternativní hypotézou Design genetických studií Komplexní choroby Genetika onemocnění s komplexní dědičností50 ̶ Linkage (vazebná) analýza – neparametrické metody • u komplexních chorob onapř. studium sourozenců, sdílení alel ozjišťuje se, jestli pár zdědil daný marker častěji než v případě náhodné segregace. K tomu slouží počet tzv. IBD alel (identical by descent, identické původem) oNULOVÁ HYPOTÉZA = oba sourozenci sdílejí dvě IBD alely s pravděpodobností 25 %, jednu IBD alelu s pravděpodobností 50 % a žádnou takovou alelu s pravděpodobností 25 % oMožná vazba by se projevila tím, že oba nemocní sourozenci by sdíleli více IBD alel než kdyby šlo o náhodu Design genetických studií Komplexní choroby Genetika onemocnění s komplexní dědičností51 ̶ Linkage (vazebná) analýza • Posun zjištění (ascertainment bias) orozdíl v pravděpodobnosti, s jakou budou nahlášeni postižení příbuzní pacientů ve srovnání s postiženými příbuznými kontrol • Posun hlášení (recall bias) ovětší motivace příbuzných probanda k vyplnění dotazníku, protože je jim dané onemocnění bližší Design genetických studií Komplexní choroby Genetika onemocnění s komplexní dědičností52 ̶ Asociační studie • vyšetřují souvýskyt markeru a nemoci na populační úrovni, tj. u nepříbuzných jedinců, obvykle srovnáním frekvencí markerů u nepříbuzných nemocných a kontrolních subjektů (studie case-control) • retrospektivní studie • prospektivní studie • TDT studie Design genetických studií Komplexní choroby Genetika onemocnění s komplexní dědičností53 ̶ Asociační studie • statistickou sílu asociace je možno dále zvýšit obohacením o další kritéria, jako např.: oklinické subtypy nemoci (studie case-case) ozávažnost nemoci očasný začátek nemoci orizikové faktory pro nemoc včetně pohlaví ovhodné biologické znaky (např. plazmatické hladiny cytokinů při asociaci genetických polymorfizmů v cytokinových genech; studie genotyp-fenotyp) Design genetických studií Komplexní choroby Genetika onemocnění s komplexní dědičností54 ̶ Asociační studie – retrospektivní – studie případů a kontrol (case-control studies) • srovnávání frekvencí alel studovaného genu mezi dvěma skupinami nepříbuzných osob ze stejné populace (zamezení tzv. stratifikace) • u metod retrospektivních se vyvinula daná nemoc a až poté se zjišťuje, zda postižená osoba byla nebo nebyla vystavena sledovanému rizikovému faktoru (například přítomnost určité formy genu) • nutné definovat kritérium, podle kterého se subjekty rozdělí do skupin (např. dle klinického vyšetření) • charakteristika skupin – srovnatelnost (např. věk, pohlaví nebo rasa) = strukturální vyvažování případů a kontrol (matching) Design genetických studií Komplexní choroby Genetika onemocnění s komplexní dědičností55 ̶ Asociační studie – retrospektivní – studie případů a kontrol (case-control studies) Design genetických studií Komplexní choroby Genetika onemocnění s komplexní dědičností56 http://www.nature.com/nrg/journal/v10/n12/box/nrg2670_BX3.html ̶ Asociační studie – retrospektivní – studie případů a kontrol (case-control studies) • funkční kandidátní geny oprodukty genů se patofyziologicky uplatňují u dané choroby • pozičních kandidátních genů omohou tak navazovat na vazebné metody, u nichž se vymezil úsek chromozomu, kde se pravděpodobně hledaný gen nachází, a tento gen odhalit Design genetických studií Komplexní choroby Genetika onemocnění s komplexní dědičností57 ̶ Asociační studie – retrospektivní – studie případů a kontrol (case-control studies) • poměr šancí (OR, odds ratio) osíla asociace je vyjádřena podílem nadějí vypočítaným z frekvence dané alely u pacientů a kontrol oje-li frekvence studované alely shodná u pacientů i kontrol, je podíl nadějí = 1 oOR=(80*50)/(50*20)=4 Design genetických studií Komplexní choroby Genetika onemocnění s komplexní dědičností58 pacient kontrola Alela G 80 50 Alela A 20 50 ̶ Vyjádření rizika u komplexních chorob • riziko = pravděpodobnost vývoje onemocnění numericky: 0 – 1 • znaky (genetické, environmentální,…), které zvyšují tuto pravděpodobnost  rizikové faktory ovýsledky různých studií daného RF by měly být konzistentní oasociace by měla být silná a specifická (nezávislá na jiných faktorech) oodpověď dávka/efekt obiologická věrohodnost Design genetických studií Komplexní choroby Genetika onemocnění s komplexní dědičností59 ̶ Asociační studie – retrospektivní – studie případů a kontrol (case-control studies) • přímá asociace opředpokládá se, že sledovaný marker je zároveň patogenetickým lokusem pro nemoc a má tedy hypoteticky přímý (kauzální) efekt na fenotyp oje tedy nutné vybrat několik kandidátních lokusů, které by mohly být přímo zodpovědné za danou nemoc Design genetických studií Komplexní choroby Genetika onemocnění s komplexní dědičností60 ̶ Asociační studie – retrospektivní – studie případů a kontrol (case-control studies) • pokud kandidátní lokusy neznáme, můžeme využít nepřímé studie, kde genotypizací musí projít daleko více většinou disperzně rozptýlených markerů o u asociovaného markeru/ů předpokládáme, že se nachází v blízkosti lokusu pro nemoc Design genetických studií Komplexní choroby Genetika onemocnění s komplexní dědičností61 ̶ Asociační studie – retrospektivní – studie případů a kontrol (case-control studies) • nepřímé studie okdyž jsou alely v těsné blízkosti, segregují společně a dochází zde k minimálnímu crossing-overu – dva lokusy jsou ve vazebné nerovnováze (Linkage disequilibrium, LD, allelic or gametic disequilibrium) osíla LD, a tedy hustota pokrytí genomu markery, je pro tyto studie stěžejní Design genetických studií Komplexní choroby Genetika onemocnění s komplexní dědičností62 ̶ Asociační studie – prospektivní • “cohort” studie oz populace se vybere vzorek subjektů (kohorta), kteří v době výběru netrpí danou chorobou ozjišťováním přítomnosti příslušných genetických markerů v jejich genetické výbavě se vymezí skupina, u které se vyskytuje studovaný rizikový faktor oskupina je po určitou dobu sledována, zpravidla jde o několik let opoté se porovnávají alelické frekvence osob, u nichž došlo k rozvoji dané choroby (fenotypu) a ostatních, u kterých se tato choroba neprojevila Design genetických studií Komplexní choroby Genetika onemocnění s komplexní dědičností63 ̶ Asociační studie – prospektivní – “cohort” studie • relativní riziko (RR) opoměr incidence onemocnění v exponované skupině ku incidenci v neexponované skupině oporovnává riziko vzniku nemoci při nosičství určité alely s rizikem bez nosičství této alely ou vzácných onemocnění se přibližně rovná i OR (B < D a A < C) Design genetických studií Komplexní choroby Genetika onemocnění s komplexní dědičností64 ̶ Asociační studie – prospektivní – “cohort” studie • nejprve je tedy určen rizikový faktor a až poté sledujeme, zda dojde k rozvinutí onemocnění • rovněž je možno sledovat populaci nemocných např. s ohledem na rychlost progrese nemoci či úmrtí • jestliže se smíříme s délkou trvání těchto metod (a tedy typicky většími finančními a personálními náklady), získáme hned několik výhod • můžeme vyjádřit RR dané alely a nemusíme řešit častý problém s výběrem kontrolní skupiny Design genetických studií Komplexní choroby Genetika onemocnění s komplexní dědičností65 ̶ Asociační studie – Test nerovnováhy přenosu (angl. transmission disequilibrium test, TDT) • ke studiu se využívají tzv. tria, které tvoří vždy dítě, postižené danou chorobou, a jeho rodiče, kteří ovšem musejí být v kandidátním lokusu heterozygoty • protože se jedná o heterozygoty, můžeme snadno zjistit, která alela pochází od kterého rodiče • měří se frekvence, s jakou se na dítě přenášejí kandidátní alely, a frekvence, s jakou se na něj přenášejí alely alternativní – porovnávání oshoda = alela se na vzniku onemocnění neúčastní orozdíl = alela je s chorobou v asociaci (jedná se o aplikaci McNemarova testu) Design genetických studií Komplexní choroby Genetika onemocnění s komplexní dědičností66 ̶ Asociační studie – TDT • nevýhoda pro nemoci s pozdním nástupem Design genetických studií Komplexní choroby Genetika onemocnění s komplexní dědičností67 ̶ Asociační studie • kauzální souvislost • přirozená selekce • populační stratifikace • statistický artefakt ohodnoty pravděpodobností asociačních studií musí být korigovány: ne p=0,05 (event. 0,01) ale p=0,05/m (Bonferonni correction) m=počet zároveň provedených testů • linkage disequilibrium Design genetických studií Komplexní choroby Genetika onemocnění s komplexní dědičností68 ̶ Asociační studie • v klinické praxi často kolísá názor na výsledky genetických studií oneodůvodněné očekávání nalezení genů velkého účinku ovelká skepse k existenci genetického podkladu u nemocí, které jsou v populaci časté (>1 %) Design genetických studií Komplexní choroby Genetika onemocnění s komplexní dědičností69 ̶ Variabilita počtu kopií genu (CNV) • v roce 2004 objevena nová forma strukturní variability lidského genomu • CNV dnes tvoří asi 12 % lidského genomu • CNV se podílejí na genetické variabilitě jedinců Metody molekulární genetiky při studiu těchto chorob Komplexní choroby Genetika onemocnění s komplexní dědičností70 http://cnv.gene-quantification.info/ ̶ Variabilita počtu kopií genu (CNV) • pokud CNV ve formě delecí/duplikací postihují důležité geny, mohou způsobovat genetické choroby • CNV mapování (cytogenetické techniky, karyotypizace se SNP sondou, NGS) • CNV asociovány s nádorovými onemocněními, autismem, schizofrenií a dalšími Metody molekulární genetiky při studiu těchto chorob Komplexní choroby Genetika onemocnění s komplexní dědičností71 http://slidedeck.io/yulingl/cnv-cs374 ̶ Jednonukleotidové polymorfizmy (SNPs) • v regulačních oblastech, intronech i exonech • důsledkem může být: ozměna AA oukončení translace, a tím pádem zkrácení polypeptidu (často dochází k rychlé degradaci) ovliv na sestřih, transkripci nebo stabilitu mRNA • cca 7 milionů známých lidských SNPs v dbSNP databázi • HapMap projekt – běžné SNPs s MAF>5 %, populační rozdíly • Haploview – k vizualizaci LD struktury dané oblasti genu Metody molekulární genetiky při studiu těchto chorob Komplexní choroby Genetika onemocnění s komplexní dědičností72 ̶ Nové směry (tzv. high-throughput techniky) • multiplexing (určení velkého množství markerů v jediná reakci) nebo DNA pooling (zjištění alelické frekvence při smísení DNA vzorků více jedinců) • DNA microarrays, SnaPshot, NGS, MS a další Metody molekulární genetiky při studiu těchto chorob Komplexní choroby Genetika onemocnění s komplexní dědičnost73 Metody molekulární genetiky při studiu těchto chorob Komplexní choroby Genetika onemocnění s komplexní dědičnost74 doi:10.1371/journal.pcbi.1004259 Závěr – Otázky k hodnocení významu genetických faktorů u komplexních nemocí Komplexní choroby Genetika onemocnění s komplexní dědičnost75 ̶ 1. Jak důležité jsou genetické vlivy u nejčastějších forem těchto nemocí? ̶ 2. Jaký je vliv prostředí na vznik nemoci? ̶ 3. Které jsou nejslibnější přístupy k determinaci genetických faktorů pro nemoc? ̶ 4. Které geny již byly vybrány jako možní kandidáti? ̶ 5. Které cesty přispívají ke genetické vnímavosti pro danou nemoc? Závěr – Otázky k hodnocení významu genetických faktorů u komplexních nemocí Komplexní choroby Genetika onemocnění s komplexní dědičnost76 ̶ 6. Kolik genů se podílí na vnímavosti k nemoci? ̶ 7. Jsou nejčastější formy polygenní nemoci asociovány s častou nebo vzácnou genetickou variabilitou v populaci? (hypotéza častá variace/častá nemoc vs. genetický heterogenní model) ̶ 8. Proč alely, které jsou asociovány s nemocí, nebyly z populace eliminovány? ̶ 9. Jak důležité jsou pro danou nemoc interakce geny-prostředí a geny-geny? ̶ 10. Jaké jsou důsledky pro farmakogenetiku? Závěr – Genetická analýza komplexních nemocí vs. monogenních chorob Komplexní choroby Genetika onemocnění s komplexní dědičnost77 Gen Nalezení „variant“ v příslušném genu Analýza genových variant Mendelistické nemoci Komplexní nemoci Diagnostika „Náchylnost“ (susceptibility) Klinický význam dosud „problematický“ Léčebná intervence Prognostický indikátor Genetické poradenství Závěr – Cíle genetického výzkumu u komplexních nemocí Komplexní choroby Genetika onemocnění s komplexní dědičnost78 doi: 10.1038/nrg2344 Závěr – Cíle genetického výzkumu u komplexních nemocí Komplexní choroby Genetika onemocnění s komplexní dědičnost79 ̶ zlepšit porozumění patofyziologii uvedených chorob ̶ přispět k diagnostice onemocnění ̶ nalézt parametry rizika progrese nemoci či stupně její závažnosti ̶ Nové poznatky by měly napomoci upřesnění diagnostických a/nebo léčebných postupů (individualizovaný přístup k terapii). ̶ Tato prezentace je autorským dílem vytvořeným zaměstnancem Masarykovy univerzity. ̶ Studenti kurzu/předmětu mají právo pořídit si kopii prezentace pro potřeby vlastního studia. ̶ Jakékoliv další šíření prezentace nebo její části bez svolení Masarykovy univerzity je v rozporu se zákonem. Informace o duševním vlastnictví Personalizovaná medicína80