Bi9393 Analytická cytometrie Oddělení cytokinetiky Biofyzikální ústav AVČR, v.v.i. Královopolská 135 612 65 Brno e-mail: ksoucek@ibp.cz tel.: 541 517 166 Karel Souček, Ph.D. K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie Co je problém při vícebarevné detekci? K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie Kompenzace fluorescenčního signálu Spectral flow cytometry Conventional vs. spectral analysis Doporučení - kombinujte fluorochromy s odpovídající svítivostí a nízkým dopadem na rozlišení dalších barev - vyhněte se obtížně kombinovatelným fluorochromům - posouzení dopadu na biologické rozlišení: větší není vždy lepší - optimalizujte váš protocol: kontroly, kontroly, kontroly (zkratky nefungují) Aplikace průtokové cytometrie ANALÝZA NUKLEOVÝCH KYSELIN buněčný cyklus a ploidyta analýza zlomů DNA inkorporace BrDU exprese cyklinů analýza denaturace DNA ANALÝZA BUNĚČNÉHO FENOTYPU imunofenotypizace pomocí CD antigenů (detekce diferenciačních a nádorových markerů) detekce cytokinových receptorů CYTOGENETIKA analýza chromozómů STUDIUM BUNĚČNÝCH FUNKCÍ viabilita stanovení intracelulárního pH analýza organel a cytoskeletu stanovení membránového potenciálu oxidativní vzplanutí stanovení intracelulárního Ca2+ stanovení intracelulárních cytokinů Natural Killer ligace značených buněk analýza reportérových genů K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie Biologické aplikace průtokové cytometrie ◼ analýza proliferace ◼ fluorescenční proteiny K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie Buněčný cyklus d:\powerpoint\figures\chapter17\1708.jpg http://i.imgur.com/iq9cbSw.jpg Co je důležité při přípravě vzorku a značení… ◼ Postup přípravy vzorku a značení nelze zobecnit – závisí na typu buněk a konkrétní analýze – suspenze jednotlivých buněk – vitální značení – fixace (etanol, formaldehyd) – permeabilizace (detergenty) – difúze – aktivní transport Analýza buněčného cykluAnalýza buněčného cyklu • jedna z nejstarších aplikací flow cytometrie, stanovení fáze buněčného cyklu podle množství DNA • průtoková cytometrie je vhodná metoda pro rychlou a přesnou determinaci buněčného cyklu • jednoduchým způsobem je DNA obarvena fluorescenční barvou specifickou pro DNA. • Propidium iodide 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) - dramaticky zvyšují fluorescenci po vazbě na DNA. Je nutná permeabilizace cytoplasmatické membrány . • Hoechst 33342 • Vybrant® DyeCycle • DRAQ5 • Quaternary benzo[c]phenanthridine alkaloids (QBAs) I. Slaninova, J. Slanina and E. Taborska, "Quaternary benzo[c]phenanthridine alkaloids--novel cell permeant and red fluorescing DNA probes," Cytometry A, vol. 71, no. 9, pp. 700-708, 2007. - mohou být používány pro značení viabilních buněk. K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie G2 M G0 G1 s 0 200 400 600 800 1000 G0G1 s G2M DNA Analysis DNA content C o u n t 2N 4N Normal Cell CycleNormal Cell Cycle Purdue University Cytometry Laboratories - propidium iodide - DAPI - Hoechst 33342 - 7-AAD Analýza histogramu buněčného cyklu ◼ nepoužívá se běžná analýza pomocí úseček (regionů) v histogramu ◼ je nutné používat speciální software pro modelovaní analýzu distribuce jednotlivých fází Cell cycle histogram: gating strategy Debris Aggregates Dip G1 Dip G2 Dip S Detekce buněk v synchronizovaném buněčném cyklu File analyzed: SAMPLE2.FCS Date analyzed: 16-Oct-2006 Model: 2DA0n_DSD_ASD Analysis type: Automatic analysis Diploid: 57.22 % Dip G1: 70.35 % at 75.05 Dip G2: 5.60 % at 150.10 Dip S: 24.05 % G2/G1: 2.00 %CV: 3.02 Aneuploid 1: 42.78 % An1 G1: 83.63 % at 100.15 An1 G2: 5.87 % at 200.30 An1 S: 10.50 % G2/G1: 2.00 %CV: 5.02 DI: 1.33 Total Aneuploid S-Phase: 10.50 % Total S-Phase: 18.25 % Total B.A.D.: 11.22 % Debris: 19.13 % Aggregates: 3.96 % Modeled events: 31253 All cycle events: 24037 Cycle events per channel: 190 RCS: 0.842 Debris Aggregates Dip G1 Dip G2 Dip S An1 G1 An1 G2 An1 S Aneuploidie je významný diagnostický marker 450px-Native_American_tobacco_flower Analýza ploidity u vyšších rostlin http://en.wikipedia.org/wiki/Image:Nativ e_American_tobacco_flower.jpg Alstroemeria caryophyllaceaNicotiana tabacum 400px-Corntassel_7095 http://en.wikipedia.org/wiki/I mage:Corntassel_7095.jpg Zea mays endosperm 28 dní po opylení Cell cycle analysis- limitations Analýza inkorporace BrdUAnalýza inkorporace BrdU K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie ◼ bromodeoxyuridin se inkorporuje do DNA namísto tymidinu během S-fáze ◼ po fixaci a částečné denaturaci DNA je možné BrdU detekovat pomocí specifické protilátky značené fluorochromem ◼ v posledním kroku můžeme obarvit DNA Analýza inkorporace BrdUAnalýza inkorporace BrdU File: HL60 K/24h Region % Gated R1 100.00 R2 35.48 R3 10.25 R4 47.87 R5 1.32 R4 R2 R3 R5 K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie Click azide/alkyne reaction Invitrogen Aplikace Click-IT (Invitrogen) Multiplex imaging with Click-iT® RNA assays. NIH3T3 cells were incubated with 1 mM EU, formaldehyde-fixed, and permeabilized with Triton® X-100. EU incorporated into newly synthesized RNA (red) in some cells was detectied using the Click-iT® RNA Alexa Fluor® 594 Imaging Kit. Tubulin (green) was detected with anti-tubulin mouse IgG9 and visualized with Alexa Fluor® 488 goat anti-mouse IgG. Nuclei (blue) were stained with Hoechst 33342. Aplikace Click-IT (Invitrogen) analýza syntézy DNA (proliferace) Tritiated (3H) thymidine 3H-thymidine • Original method for measuring cell proliferation • Radioactive • Not compatible for multiplexed analyses 3H-thymidine BrdU (5-bromo-2'-deoxyuridine) BrdU Br Br Br Br Br Br Br Br BrdU Br Br Br Br BrdU Br Br Br Br BrdU Br Br Br Br BrdU • Non-radioactive • Multiplex compatible but, strand separation requirement for anti-BrdU access, can affect: • Ability for other antibodies to bind • Morphology • Ability for dyes that require dsDNA to bind efficiently, i.e., cell cycle dyes EdU (5-ethynyl-2'-deoxyuridine) Click-iT EdU Click-iT EdU Click-iT Edu • Non-radioactive • No DNA denaturation required • Simplified protocol • Small molecule detection • Multiplex compatible, including • Other antibodies • Dyes for cell cycle analysis Analýza DNA a RNA Pyronin Y vs. Hoechst 33342 - Pyronin interaguje s ds RNA a DNA ale jeho vazba na DNA je inhibována přítomností Hoechst 33342 ◼ Acridine orange - při interakci s RNA emituje červené světlo a při interakci s DNA zelené Detekce intracelulárních proteinů v kombinaci s detekcí DNA Detekce mitotických buněk ◼ Histone H3 je specificky fosforylován během mitózy (Ser10, Ser28, Thr11) ◼ dvojité značení DNA vs. H3-P identifikuje populaci buněk v M-fázi Flow cytometry most common applications Viability assays (propidium iodid, Calcein AM, …) Proliferation (BrdU, EdU, mitosis - pH3) DNA damage ( yH2AX,…) Cell Death analysis (AnnexinV, Cleaved Caspase3, …) Cell Cycle (DNA content, Cell cycle modulation after treatment) Immunophenotype characterisation of the cells (CSCs markers, differentiation, …) IMMUNOPHENOTYPING Principle: cells are stained with monoclonal antibodies conjugated to various fluorescent dyes and analyzed with using flow cytometry Pros: simple, standard, broad spectrum of tested reagents, multiplexing Cons: not every epitope is fixable, compensation, possible artefacts from dying cells, dissociation of solid tissue may affect results Ermann, J. et al. (2015) Immune cell profiling to guide therapeutic decisions in rheumatic diseases Nat. Rev. Rheumatol. doi:10.1038/nrrheum.2015.71 VIABILITY using LIVE/DEAD fixable stains Principle: reaction of a fluorescent reactive dye with cellular amines, in necrotic cells react with free amines both in the interior and on the cell = intense staining, live cells stained on surface only = dim signal Pros: simple, wide spectrum of dyes, fixable, The ArC Amine Reactive Compensation Bead Kit Cons: live cells have signal, stain only in buffers w/o BSA or serum, Tris or azide Debris Aggregates Dip G1 Dip G2 Dip S Principle: DNA content measurement by fluorescent nucleic-acid-binding dyes Pros: simple, wide spectrum of dyes, in both native and fixed samples Cons: doublets > G2/M, single parameter≠ DNA synthesis, > CV if not fixed by organic solvents CELL CYCLE DNA SYNTHESIS using click azide/alkyne reaction Principle: direct measurement of DNA synthesis via visualization of incorporation of nucleoside analogue Pros: no DNA denaturation required, simplified protocol, small molecule detection, multiplex compatible Cons: high concentration of Cu in reaction = not compatible with all fluorochromes 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine alkyne azide triazol DNA DAMAGE using γH2A.X Principle: Phosphorylation of the Ser-139 residue of the histone variant H2A.X, forming γH2A.X, is an early cellular response to the induction of DNA doublestrand breaks Pros: in theory simple immuno-staining after fix&perm Cons: DSBs can also be intrinsic, occurring in healthy, nontreated cells, DSBs are formed in the course of DNA fragmentation in apoptotic cells Huang X, Darzynkiewicz Z: Cytometric Assessment of Histone H2AX Phosphorylation. In DNA Repair Protocols: Mammalian Systems. Edited by Henderson DS. Totowa, NJ: Humana Press; 2006: 73-80 CTRL GEM APOPTOSIS detected via PARP cleavage or caspase-3 activation Principle: Cleaved Caspase-3 (Asp175) Antibody detects endogenous levels of the large fragment (17/19 kDa) of activated caspase-3. Cleaved PARP (Asp214) detects endogenous levels of the large fragment (89 kDa) PARP1 protein produced by caspase cleavage. Pros: simple immunostaining after fix&perm, validated antibodies available Cons: not every cell type or signal necessary activates cp-3 or leads to PARP cleavage, timing Untreated MG-132 DNA stain ◼ Violet laser DAPI, Hoechst 33342 FxCycle Violet, … ◼ Blue laser Vybrant Dyes, PI, … ◼ Red laser FxCycle Far Red 7-AAD Broad spectrum of the dyes Problems: High concentration of dye, no wash Spillover & Compensations Compensation Antibody conjugates: • anti-rat and anti-hamster Igκ/negative control compensation beads (BD Biosciences), • SpheroTM Biotin Polystyrene Particles (Spherotech, Lake Forest, IL, USA) Live/Dead fixable dyes: • ArcTM Amine Reactive Compensation Bead Kit beads (Thermo Fisher Scientific) DNA stain: • fixed and permeabilized cells with/without appropriately diluted DNA probe Isotype controls were recorded for all samples. Gates were set according to isotype controls and control untreated cells (for γH2AX and cleaved caspase-3) Gating strategy included viability, discrimination of doublets (FSC-H vs. FSC-A) and debris (FSC vs. SSC). In samples with DNA marker, doublets we further discriminated using DNA marker (PO-PRO-1 A vs. PO-PRO-1 W) . In the process of protocol optimization, FMO controls were measured and revealed DNA dye spillover. Examination of small subpopulation (Trop-2+) in response to experimental treatment Detekce počtu buněčného dělení The Nobel Prize in Chemistry 2008 ◼ "for the discovery and development of the green fluorescent protein, GFP" http://nobelprize.org/nobel_prizes/chemistry/laureates/2008/ Fluorescenční proteiny ◼ bioluminescence resonance energy transfer (BRET) Aequorea victoria - medúza žijící ve vodách na pobřeží Severní Ameriky. – je schopna modře světélkovat (bioluminescence). Ca2+ interaguje s fotoproteinem aequorinem. – modré světlo excituje green fluorescent protein. Renilla reniformis – korál žijící ve vodách na severním pobřeží Floridy. – luminescence vzniká degradací coelenterazinu za katalytického působení luciferázy. – modré světlo excituje green fluorescent protein. Renilla reniformis "Sea Pansy" http://www.mbayaq.org/efc/living_species/default.asp?hOri=1&inhab=440 Aequorea victoria “Crystal jelly “ http://www.whitney.ufl.edu/species/seapansy.htm Fluorescenční proteiny ◼ Osamu Shimomura – 1961 objevil GFP a aequorin http://www.conncoll.edu/ccacad/zimmer/GFP-ww/GFP2.htm Science. 1994 Feb 11;263(5148): Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Chalfie M, Tu Y, Euskirchen G, Ward WW, Prasher DC. Department of Biological Sciences, Columbia University, New York, NY 10027. ◼ A complementary DNA for the Aequorea victoria green fluorescent protein (GFP) produces a fluorescent product when expressed in prokaryotic (Escherichia coli) or eukaryotic (Caenorhabditis elegans) cells. Because exogenous substrates and cofactors are not required for this fluorescence, GFP expression can be used to monitor gene expression and protein localization in living organisms. Fluorescenční proteiny ◼ Douglas Prasher ◼ Martin Chalfie Fluorescenční proteiny http://www.conncoll.edu/ccacad/zimmer/GFP-ww/GFP2.htm in vivo molekulární vizualizace Hasegawa, S., Yang, M., Chishima, T., Miyagi, Y., Shimada, H., Moossa, A. R., and Hoffman, R. M. In vivo tumor delivery of the green fluorescent protein gene to report future occurrence of metastasis. Cancer Gene Ther, 7: 1336-1340, 2000. KODAK X-SIGHT 640 LSS Dyes in vivo with x-ray overlay KODAK X-SIGHT 650 and 761 Nanospheres, KODAK In-Vivo Multispectral Imaging System Fluorescenční proteiny ◼ Sergey A. Lukyanov – Objevil „GFP-like“ proteiny u nesvětélkujících korálů Roger Tsien ◼ ~ 2002 – mutace FP = barevné spektrum http://www.tsienlab.ucsd.edu/ Debris Aggregates Dip G1 Dip G2 Dip S Detekce buněk v synchronizovaném buněčném cyklu Licensing control by Cdt1 and geminin J Cell Sci 2012 125: 2436-2445; doi: 10.1242/jcs.100883 Fucci (fluorescent ubiquitination-based cell cycle indicator) cells Ubiquitin E3 ligase complexes G1 - APCCdh1 substrate: Geminin, inhibitor of DNA replication inhibits Cdt1 S, G2, M- SCFSkp2 substrate: DNA replication factor Cdt1 – key licensing factor Fucci sensors - 1st generation, coral FP monomeric Kusabira orange 2 – hCdt1 (30/120) Monomeric Azami-Green – hGeminin (1/110) Fucci sensors – 2nd generation, Aequorea FP red monomeric fluorescent protein - mCherry hCdt1 (30/120) yellowish green monomeric variant of GFP – mVenus – hGeminin (1/110) Fucci http://cfds.brain.riken.jp/Fucci.html CONTROL SCH900776 MU380VEHICLEGEMCITABINE …lot of questions, but how to answer them? ◼ How many times cells divided? ◼ What is a length of cell cycle phases? ◼ Is there a difference in time between first and second division? ◼ How it is all affected by my drugs? Branches (dvisions) analysis 02_02_01_01 Median 14 hours 02_02_01_01 Shrnutí přednášky ◼ Kompenzace ◼ Kontrola kvality, zásady ◼ analýza proliferace ◼ fluorescenční proteiny Na konci dnešní přednášky byste měli: 1. Jaké jsou základní principy multispektrální a hmotnostní cytometrie 2. vědět jakým způsoben je možné analyzovat buněčný cyklus. 3. umět navrhnout další parametr kombinovatelný s DNA analýzou. 4. znát příklady buněčných funkcí které je možné analyzovat na průtokovém cytometru. 5. vědět co jsou to fluorescenční proteiny a jaké jsou výhody jejich využití v buněčné biologii. 6. co je to click-IT. Na konci dnešní přednášky byste měli: 1. Jaké jsou základní principy multispektrální a hmotnostní cytometrie 2. vědět jakým způsoben je možné analyzovat buněčný cyklus. 3. umět navrhnout další parametr kombinovatelný s DNA analýzou. 4. znát příklady buněčných funkcí které je možné analyzovat na průtokovém cytometru. 5. vědět co jsou to fluorescenční proteiny a jaké jsou výhody jejich využití v buněčné biologii. 6. co je to click-IT. K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie Vitální analýza buněčných funkcí ◼ Průtoková cytometrie umožňuje vícebarevnou vitální analýzu buněk – intracelulární koncentrace iontů, – pH, – produkce reaktivních skupin, – životnost Detekce viability ◼ jedna z nejjednodušších analýz ◼ funguje na principu: – detekce membránové integrity - neprůchodnosti některých fluorescenčních značek cytoplazmatickou membránou živých buněk – propidium iodide, ethidium bromide, 7-amino actinomycin D – detekce fyziologického stavu buněk – použití fluorescenčních značek barvících pouze živé buňky - Rhodamine-123, Calcein-AM ◼ ethidium monoazide – lze jím obarvit mrtvé buňky a následně fixovat ◼ Pomocí LDS-751 (laser dye styryl-751) je možné odlišit mrtvé buňky i po fixaci ◼ LIVE/DEAD® Fixable Dead Cell Stain Kits Detekce viability VIABILITY using LIVE/DEAD fixable stains Principle: reaction of a fluorescent reactive dye with cellular amines, in necrotic cells react with free amines both in the interior and on the cell = intense staining, live cells stained on surface only = dim signal Pros: simple, wide spectrum of dyes, fixable, The ArC Amine Reactive Compensation Bead Kit Cons: live cells have signal, stain only in buffers w/o BSA or serum, Tris or azide Přenos signálu pomocí Ca2+ •Cytosol (koncentrace - „klidová“ 100 nM vs. 1-10 M aktivovaná) •[Ca2+]c aktivuje proteinkinázu C •interaguje s „Ca2+ - binding proteins“ Alberts, B. et.al. Essential Cell Biology, 1998 K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie Ca 2+ influx - Fura-2 - Fluo-3 - Indo-1 K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie ionophor ionophor Zajištění vhodných podmínek pro detekci [Ca2+]i •standardizace barvení a kalibrace - zlepšení rozpustnosti AM estery modifikovaných indikátorů (BSA, Pluronic ® -127) - inhibice aktivního vylučování indikátoru buňkou (Probecid) - pro kalibraci vhodné AM estery modifikované chelátory (BAPTA-AM) •temperace vzorku po celou dobu měření •standardizace způsobu přidávání induktoru K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie Burns, J. M. et.al. (1997). "Improved measurement of calcium mobilization by flow cytometry." Biotechniques 23(6): 1022-4, 1026. http://www.cytekdev.com K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie Kalibrace (pro jednu vlnovou délku)   ( ) ( ) Ca K x F -F F -F 2 d min max + = R1 Fluo-3 (Kd ~ 400nM, 22°C; 864 nM, 37°C) Fmin = 1.25 x FMnCl2 - 0.25 x Fmax K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie Detekce intracelulárního pH ◼ Fluorescenční značky měnící intenzitu fluorescence v závislosti na pH ◼ SNARF-1, BCECF Detekce intracelulárního pH ◼ Nutná kalibrace pomocí draslíkových pufrů a ionoforu (nigericin) Detekce reaktivních kyslíkových skupin ◼ Reaktivní kyslíkové skupiny hrají klíčovou roli v celé řadě biologických procesů – posttranslační modifikace proteinů – regulace transkripce – regulace struktury chromatinu – přenos signálu – funkce imunitního systému – fyzický a metabolický stres – neurodegenerace, stárnutí O2• –O2 H2O2 • OH H2O 4 e– reduction to water e– e– e– e– Not so terribly reactive with most biomolecules Maintained at very low concentration Catalases, peroxidases, GSH, etc… Actually a chemical reductant Not so terribly reactive with most biomolecules Mitochondrial superoxide the major source of active oxygen Maintained at very low concentration Superoxide dismutases Reacts with virtually any molecule at diffusion-limited rates The molecule that makes ionizing radiation toxic Unreactive at STP, but a great electron acceptor Biological activation via radicals, transition metals Generally, radical intermediates are enzyme- bound © Simon Melov Potential sites of intervention Oxidative Stress Neurodegeneration Cancer Vascular Tone Cardiac Output Sensory Acuity Skin Thickness Bone Density Endocrine Function Immune Function DNA Damage Oncogenesis Mitochondrial Damage Energy Crisis Cell Death © Simon Melov Hydroethidine HE EB N CH2CH3 NH2H2N H Br- N CH2CH3 NH2H2N + O2 Phagocytic Vacuole SOD H2O2 NADPH NADP O2 NADPH Oxidase OH- O2 - DCF HE O2 - H2O2 DCF Example: Neutrophil Oxidative Burst © J. P. Robinson, Purdue University DCFH-DA DCFH DCF COOH H Cl O O-C-CH3 O CH3-C-O Cl O COOH H Cl OHHO Cl O COOH H Cl OHO Cl O Fluorescent Hydrolysis Oxidation 2’,7’-dichlorofluorescin 2’,7’-dichlorofluorescin diacetate 2’,7’-dichlorofluorescein Cellular Esterases H2O2 DCFH-DA DCFH-DA DCFH DCF H O2 2 Lymphocytes Monocytes Neutrophils log FITC Fluorescence . 1 1000100101 0 20 40 60 counts PMA-stimulated PMNControl 80 © J. P. Robinson, Purdue University Key Name K/72h+PMA ATRA/72h+PMA DMSO/72h+PMA NaBT/72h+PMA vit. D3/72h+PMA (A) (B) (C) - DCFH-DA - DHR-123 - HE Oxidative Burst K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie Fluorescenční proteiny ◼ bioluminescence resonance energy transfer (BRET) Aequorea victoria - medúza žijící ve vodách na pobřeží Severní Ameriky. – je schopna modře světélkovat (bioluminescence). Ca2+ interaguje s fotoproteinem aequorinem. – modré světlo excituje green fluorescent protein. Renilla reniformis – korál žijící ve vodách na severním pobřeží Floridy. – luminescence vzniká degradací coelenterazinu za katalytického působení luciferázy. – modré světlo excituje green fluorescent protein. Renilla reniformis "Sea Pansy" http://www.mbayaq.org/efc/living_species/default.asp?hOri=1&inhab=440 Aequorea victoria “Crystal jelly “ http://www.whitney.ufl.edu/species/seapansy.htm Fluorescenční proteiny http://www.conncoll.edu/ccacad/zimmer/GFP-ww/GFP2.htm Fluorescent sensors for detection of H2O2 Variants & fusions ◼ pHyPer-cyto vector ◼ pHyPer-dMito vector – Duplicated mitochondrial targeting sequence (MTS) is fused to the HyPer N-terminus. MTS was derived from the subunit VIII of human cytochrome C oxidase [Rizzuto et al., 1989; Rizzuto et al., 1995]. ◼ pHyPer-nuc vector – Three copies of the nuclear localization signal (NLS) fused to the HyPer C-terminus provide for efficient translocation of HyPer to the nuclei of mammalian cells [Fischer-Fantuzzi and Vesco, 1988] Analýza a sortrování chromozómů Analýza a sortrování chromozómů ◼ synchronizace buněk – zisk metafázních chromozómů (colcemid, hydroxyurea) ◼ izolace chromozómů ◼ značení DAPI nebo Hoechst vs. chromomycin A3 (CA3) nebo mithramycin = celková DNA vs. G/C-bohaté oblasti NCBI PubChem logo http://www.scienceclarified.com/Ca-Ch/Chromosome.html http://www.nccr-oncology.ch/scripts/page9243.html Analýza a sortrování chromozómů e-bang „Flow karyotype“ http://www.sanger.ac.uk/HGP/Cytogenetics/ Karcinom močového měchýře Sortrování chromozómů Pisum sativum Sortrování chromozómů Vicia faba Aplikace průtokové cytometrie v mikrobiologii ◼ ekologie ◼ potravinářství http://www.cyto.purdue.edu/flowcyt/research/micrflow/ Aplikace průtokové cytometrie v mikrobiologii Aplikace průtokové cytometrie v mikrobiologii ◼ viabilita ◼ metabolické funkce ◼ sortrování ◼ analýza aerosolů (Fluorescence Aerodynamic Particle Sizer (Flaps)) Aplikace průtokové cytometrie v mikrobiologii ◼ Sortrování – EPICS + Autoclone® modul Průtoková cytometrie kvasinek ◼ buněčné dělení ◼ viabilita ◼ membránový potenciál ◼ respirace ◼ produkce H2O2 ◼ citlivost k antibiotikům ◼ separace Saccharomyces cerevisiae http://en.wikipedia.org/wiki/Image:Budding_yeast_Lifecycle.png http://www.sbs.utexas.edu/mycology/sza_images_SEM.htm Průtoková cytometrie kvasinek Průtoková cytometrie v hydrobiologii ◼ studium pico- a nanofytoplanktonu (< 20 M) ◼ analýza metabolických funkcí planktonu ◼ studium pigmentace (analýza chlorofylu a fykoeritrinu) Průtoková cytometrie v hydrobiologii Průtoková cytometrie v hydrobiologii ◼ analýza DNA http://planktonnet.awi.de/portal.php?pagetitle=assetfactsheet&asset_id=15127 http://www.soes.soton.ac.uk/staff/tt/ NCBI PubChem logo Průtoková cytometrie v hydrobiologii http://www.cyto.purdue.edu/flowcyt/research/micrflow/sieracki/sierack2.htm http://omlc.ogi.edu/spectra/PhotochemCAD/html/chl orophyll-a(MeOH).html Průtoková cytometrie bezobratlých ◼ lze aplikovat běžné metodické přístupy a fluorescenční značky ◼ Příklady aplikací: – buněčný cyklus – cytotoxicita – apoptóza Long Tongue Tachinid Fly 240px-Miesmuscheln_Mytilus_2 Invertebrate Survival Journal http://www.icms.qmul.ac.uk/flowcytometry/uses/insects/index.html http://www.icms.qmul.ac.uk/flowcytometry/uses/insects/index.html Figure 5. Representative flow-cytometry scatter plot of hemocytes from 25 oysters. Rebelo MdF, Figueiredo EdS, Mariante RM, Nóbrega A, et al. (2013) New Insights from the Oyster Crassostrea rhizophorae on Bivalve Circulating Hemocytes. PLoS ONE 8(2): e57384. doi:10.1371/journal.pone.0057384 http://www.plosone.org/article/info:doi/10.1371/journal.pone.0057384 Figure 6. Proposed model for hemocyte maturation, as seen by flow cytometry. Rebelo MdF, Figueiredo EdS, Mariante RM, Nóbrega A, et al. (2013) New Insights from the Oyster Crassostrea rhizophorae on Bivalve Circulating Hemocytes. PLoS ONE 8(2): e57384. doi:10.1371/journal.pone.0057384 http://www.plosone.org/article/info:doi/10.1371/journal.pone.0057384 https://www.union bio.com/copas/ Suraj Kannan. Circulation Research. Large Particle FluorescenceActivated Cell Sorting Enables High-Quality Single-Cell RNA Sequencing and Functional Analysis of Adult Cardiomyocytes, Volume: 125, Issue: 5, Pages: 567-569, DOI: (10.1161/CIRCRESAHA.119.315493) © 2019 American Heart Association, Inc. „High Throughput Flow Cytometry“ ◼ automatizace + robotizace = urychlení a efektivita sběru dat (měření desítky vzorků za hodinu s minimálním zásahem operátora ) ◼ využití principu vícebarevné analýzy K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie Automatizované systémy měření vzorků Automatický karusel (autosampler) Adaptér pro nasávání vzorků z mikrotitrační desky Automatizovaný „microsampler“ systém cytek K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie https://www.youtube.com/watch?v=L1UgdoP2aeg https://www.youtube.com/watch?v=7MFmbtIb8xA https://www.synbiobeta.com/read/one-lab-in-germany-is-using-robots- to-advance-computer-aided-synthetic-biology https://www.youtube.com/watch?v=ERDtmYddNkQ Incorporating Automation into a Flow Cytometry Workflow for Antibody Discovery The steps in a high-throughput fluorescence-microscopy experiment. Analysis http://www.stanford.edu/group/nolan/ http://www.stanford.edu/group/nolan/ Garry Nolan Peter Krutzik „Fluorescent cell barcoding“ Krutzik PO, Nolan Fluorescent cell barcoding in flow cytometry allows high-throughput drug screening and signaling profiling. Nat Methods. 2006 May;3(5):361-8. K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie Krutzik PO, Nolan Fluorescent cell barcoding in flow cytometry allows high-throughput drug screening and signaling profiling. Nat Methods. 2006 May;3(5):361-8. K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie Get the best out of your model FACS-based surface screen: • validated antibodies in 96w plates • several comercially available possibilities, we have gone for… - LEGENDScreen HUMAN 332 PE conjugated antibodies + ISOs - LEGENDScreen MOUSE 252 PE conjugated antibodies + ISOs - there are XY vials in LN - price of kit ≈ 1000 € (27k Kc) How to get the best of it all? Final workflow The optimal concentation issue HOW TO TEST IT: 10x serial dilution REQUIREMENTS: ◼ optimal resolution ◼ compatibility w/ PE Sample results EpCAM - marker of epithelial cells - commonly lost during EMT Sample result Cytometric bead array (CBA) ◼ Multiplexed Bead-Based Immunoassays ◼ flow cytometry application that allows users to quantify multiple proteins simultaneously Multiplex microsphere‐based flow cytometric platforms for protein analysis and their application in clinical proteomics – from assays to results ELECTROPHORESIS Volume 30, Issue 23, pages 4008-4019, 3 DEC 2009 DOI: 10.1002/elps.200900211 http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/elps.200900211/full#fig1 CBA CBA ◼ multiplexing capabilities ◼ speed ◼ incorporation of multiple assay formats ◼ rapid assay development and reasonable cost ◼ automation ex vivo flow cytometrie - limitace ◼ Ovlivnění některých vlastností buněk (morfologie, exprese znaků); ◼ neumožnuje dlouhodobější studie buněčného metabolismu a buněčných interakcí (komunikace, adheze) v přirozeném tkáňovém mikroprostředí; ◼ další: – nízká citlivost pro detekci vzácných buněčných subpopulací (1-10 buněk/ml ~ 5000 – 50000 buněk v 5 litrech krve dospělého člověka); – časově náročná příprava vzorku (hodiny, dny); – diskontinuita odebíraných vzorků. Cytometry part A 79A: 737-745, 2011 in vivo flow cytometry – základní principy ◼ Zobrazení buněk přímo v krevním nebo lymfatickém řečišti. ◼ Vizualizace pomocí CCD nebo CMOS kamery po ozáření konvenční mikroskopickou lampou nebo lasery. ◼ Detekce absorbce, fluorescence, Ramanova spektra, fototermálních nebo fotoakustických signálů. Cytometry part A 79A: 737-745, 2011 in vivo flow cytometry Cytometry part A 79A: 737-745, 2011 in vivo flow cytometry – bez značení ◼ Nahrávka videa pomocí vysokorychlostní CCD nebo CMOS kamery s vysokým rozlišením v režimu propustnosti nebo odrazu. ◼ Příklad: high-speed transmittance digital microscopy (TDM) ◼ Limity: hloubka tkáně. ◼ TDM může sloužit k navedení zdrojů záření pro další analýzu do určené oblasti. Cytometry part A 79A: 737-745, 2011 photoacoustic and photothermal imaging ◼ The photoacoustic effect was first discovered by Alexander Graham Bell in his search for a means of wireless communication.1 Bell succeeded in transmitting sound with an invention he called the “photophone,” which carried a vocal signal with a beam of sunlight that was reflected by a vocally modulated mirror. The sound could be recovered with an ordinary telephone receiver connected to a selenium cell illuminated by the light. Bell published the results in a presentation to the American Association for the Advancement of Science in 1880. The Photoacoustic Effect Benjamin T. Spike Physics 325 April 21, 2006 Schematic illustration of photoacoustic imaging Cytometry part A 79A: 737-745, 2011 ACS Nano 2010 4 (8), 4559-4564 In vivo flow cytometrie – detekce specifických signálů ◼ Detekce fotoakustických a fototermálních jevů Cytometry part A 79A: 737-745, 2011 in vivo flow cytometry - aplikace Shrnutí přednášky ◼ Příklady funkčních analýz ◼ „High-throughput“ průtoková cytometrie … ◼ … a uplatnění vícebarevné detekce a beads array ◼ sortrování chromozómů ◼ aplikace v mikrobiologii, hydrobiologii a studiu bezobratlých ◼ in vivo průtoková cytometrie Na konci dnešní přednášky byste měli: 1. vědět jakým způsoben je možné analyzovat buněčný cyklus. 2. umět navrhnout další parametr kombinovatelný s DNA analýzou. 3. znát příklady buněčných funkcí které je možné analyzovat na průtokovém cytometru. 4. vědět co jsou to fluorescenční proteiny a jaké jsou výhody jejich využití v buněčné biologii. 5. vědět co je to „high-throughput„ průtoká cytometrie …a jak se v ní může uplatnit princip vícebarevného značení. 6. znát základní principy měření a sortrování chromozómů pomocí průtokového cytometru; 7. mít představu o možných aplikacích průtokové cytometrie v mikrobiologii, hydrobiologii a studiu bezobratlých; 8. rozumět limitům a principům in vivo průtokové cytometrie. Na konci dnešní přednášky byste měli: 1. vědět jakým způsoben je možné analyzovat buněčný cyklus. 2. umět navrhnout další parametr kombinovatelný s DNA analýzou. 3. znát příklady buněčných funkcí které je možné analyzovat na průtokovém cytometru. 4. vědět co jsou to fluorescenční proteiny a jaké jsou výhody jejich využití v buněčné biologii. 5. vědět co je to „high-throughput„ průtoká cytometrie …a jak se v ní může uplatnit princip vícebarevného značení. 6. znát základní principy měření a sortrování chromozómů pomocí průtokového cytometru; 7. mít představu o možných aplikacích průtokové cytometrie v mikrobiologii, hydrobiologii a studiu bezobratlých; 8. rozumět limitům a principům in vivo průtokové cytometrie. K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie