Interakce proteinů s makromolekulami, interaktom C3210 Strukturní bioinformatika, podzim 2024 Protein-protein interakce (PPI) • Molekulární rozpoznávání – interakce biomakromolekul, interakce biomakromolekul s malými molekulami. • Základ všech biologických procesů v živých organismech. • Proteiny: strukturní, mechanické, biochemické, signální funkce. • Proteom je mnohem komplexnější než genom (alternativní sestřih, posttranslační modifikace, protein-protein interakce). • Protein-protein interakce: ovlivňují funkci a aktivitu proteinů. • Interaktom: souhrn všech PPI odehrávajících se v určité buňce, organismu, tkáni atd.; kompletní mapa interakcí. https://www.ebi.ac.uk/training/online/courses/network-analysis-of-protein-interaction-data- an-introduction/ Kvasinkový interaktom (získaný pomocí Y2H) Protein-protein interakce (PPI) • PPI – časově a prostorově heterogenní. • Některé PPI jsou permanentní, některé přechodné. • Některé proteiny musejí být modifikovány (posttranslační modifikace), aby mohly interagovat. • Regulace interakcí je jednou z rolí PTM. • PPI – proteiny se musejí fyzicky potkat. Nutná účast transportních mechanismů. Pokud se proteiny nepotkají, nebudou interagovat, i kdyby pro to měly všechny fyzikálněchemické předpoklady. • Regulace PPI pomocí různé exprese proteinů v různých tkáních a buňkách. • Výzkum interaktomu je mnohem náročnější než výzkum proteomu. https://www.ebi.ac.uk/training/online/courses/network-analysis-of-protein-interaction-data- an-introduction/ Lidský interaktom (získaný pomocí Y2H) Klasifikace PPI • Různé možnosti klasifikace PPI. • Homooligomerní/heterooligomerní komplexy (oligomerizace proteinových podjednotek je forma PPI). • Obligátní/fakultativní komplexy (proteiny tvořící obligátní komplex nejsou schopny existovat ve stabilní formě samostatně). • Přechodné/permanentní komplexy (klasifikace fakultativních komplexů, přechodné mohou dočasně disociovat, permanentní se po prvotní interakci už nerozdělí). Interakční rozhraní • PPI – proteiny interagují pomocí svých rozhraní. • Analýza fyzikálněchemických vlastností rozhraní protein-protein je velmi důležitá pro studium interakcí (vodíkové vazby, solné můstky, rozložení náboje, flexibilita, tvar rozhraní, komplementarita atd.) • Různé typy interakcí – různá rozhraní: permanentní/obligátní komplexy mívají hydrofobnější rozhraní než komplexy přechodné, které naopak preferují vodíkové vazby a solné můstky. Obligátní komplexy mívají sekvenčně více konzervované rozhraní. https://pisite.sb.ecei.tohoku.ac.jp/cgi-bin/top.cgi Databáze známých rozhraní Databáze známých rozhraní Databáze známých rozhraní Experimentální určení PPIs • Detekce PPI – „low-throughput“ a „highthroughput“ metody. • SPR, ITC, SAXS, NMR, Cryo-EM, CD (cirkulární dichroismus)… • „Pull-down assay“– afinitní purifikace v malém, jeden protein imobilizován na matrici, ostatní proteiny v roztoku, detekce pomocí SDS-PAGE. • Gelová permeační chromatografie – separační metoda, separace proteinů podle velikosti, pokud proteiny tvoří komplex, je detekován pík komplexu. • FRET (Förster Resonance Energy Transfer) – přenos energie mezi dvěma sousedícími fluorescenčními molekulami, pokud proteiny interagují, dojde k přenosu energie z donoru na akceptor. Reprinted from "GlutathioneS-transferase (GST) pull-down assay", Copyright 2021 by BioRender. Experimentální určení PPIs • Detekce PPI – „low-throughput“ a „highthroughput“ metody. • SPR, ITC, SAXS, NMR, Cryo-EM, CD (cirkulární dichroismus)… • „Pull-down assay“– afinitní purifikace v malém, jeden protein imobilizován na matrici, ostatní proteiny v roztoku, detekce pomocí SDS-PAGE. • Gelová permeační chromatografie – separační metoda, separace proteinů podle velikosti, pokud proteiny tvoří komplex, je detekován pík komplexu. • FRET (Förster Resonance Energy Transfer) – přenos energie mezi dvěma sousedícími fluorescenčními molekulami, pokud proteiny interagují, dojde k přenosu energie z donoru na akceptor. https://www.creative- biostructure.com/custom-size-exclusion- chromatography-service-259.htm „High-throughput“ metody • Detekce PPI – „low-throughput“ a „highthroughput“ metody. • Y2H (kvasinkový dvouhybridový systém) – interakce proteinů („bait“ a „prey“) aktivuje expresi reportérového genu (růst na specifickém médiu/barva kolonie). • DNA-binding domain (BD) + activation domain (AD), spájení dvou haploidních buněk kvasinek. David P. Clark, Nanette J. Pazdernik, in Biotechnology (Second Edition), 2016 https://www.ebi.ac.uk/training/online/co urses/protein-interactions-and-their- importance/ „High-throughput“ metody • Detekce PPI – „low-throughput“ a „high-throughput“ metody. • AP-MS (afinitní purifikace-hmotnostní spektrometrie) – afinitní purifikace s využitím imobilizovaného proteinu, následovaná štěpením a identifikací interagujících proteinů pomocí MS. Problémy: • Y2H – pozorována interakce proteinů, které by se normálně nepotkaly (z různých buněk, z různých tkání, z různých buněčných kompartmentů). Problém PTM! Obecně problém heterologní exprese v kvasinkách. • AP-MS – problém s přechodnými a/nebo slabými interakcemi, rovněž možná falešná pozitivita jako u Y2H, metodický problém „rozpoznatelnosti“ proteinů pomocí MS. https://www.ebi.ac.uk/training/online/co urses/protein-interactions-and-their- importance/ Predikce PPIs Problémy: • Y2H – pozorována interakce proteinů, které by se normálně nepotkaly (z různých buněk, z různých tkání, z různých buněčných kompartmentů). Problém PTM! Obecně problém heterologní exprese v kvasinkách. • AP-MS – problém s přechodnými a/nebo slabými interakcemi, rovněž možná falešná pozitivita jako u Y2H, metodický problém „rozpoznatelnosti“ proteinů pomocí MS. • Výzkum interaktomu je mnohem náročnější než výzkum proteomu. • Limitace experimentálních metod vedly ke vzniku mnoha výpočetních metod predikce PPI. Predikce PPIs • Limitace experimentálních metod vedly ke vzniku mnoha výpočetních metod predikce PPI. Příklady: • Metody založené na simulacích – MD simulace, docking; využívány ke studiu dynamiky a síly interakcí. • Metody využívající evoluční konzervovanost interakcí – PPIs studovaného organismu mohou být predikovány s využitím znalosti ortologních genů jiného organismu. • Metody založené na fúzi domén/genů – geny interagujících proteinů se mohou spojovat a vytvořit jeden ORF. Z existence fúzních (vícedoménových) komplexů u jednoho organismu můžeme usuzovat, že dané proteiny budou interagovat i u jiného organismu, kde jsou samostatné. Vysoce přesné. Protein-protein dokování • Protein-protein dokování – co známe? • „Free“ docking – máme k dispozici struktury samostatných proteinů (nebo jejich blízkých homologů). • „Template-based docking“ – máme k dispozici struktury homologních komplexů. Můžeme vycházet i pouze ze sekvence; pokud je nalezen dobrý templát komplexu, poskytuje velmi přesné predikce. Bez dobrého templátu selže. „Billions of protein conformations are evaluated, often through the use of an FFT-based algorithm. Final models of the heterodimer are ranked and minimized.“ PPI databáze https://www.ebi.ac.uk/intact/home Vizualizační nástroje • Experimenty i predikce generují velká množství „interakčních“ dat. • Souhrn proteinů a jejich interakcí = PPIN („protein-protein interaction network“). • Pro práci s PPINs jsou nezbytné intuitivní a interaktivní vizualizační nástroje. • Vizualizační nástroje mohou být součástí databází nebo jsou dostupné jako samostatný software. https://string-db.org/ Vizualizační nástroje • Experimenty i predikce generují velká množství „interakčních“ dat. • Souhrn proteinů a jejich interakcí = PPIN („protein-protein interaction network“). • Pro práci s PPINs jsou nezbytné intuitivní a interaktivní vizualizační nástroje. • Vizualizační nástroje mohou být součástí databází nebo jsou dostupné jako samostatný software. https://cytoscape.org/ „Cytoscape is the most popular software for visualization, analysis, and modelling of protein interaction networks.“ https://cytoscape.org/screenshots.html Interakce protein-DNA • Molekulární rozpoznávání – interakce biomakromolekul, interakce biomakromolekul s malými molekulami. • Základ všech biologických procesů v živých organismech. • Proteiny: strukturní, mechanické, biochemické, signální funkce. • Interakce protein-DNA jsou nezbytné pro replikaci, transkripci, translaci, rekombinaci, opravy DNA, sbalování DNA, modifikace DNA. • DNA je negativně nabitá molekula; interakce protein-DNA jsou většinou nekovalentní (vodíkové vazby, van der Waalsovy interakce, iontové vazby). • Proteiny vázající DNA mívají specifické „DNAbinding“ domény. Interakce protein-DNA • Molekulární rozpoznávání – interakce biomakromolekul, interakce biomakromolekul s malými molekulami. • Základ všech biologických procesů v živých organismech. • Proteiny: strukturní, mechanické, biochemické, signální funkce. • Interakce protein-DNA jsou nezbytné pro replikaci, transkripci, translaci, rekombinaci, opravy DNA, sbalování DNA, modifikace DNA. • DNA je negativně nabitá molekula; interakce protein-DNA jsou většinou nekovalentní (vodíkové vazby, van der Waalsovy interakce, iontové vazby). • Proteiny vázající DNA mívají specifické „DNAbinding“ domény, které obsahují „DNAbinding“ motivy. „Helix-turn-helix“ motiv. První objevený, váže se do velkého žlábku. Vyskytuje se ve stovkách proteinů vázajících DNA. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK26806/ Interakce protein-DNA Protein-DNA interakce: • Sekvenčně specifické – DNA-vázající doména proteinu rozeznává a váže specifickou sekvenci bází v DNA. • Sekvenčně nespecifické – protein nerozeznává konkrétní sekvenci, váže se náhodně, vazba na cukr-fosfátovou kostru, relativně slabé, ale důležité! Nespecifická interakce histonu s DNA Specifická interakce TATA-vázajícího proteinu s DNA Restrikční endonukleasy specificky rozeznávají palindromy MOTAL ATOM, UCHEM V MECHU, JELENOVI PIVO NELEJ, KUNA NESE NANUK Predikce vazebných míst Predikce míst pro vazbu DNA v proteinu: • Metody založené na sekvenci – sekvenční alignment, srovnání s homologními sekvencemi se známým vazebným místem (rezidui podílejícími se na vazbě). Problém – nižší sekvenční konzervovanost vazebných míst. • Metody založené na struktuře – analýza struktury proteinu, srovnání se známými strukturami vazebných míst. http://biomine.cs.vcu.edu/servers/DRNApred/ Predikce míst pro vazbu proteinu v DNA: • Náročnější, čtyři podobné nukleotidy vs. 20 (velmi) rozdílných aminokyselin, sekvence DNA je „nudnější“, je těžké odhalit vazebný „sekvenční vzor“. • Znalosti z experimentů – mnoho informací o vazebných preferencích (DNA sekvenci) restrikčních enzymů, pro tyto analýzy existují volně dostupné nástroje. NEBcutter: a program to cleave DNA with restriction enzymes NEBcutter V2.0 http://nc2.neb.com/NEBcutter2/ Predikce vazebných míst Časté zaměření na vyhledávání TFBSs v DNA – vazebných míst pro transkripční faktory. Využití sekvenčních a strukturních znaků. Interakce protein-polysacharid • Molekulární rozpoznávání – interakce biomakromolekul, interakce biomakromolekul s malými molekulami. • Základ všech biologických procesů v živých organismech. • Proteiny: strukturní, mechanické, biochemické, signální funkce. • Proteiny, které specificky rozpoznávají sacharidy, se označují jako lektiny. • Interakce protein-monosacharid je většinou slabá (řešení: multivalence). • Interakce protein-polysacharid: exo/endo lektiny. • Exo lektiny: vážou terminální jednotky polysacharidů. • Endo lektiny: vážou vnitřní jednotky polysacharidů. Interakce protein-polysacharid • Exo lektiny: vážou terminální jednotky polysacharidů. • Endo lektiny: vážou vnitřní jednotky polysacharidů. • Endo lektiny: využívají různé strategie pro posílení interakce. • 1) Na polysacharid se váže více lektinů současně. • 2) Opakovaná asociace/disociace lektinu. Lektin se opakovaně váže, „klouže“ po polysacharidu, ale „neodplave“. • 3) Rozpoznávání více organizovaných struktur polysacharidů, které pomáhají vazbě. • Endo lektiny často kombinují a využívají všechny přístupy. Databáze polysacharidů/lektinů http://glyco3d.cermav.cnrs.fr/home.php http://glyco3d.cermav.cnrs.fr/home.php Databáze polysacharidů/lektinů Databáze polysacharidů/lektinů https://unilectin.unige.ch/ Lektiny vázající chitin – uplatnění v obraně před patogeny obsahujícími chitin (plísně, kvasinky). Nespecifické interakce protein-polysacharid • Nespecifické interakce proteinpolysacharid mají významné uplatnění v potravinářském průmyslu. • Vlastnosti proteinů v potravinách (rozpustnost, pěnivost, tvorba gelů) jsou významně ovlivněny interakcemi s polysacharidy. • Interakce přitažlivé x odpudivé. • Vznik rozpustných x nerozpustných komplexů. • Vznik vícefázových systémů. • Role náboje (kladný/záporný) – výrazný vliv pH. Nespecifické interakce protein-polysacharid • Nespecifické interakce proteinpolysacharid mají významné uplatnění v potravinářském průmyslu. • Vlastnosti proteinů v potravinách (rozpustnost, pěnivost, tvorba gelů) jsou významně ovlivněny interakcemi s polysacharidy. • Interakce přitažlivé x odpudivé. • Vznik rozpustných x nerozpustných komplexů. • Vznik vícefázových systémů. • Role náboje (kladný/záporný) – výrazný vliv pH. Take-home message • Protein-protein interakce • Interaktom • Klasifikace protein-protein interakcí • Experimentální určení (náročné) PPIs x predikce PPIs • Existují databáze a vizualizační nástroje • Protein-DNA interakce • „DNA-binding“ domény; „DNA-binding“ motivy. • Sekvenčně specifické x nespecifické • Predikce vazebných míst založená na struktuře/sekvenci • Protein-polysacharid interakce • Exo/endo lektiny • Strategie pro posílení interakcí • Nespecifické interakce mají velký význam v potravinářském průmyslu Použitá a doporučená literatura