NMR spektroskopie
Lukáš Maier
lmaier@mail.muni.cz
 Izolace a identifikace přírodních látek, syntéza nových molekul, studium reakčních mechanismů…
… se neobejde bez analytických nástrojů:
 1) separační metody: krystalizace, filtrace, destilace, chromatografie (TLC, plynová, kapalinová…)
 2) strukturní, fyzikálně-chemické metody: spektroskopie
Studium struktury organických molekul
 historie: bod tání/varu, index lomu, rozpustnost, důkazní reakce funkčních skupin a jednotlivých
prvků, polarimetrie, elementární analýza
 UV, IR (Raman) – velmi omezené informace o struktuře (přítomnost standardních funkčních skupin
–CN, –COR, –N3 ….)
 Robert Burns Woodward – (NP – 1964 - "for his outstanding achievements in the art of organic
synthesis„) - určení struktur mnoha přírodních látek pomocí totálních syntéz a aplikací jednoduchý
empirických pravidel UV spektroskopie
2
 IR spektrum
 2 karbonylové skupiny – 1
charakteristická vibrace
3
 RTG difrakce – zcela zásadní význam při studiu struktur malých i velkých (bio)molekul,
relativní/absolutní stereochemie, informace o chování látek (dynamické jevy) v roztoku zcela chybí
 struktura vitamínu B12 –vyřešena pomocí x-ray difrakce – 1948-1955, D.M. Hodkin (N.C. -1964) - "for
her determinations by X-ray techniques of the structures of important biochemical substances".
Studium struktury organických molekul
 typické zobrazení struktury vyřešené pomocí x-ray
difrakce
4
Studium struktury organických molekul
 MS – hmotnostní spektrometrie, určení molekulární struktury (sumární vzorec) – ale pro rozlišení
regioisomerů, diastereomerů a enantiomerů je MS nevhodnou metodou, velký význam má dnes
HR-MS (MS s vysokým rozlišením) v kombinaci s jemnými ionizačními technikami, která poskytuje
informace o identitě molekuly
hexan (C6H14; MW = 86)
 Určení struktury však může být komplikováno fragmentací, nestabilitou molekul při přechodu do
plynné fáze apod.
5
NMR spektroskopie
 NMR spektroskopie – Nukleární Magnetická Rezonance – zcela zásadní a unikátní spektrální metoda, s
možností pracovat se vzorky v plynném, kapalném a pevném stavu
 nedestruktivní, detailní informace o struktuře látek, dynamickém chování molekul – tautomerie,
konformační pohyb, nekovalentní interakce, stereochemie
 určení 3D struktury proteinů za fyziologických podmínek včetně dynamického chování
 studium difúzních jevů
 NMR v pevné fázi se využívá při studiu různých materiálů, farmaceuticky aktivních látek – studie
krystalových polymorfů apod.
 MRI – magnetic resonance imaging - medicinální aplikace – diagnostika
6
NMR spektroskopie
v NMR jde o absorbci radiofrekvenčních vln magneticky aktivními jádry ve vysokém magnetickém poli
1H, 13C, 19F, 31P, 15N, 11B, 29Si, 27Al, 105Pd, 195Pt
 spektroskopie je obecně založena na interakci hmoty s elektromagnetickým zářením
7
NMR spektroskopie
 některá atomová jádra (izotopy) mohou mít spin – nenulový jaderný spin (rotace kolem vlastní
osy), který produkuje magnetický dipól moment
rezonanční podmínka:
ΔE = hϒBo/2 π = hν
1H,13C, 19F, 31P, 15N : I = ½
11B = I = 3/2
14N, 2H : I = 1
I > ½ kvadrupolární jádra – chování v NMR spektroskopii je
mnohem komplikovanější
12C,16O, 32S: I = 0 - NMR neaktivní jádra – nedají se měřit
Bo – externí magnetické pole (Tesla)
9.5 T = 400 Mhz NMR stroj
ϒ – magnetogyrická konstanta –
vlastnost daného jádra,
čím větší tím je jádro v NMR citlivější
ΔE pro 1H při 400 Mhz je 3.8x10-5 Kcal/mol =
Nα/Nβ = 1.000064 !!! – velmi malý rozdíl v
populacích
→ NMR je velmi necitlivá metoda
8
NMR spektroskopie
jádra v magnetickém poli
vytvoří makroskopickou
magnetizaci
krátkým pulsem (µsec) radiových vln (o širokém
spektru frekvencí) se jádra ozáří a vektor
magnetizace začne rezonovat (precesní pohyb)
FID – časová
závislost
Fourierova
transformace
frekvenční závislost - NMR
spektrum
9
Stručná historie vývoje NMR
1946 – první NMR spektrometr 30 Mhz
1961 – první FT-NMR spektrum vyrobený v ČSR (Tesla Brno, J.Dadok)
1966 – aplikace Fourierovy transformace v NMR
1975 – 2D NMR techniky
1985 – vyřešena první 3D struktura proteinu pomocí NMR
Nobelovy ceny: 1943 – O. Stern (Fyzika)
1944 – O. Rabi (Fyzika)
1952 – E. Bloch, F. Purcell (Fyzika)
1987 – K. Alexander Müller (Fyzika)
1991 – R. Ernest (Chemie)
2002 – K. Wȕtrich (Chemie)
2003 – P. Lauterbur, P. Mansfield (Fyziologie a medicína)
Supravodivý magnet
(200Mhz) Tesla Brno
10
Vývoj instrumentace NMR
Vyšší magnetické pole, větší rozlišení a citlivost
cca 60 let vývoje
11
Citlivost 1H NMR experimentu pro standardní 0.1% roztok ethylbenzenu
DOI: (10.1021/acs.macromol.6b02736)
Vývoj instrumentace NMR
12
NMR v organické chemii
První strukturní problém vyřešen pomocí 1H NMR spektroskopie (1955)
13
Základní NMR parametry
 Chemický posun
 Počet signálů ve spektru
 Relativní integrální intensita
 Multiplicita signálu -interakční konstanty
 Polo-šířka signálu – relaxace/dynamické jevy
14
Z jednoho spektra lze vyčíst obrovské množství informací
Základní NMR parametry – Chemický posun
 Chemický posun = δ (ppm)
δ = frekvence signálu - frekvence standardu (Me4Si v
Hz)/frekvence spektrometru (v MHz)
→ nezávislý na použitém poli (frekvenci spektrometru)
15
Základní NMR parametry – Chemický posun
 Chemický posun = δ (ppm), závisí na rozpouštědle, teplotě, pH, iontové síle apod.
16
Základní NMR parametry – Chemický posun
 Chemický posun je velmi důležitou kvalitativní veličinou – na každé jádro působí
okolní jádra a elektrony svým magnetickým polem → strukturní informace
 Efekt elektronegativity na chemický posun methyl skupiny:
rostoucí elektronegativita, větší odstínění, větší chemický posun
chemický posun odráží elektronické a stereochemické jevy, intra a
intermolekulární interakce (H-vazby, π-π interakce, interakce s rozpouštědlem…)
17
Základní NMR parametry – Chemický posun
 13C NMR chemické posuny
 Efekt elektronegativity + stínění elektrony na chemický posun methyl skupiny:
18
13C NMR substituovaných benzochinonů
13C NMR, acetone-d6
19
Základní NMR parametry – Chemický posun
 13C NMR spektrum
 2 karbonylové skupiny – 1 charakteristická vibrace
20
Základní NMR parametry – počet signálů/intenzita
 Počet signálů ve spektru odráží symetrii molekuly – rozlišení isomerů apod.
všech 6 atomů H i C je ekvivalentních – ztotožnitelných operací symetrie →
pouze jeden signál v 1H i 13C spektru
zavedením substituentu na jádro se sníží
symetrie a počet aromatických signálu bude 3 –
ortho, meta, para a jejich integrální intenzita v
poměru, 2:2:1
o
m
p
zavedením substituentu na jádro se opět změní
symetrie a počet aromatických signálu bude 2, v
poměru 2:2 → 1:1
3 1H signály
acylací do ortho polohy se opět změní symetrie
a všechny polohy jsou chemicky a magneticky
neekvivalentní - počet aromatických signálu
bude 4, v poměru 1:1:1:1
Pomocí IR nebo MS velmi obtížně či nerozlišitelné 21
Základní NMR parametry – multiplicita
 neekvivalantní jádra, skupiny atomů navzájem interagují – jemná struktura
spekter - multiplety
 Počet linií v multipletu = 2 I * n+1
 I – spinové číslo, ½ pro 1H
 n – počet sousedících atomů
 → pro 1H = n + 1
2 + 1 = 3 – triplet t
3 + 1 = 4 – quartet q
3JH-H = 7 Hz
22
Základní NMR parametry – multiplicita
 Počet linií a jejich intenzita – Pascalův trojúhelník
t
q
sep
d
t
q
d
s
Hb-Ha, ale i Hb-Hc → dd (nebo
multiplet (4 linie) ne t, protože
Ha ≠ Hc
dd
d
 Komplexní molekuly mohou mít velmi komplexní spektrum
dd
23
Základní NMR parametry – multiplicita
 chemicky ekvivalentní,
magneticky neekvivalentní
 diastereotopicita
24
Základní NMR parametry – multiplicita
 13C-1H interakce se během měření potlačí
(decoupling) a 13C-13C interakce jsou téměř
nepozorovatelné díky izotopovému zastoupení
izotopu 13C (1.1 %)
 → 13C spektra jsou obvykle jednoduše
interpretovatelná (singlety), pokud nejsou štěpeny
jiným NMR aktivním jádrem: 11B, 19F, 31P apod. 3x – OCH3
25
Základní NMR parametry – multiplicita
 undecoupled 13C NMR spektrum s 1H interakcemi
26
Základní NMR parametry – multiplicita
 13C-{1H} NMR spektrum
27
Dynamické chování molekul
 konformační pohyb cyklohexanu
 při 0°C je inverze kruhu velmi rychlá a pozorujeme průměrný signál
 při -90°C je pohyb „zastaven“ a pozorujeme dva typy signálu Hax a Heq
28
Dynamické chování molekul
 Studium rotace okolo σ C-N vazby
X-ray
29
Teplotně závislá 1H NMR spektra
30
NOESY spektra při 263K
Konformační výměna H signálů při nižší teplotě
Exchange NOE/standardní NOE interakce
31
NOESY spektra při 193K
Pří velmi nízké teplotě je rotace
„zastavena“ a v NMR spektrech
je vidět pouze sada
standardních NOE interakcí
32
Výpočet velikosti bariéry rotace z NMR parametrů
Δν = 38.95 Hz (H-5´/H-6´)
Tc = 293K
kc = 86.47 s-1
33
2D NMR spektroskopie
 1D 1H NMR spektrum proteinu
 Příliš mnoho signálu, nízké rozlišení,
interpretace NMR spektra nemožná (jen
částečná)
2D, 3D… NMR experimenty
Několik desítek používaných 2D experimentů - COSY, NOESY, DOSY,1H-13C HSQC, 1H-13C HMBC,s….
3D NOESY-HSQC, NOESY-TOCSY…4D…5D!!!
34
2D NMR spektroskopie
 I malé organické molekuly, mohou mít velmi komplikované spektrum – expanze do více dimenzí
poskytne detailnější informace
35
1H-13C – J-edited HSQC spektrum
1H-13C – J-edited HSQC
C-H konektivita
+ rozlišení -CH, -CH3 vs. -CH2 skupin
1H – na X atomu ≠ 13C
→ OH skupina
36
NOESY spektrum
 NOE interakce jednotlivých
protonů přes prostor ~ 5Å
 Stereochemické informace
37
2D NMR spektroskopie
DOSY– Diffussion Orientated SpectroscopY
 Difúzní koeficient souvisí s velikostí a
tvarem molekuly, tzn. lze zjistit
molekulovou hmotnost např. polymerů
apod.
38
Určení struktury pomocí NMR
očekávaný produkt
56 %
78.2 ppm
82.22
ppm
86.91
ppm
75.4 ppm
86.1 ppm
89.7 ppm
key 1H-13C
HMBC
interaction
39
Určení struktury pomocí NMR
Desired product
isolated when NaHMDS, PhCH3,
was used (37%)
thermodynamic enolate
kinetic enolate
desired triflate always major product, ~ 60 % yield
40
1H NMR
41
1H NMR
42
1H NMR
Typical area of C-H
double bond
chemical shifts
43
19F NMR
44
1H-13C J-edited HSQC
45
Příklady neočekávaného produktu
72%
49
50
Jednoduchá aplikace ve farmacii a biologii - ligand-protein binding
51
Jednoduchá aplikace ve farmacii a biologii - ligand-protein binding
52
Jednoduchá aplikace ve farmacii a biologii - ligand-protein binding
53
NMR spektroskopie v pevné fázi – solid state NMR
Kapalná fáze vs. pevná fáze
Směs volné báze a hydrochloridu
54
NMR spektroskopie v pevné fázi – solid state NMR
Určení typu krystalového polymorfu –
extrémně důležité ve farmacii.
55
Konstrukce NMR spektrometru
56
Nevýhody
 relativně velké nároky na prostor
 vysoká pořizovací cena
 relativně vysoké provozní náklady
 časová náročnost měření/interpretace dat
 nízká citlivost
Výhody
 nedestruktivní
 v kapalné i pevné fázi
 detailní strukturní informace
 studium dynamických procesů
 C8950 NMR - Strukturní analýza
 C5320 Theoretical concepts of
NMR
 C6770 NMR Spectroscopy of
Biomolecules
 C7998 Základy experimentální
NMR
57