Kapilární elektroforéza a izotachoforéza Miroslava Bittová podzim 2024 Elektromigrační metody C5060 - Metody chemického výzkumu = souhrnné označení pro skupinu analytických metod, u nichž dochází v roztoku k separaci látek (iontů) na základě jejich různé pohyblivosti vlivem působení stejnosměrného elektrického pole = jednotlivé techniky se liší principem, instrumentálním provedením, použitím pracovního elektrolytu apod. Elektroforéza = ve stejnosměrném homogenním elektrickém poli putují nabité částice v roztoku k opačně nabitým elektrodám a dochází k jejich rozdělení = nejvýznamnější elektrokinetický jev Elektroosmóza = pohyb kapaliny v křemenných kapilárách směrem k záporně nabité elektrodě (ke katodě) = elektroosmotický tok - praktické využití například při odvodňování zeminy, domů apod. Sedimentační potenciál = sedimentací elektricky nabitých částic ve sloupci kapaliny vzniká elektrický potenciálový rozdíl - praktické využití tohoto jevu je téměř nulové Potenciál proudění = rozdíl elektrických potenciálů v roztoku způsobený mechanickou silou (např. tlakem) - podobný efekt lze pozorovat u vodopádů, kdy v místě s největší mechanickou silou může docházet k ionizaci vzduchu za vzniku ozónu nebo při proudění krve v kapilárách organizmů, kde podmiňuje vznik jednoho z píků elektrokardiogramu Základní elektrokinetické jevy Elektromigrační metody 2 = souhrnné označení pro skupinu analytických metod, u nichž dochází v roztoku k separaci látek (iontů) na základě jejich různé pohyblivosti vlivem působení stejnosměrného elektrického pole = jednotlivé techniky se liší principem, instrumentálním provedením, použitím pracovního elektrolytu apod. Kapilární zónová elektroforéza (CZE) Kapilární izotachoforéza (ITP) Kapilární gelová elektroforéza (CGE) Kapilární izoelektrická fokusace (CIEF) Kapilární techniky Elektromigrační metody papírové – nízká citlivost a reprodukovatelnost (v závislosti na kvalitě papíru) gelové – nejčastěji polyakrylamidový nebo agarózový gel - analýza proteinů, DNA 3 Kapilární micelární elektrokinetická chromatografie (MEKC) Kapilární elektrochromatografie (CEC) Separace čistých a osmiem značených oligonukleotidů A15-1T a A15-2T na polyakrylamidovém gelu (barveno stříbrem) Kapilární kombinované techniky CZE analýza polyfenolických látek moučky hroznových semínek: 1 resveratrol, 2 katechin, 3 epikatechin, 4 rutin, 5 kyselina ferulová, 6 kyselina p-kumarová, 7 myricetin, 8 kvercetin, 9 kyselina galová Plošné techniky CA B Na nabitou částici v roztoku působí 2 opačně orientované síly: 1. síla elektrického pole Fe Fe = Q * E Q – celkový náboj, součet nábojů na povrchu částice [C] E – intenzita konstantního elektrického pole [V/m] 2. frikční (třecí) síla prostředí Ff Ff = f * v – viskozita prostředí, r – poloměr kulové částice, v – rychlost pohybu iontu pro kulové částice je frikční síla dána Stokesovým zákonem f – frikční koeficient v – rychlost pohybu iontu Ff = 6 *  *  * r * v Fe = - Ff Elektromigrace 4 Elektroforetická rychlost v = rychlost pohybu iontu, je přímo úměrná intenzitě elektrického pole (E) - směr pohybu je dán znaménkem jeho náboje a orientací elektrického pole v = E * μ = U/l * μ E – intenzita elektrického pole [V/m] μ – elektroforetická mobilita [m2V-1s-1] U – vložené napětí [V] l – velikost gradientu napětí [m] E * Q v = 6 *  *  * r Q – celkový náboj – viskozita prostředí r – poloměr kulové částice v – rychlost pohybu iontu - z rovnosti působících sil pak vyplývá … Fe = - Ff Elektroforetická rychlost a pohyblivost Efektivní pohyblivost (mobilita) μeff = součet pohyblivostí jednotlivých iontových forem, vynásobených příslušným molárním zlomkem μ eff =  μi * xi μeff,cit = μ * x + μ * x + μ * x + μ * xH3Cit H3Cit H2Cit- H2Cit- HCit2HCit2- Cit3-Cit3ovlivňování rovnovah vede k cíleným změnám v efektivních elektroforetických mobilitách Elektroforetická pohyblivost (mobilita) μ = kvalitativní veličina ionogenních látek, charakteristická pro dané prostředí a teplotu (při jednotkové intenzitě el. pole) 5 Elektroforetická rychlost a pohyblivost S rostoucí koncentrací elektrolytu klesá elektroforetická pohyblivost iontu Změna vodivosti v důsledku ředění roztoku souvisí se změnami v disociaci molekul a se změnami interakcí mezi ionty a molekulami rozpouštědla, resp. elektrolytu. Iontová pohyblivost μ0 = elektroforetická pohyblivost extrapolovaná na nulovou iontovou sílu - závislá pouze na teplotě a použitém rozpouštědle - s rostoucí teplotou se iontová pohyblivost zvyšuje Z Debye-Hückelovy teorie plyne, že kolem každého iontu v roztoku se vytváří iontová sféra, čímž dochází k pokles volných iontů. Iontová síla I = charakterizuje celkovou „koncentraci náboje“ jako sumu přes všechny ionty v roztoku, kdy pro zředěné roztoky platí: I = 0,5  ci * zi 2 6 Elektrolyty Elektrolyty = roztoky solí, kyselin a zásad, které vedou elektrický proud V elektrolytech je přenos elektrického náboje zároveň přenosem hmoty mění se složení elektrolytu v okolí elektrod vlivem probíhajících chemických reakcí Pufr = tlumivý roztok = roztok, který přidáním kyseliny nebo zásady výrazně nezmění své pH - většinou roztoky konjugovaných acidobazických párů, slabých kyselin a bází - např. kyselina octová/octan, kyselina boritá/boritan, amoniak/amonná sůl apod. Pufrační kapacita = množství silné kyseliny nebo báze, jejíž přídavek do 1 litru pufru vyvolá jednotkovou změnu pH - největší pufrační kapacita při pH = pKa - mění se s ředěním, přídavkem soli a teplotou rozsah pufru = pKa  1 Hlavní úlohou pufrů je umožnit průchod elektrického proudu a udržovat vhodné pH prostředí pro separaci dochází k migraci látek Kritéria výběru vhodného pufru: ✓ výběr podle pracovní oblasti pH ✓ čistota a inertnost ✓ iontová síla a rozpustnost ✓ UV absorpce ✓ toxicita ✓ cena 7 Příprava, skladování a zacházení s pufrem: ✓ výběr pufru, příprava roztoku o zvolené koncentraci a pH ✓ kontrola, případně úprava pH na kalibrovaném pH-metru ✓ použití čerstvých roztoků - hrozba mikrobiální kontaminace ✓ možnost zmražení – méně doporučovaná ✓ dodržovat sterilní podmínky - kontaminace odběrem – např. špičky Elektrolyty Mezi nejběžněji používané elektrolyty v elektromigračních metodách patří: 8 Elektrolyty = roztoky solí, kyselin a zásad, které vedou elektrický proud Biologické pufry = zwitteriontové pufry, označované jako „Good buffers“ (N. E. Good et al 1966) základem je N-substituovaný taurin nebo glycin ✓ rozsah použití pH 5 – 9 ✓ inertní vůči enzymatickému působení ✓ netoxické vůči buňkám, neprostupují membránou ✓ neabsorbují v UV-Vis oblasti Směsné pufry = kombinují více složek ✓ TBE pH 8.3 – Tris, kyselina boritá, EDTA ✓ TAE pH 8.3 – Tris, kyselina octová, EDTA ✓ Britton-Robinsonův pufr - univerzální 2 - 12 kyselina boritá, octová, fosforečná + NaOH Elektrolyty 9 1936 – Arne Wilhelm Kaurin Tiselius – první elektroforetická separace proteinů krevního séra - Nobelova cena za chemii (1948) 1967 – Stellan Hjertén – sestrojil první plně automatizovaný systém pro kapilární elektroforézu (kapilára s průměrem 1-3 mm) 1981 – James W. Jorgenson a Krynn D. Lukacs – první elektroforetická separace různých iontů (aminokyselin, dipeptidů, aminů) zónovou elektroforézou ve velmi tenké kapiláře o průměru 75 μm A. Tiselius S. Hjertén J. Jorgenson K. Lukacs Elektromigrační metody - vývoj 10 = moving boundary electrophoresis = technika pohyblivého rozhraní - separace analytů v prostředí homogenního jednoho základního elektrolytu (background electrolyte - BGE) o konstantním složení - separace probíhá za konstantního napětí Instrumentace: ✓ separační kapilára ✓ zdroj separačního napětí ✓ vialky s pufrem, v nichž jsou elektrody a konce kapilár ✓ detektor Kapilární zónová elektroforéza 11 - vyrobena z taveného křemene (fused-silica capillary) - vnitřní průměr 10 – 200 μm, vnější průměr 350 – 400 μm - délka dle požadavků - 10 – 100 cm - vnější vrstva polyimidu (15 μm) – chrání před mechanickým poškozením - odstranění části polyimidu = detekční okénko pro UV-Vis detekci Separační kapilára = electroosmotic flow - EOF - je důsledkem náboje vnitřního povrchu křemenných kapilár - disociace silanolových skupin na stěně kapiláry jí uděluje záporný náboj - po sepnutí elektrického pole dochází k pohybu nabitých částic a tím i k pohybu celé kapaliny 14 Elektroosmotický tok Elektroosmotický tok 12 Silanolové skupiny přitahují kationty elektrolytu a vzniká elektrická dvojvrstva, kterou tvoří: Sternova (Helmholtzova) = částečně fixovaná ke stěně kapiláry Gouy –Chapmanova = difúzní, volná výměna s ostatními ionty roztoku Elektroosmotický tok - díky EOF lze stanovit kationty i anionty v jedné analýze - slouží k mobilizaci zón zakoncentrovaných izoelektrickou fokusací - vysoká rychlost EOF může zapříčinit nedostatečnou separaci kationtů - nízká rychlost EOF umožní interakce kationtů se stěnou kapiláry – absorpce, nesymetrie píků - opačně orientovaný EOF může znemožnit detekci analytů Na rozhraní obou vrstev je vytvořen elektrický zeta potenciál  13 Elektroosmotický tok Změna elektroosmotického toku pH μ EOF ✓ změnou pH – nízký EOF při kyselém pH ✓ změnou iontové síly pufru – rostoucí iontová síla snižuje potenciál a tím i EOF vs. generace tepla ✓ modifikací vnitřního povrchu kapiláry - potlačení nebo obrácení náboje pokrytím stěny kapiláry, tzv. coating - permanentní modifikace – kovalentní vazba např. s polymerem - dynamická modifikace - přídavek polymeru do pufru ✓ změnou elektrického pole – nízké napětí, nízká selektivita vs. vysoké napětí, vyšší generace tepla ✓ změnou teploty – vyšší teplota, změna viskozity, vyšší EOF  * μEOF =  vEOF = E * μEOF  – elektrokinetický potenciál – permitivita roztoku  - viskozita roztoku Experimentální zjištění EOF – pomocí neutrálního markeru - migrační čas ovlivňuje pouze elektroosmóza - neutrální marker – mesityloxid, aceton, dimethylformamid, voda Elektroforetická mobilita EOF μEOF 14 - při elektroforéze dochází k migraci iontů a současně k rozmývání zón difúzí N = 5,54 * (tR /w½ )2 = 16 * (tR /w)2 tr – migrační čas píku w1/2 – šířka píku v polovině jeho výšky w – šířka píku při jeho základně Počet teoretických pater N = měřítko účinnosti elektroforetické separace píky mají tvar Gaussovy křivky inflexní body wi = 2 w1/2 = 2,354 w = 4 w1/ 2 wi výška h  = vzdálenost, kterou prodifunduje průměrný ion za dobu t - vztah mezi difúzním koeficientem D a tzv. rozptylem 2 udává Einstein-Smoluchowského rovnice 2 = 2 * D * t - účinnost separace je v omezeném rozsahu přímo úměrná vloženému napětí N = μ * U / 2 * D μ – elektroforetická mobilita iontu U – vložené separační napětí vyšší napětí větší generované teplo pokles účinnosti separace 17 Ekvivalent teoretického patra H = počet teoretických pater vztažený na délku kapiláry H = l / N = 2 / l Účinnost elektroforetické separace 15 V reálném experimentu však rozptyl 2 ovlivňuje řada vlivů: ✓ difúze ✓ elektromigrační disperze ✓ sorpce ✓ Jouleovo teplo nástřik, detekce … atd. Difúze - nelze odstranit, pouze ovlivnit např. snížením teploty, zvýšením viskozity apod. - nízký difúzní koeficient – úzké píky Sorpce - interakce analytů s nábojem na stěně kapiláry - vede k asymetrii píků, v horším případě ke ztrátě analytu coating Jouleovo teplo - způsobené průchodem elektrického proudu kapilárou chlazení - Ohmova závislost proudu na napětí – volba vhodného separačního napětí Elektrodisperze - rozdílná pohyblivost analytu a spoluiontu stejného náboje z elektrolytu - minimalizace vlivu správnou volbou elektrolytu s co nejpodobnější pohyblivostí A - frontování B - symetrie C - chvostování Účinnost elektroforetické separace 16 19 Agilent Technologies Beckman Coulter Prince Technologies Recman Villa Labeco - 1988 - první komerční přístroj firmy Beckman Instruments Instrumentace 17 Dávkování v CZE - dávkovaný objem v jednotkách nanolitrů – otázka reprodukovatelnosti - nepraktičnost při využití dávkovacích kohoutů či jiných injektorů Hydrodynamické dávkování - nejjednodušší, využití sifonového efektu - rozdíl hladin (ruční dávkování) - využití přetlaku či podtlaku (komerční přístroje) - pro výpočet dávkovaného objemu slouží Hagen-Poiseuilleova rovnice P * d4 *  * td Vd = 128 *  * lt P – tlakový spád na kapiláře d – vnitřní průměr kapiláry td – doba nástřiku – viskozita elektrolytu lt – celková délka kapiláry rozdíl hladin přetlak podtlak 20 Instrumentace 18 Elektrokinetické dávkování td * Ud V d =  * r2 * l s t0 * Us r – vnitřní poloměr kapiláry ls – efektivní délka kapiláry td – doba, po kterou bylo aplikováno napětí t0 – migrační čas EOF Ud – napětí při dávkování Us – separační napětí - v některých případech jediný možný postup – kapilární gelová elektroforéza - dávkovací napětí bývá obvykle nižší než separační Koncentrační poměr analytů ve vzorku nemusí odpovídat poměru v nadávkované zóně - výpočet nadávkovaného objemu 21 Dávkování v CZE Instrumentace 19 22 paprsek Z -cela paprsek detekční okénko - online detekce přímo v kapiláře X sběr frakcí a offline detekce - různá citlivost jednotlivých detektorů - možnost derivatizace analytů pro lepší detekovatelnost Nejběžnější detektory ✓ absorpční fotometrický, s diodovým polem ✓ fluorescenční ✓ konduktometrický ✓ ampérometrický ✓ hmotnostně-spektrometrický bublinková cela paprsek Detekce v CZE Instrumentace 20 Elektroferogram = grafický záznam separace po zpracování signálu detektoru - další uváděná označení elektroforegram, elektroforetogram, elektroforeogram… EOF Výpočet elektroforetické pohyblivosti z migračního času analytu lt * ls 1 1 μ = U tm t0 tC , tL – migrační časy píků wC , wL – šířka píků u základny Rozlišení píků L a C 2 * (tC – tL) R L,C = wL + wC lt – celková délka kapiláry ls – efektivní délka kapiláry U – separační napětí tm – migrační čas analytu t0 – migrační čas EOF 23 Elektroferogram a jeho vyhodnocení 21 Separace anorganických kationtů Gao J. et. Al. Cent. Eur. J. Chem., 6(4), 2008, 617. - fused silica capillary, 75 μm ID, 57 cm total / 50 cm effective length - separation voltage 22 kV, injection 0.5 kV (6 sec), UV detection at 214 nm - new capillary treatment = 0.1 M NaOH 5 min, Milli-Q water 5 min, separation buffer 10 min - BGE: 12 mM imidazole, 5 mM malic acid, 1 mM 18-crown-6-ether, 20% D2O, - pH 4.25 adjusted using acetic acid Vybrané aplikace kapilární zónové elektroforézy 1. NH4 + 2. K+ 3. Na+ 4. Ca2+ 5. Mg2+ 6. Mn2+ 7. Zn2+ 8. Co2+ 9. Cu2+ 1. NH4 + 2. K+ 3. Na+ 4. Ca2+ 5. Mg2+ Separace standardů Analýza kokosového mléka 22 Vybrané aplikace kapilární zónové elektroforézy 23 Qiuju G. et. al., Analytica Chimica Acta, 662 (2010) 193. Nepřímá UV-Vis detekce = pracovní elektrolyt absorbuje v dané oblasti a průchod analytu detektorem se zaznamená poklesem absorbance - vznikají pří ní negativní píky - má nižší citlivost než přímá detekce - využívá se pro látky, které neobsahují ve své struktuře vhodné chromofory a používá se pro ní běžný UV detektor a silně absorbující základní elektrolyty - fused silica capillary 75 μm ID, 105/115 cm - voltage −18 kV, injection pressure 50 mbar for 1 s - detection at 224 nm - BGE: 8 mM dimethoxyphenol, 1.5 mM CTAB, pH 12.00 Separace monosacharidů po kyselé hydrolýze polysacharidů z mořských mikroorganismů 1. xylose 2. mannose 3. rhamnose 4. glucose 5. galactose 6. fucose Cetyltrimethylammonium bromid (CTAB) H.F.Lau et. al., Electrophoresis, 32 (2011) 1190. Vybrané aplikace kapilární zónové elektroforézy Separace iontů těžkých kovů v odpadních vodách 24 - fused silica capillary 50 μm ID, 40/48 cm - BGE: 10 mM His and 4 mM tartrate, pH 5.5 - electrokinetic injection 3 kV/5 sec - separation voltage +15 kV - concentration of analytes: Cr3+, Pb2+, Ni2+ at 100 mg/L, Hg2+ at 400 mg/L H.F.Lau et. al., Electrophoresis, 32 (2011) 1190. Vybrané aplikace kapilární zónové elektroforézy Separace iontů těžkých kovů v odpadních vodách 24 - fused silica capillary 50 μm ID, 40/48 cm - BGE: 10 mM His and 4 mM tartrate, pH 5.5 - electrokinetic injection 3 kV/5 sec - separation voltage +15 kV - contactless conductivity detector - concentration of analytes: Cr3+, Pb2+, Ni2+ at 100 mg/L, Hg2+ at 400 mg/L Sanli S. et. al., Chromatographia, 79 (2016) 1351. - fused silica capillary 50 μm ID, 55 cm total /45 cm effective length - BGE: 40 mM Na2B4O7 adjusted to pH 8.9 with 0.5 M H3BO3 - pressure injection 10 psi/5 sec - separation voltage +26 kV - detection at 215 nm Vybrané aplikace kapilární zónové elektroforézy Separace polyfenolických látek ve vínech Separace standardů Analýza červeného vína Cabernet Sauvignon California 1. catechin 2. syringic acid 3. apigenin 4. myricetin 5. luteolin 6. quercetin 7. caffeic acid 8. gallic acid 26 Sanli S. et. al., Chromatographia, 79 (2016) 1351. - fused silica capillary 50 μm ID, 55 cm total /45 cm effective length - BGE: 40 mM Na2B4O7 adjusted to pH 8.9 with 0.5 M H3BO3 - pressure injection 10 psi/5 sec - separation voltage +26 kV - detection at 215 nm Vybrané aplikace kapilární zónové elektroforézy Separace polyfenolických látek ve vínech Separace standardů Analýza červeného vína Cabernet Sauvignon California 1. catechin 2. syringic acid 3. apigenin 4. myricetin 5. luteolin 6. quercetin 7. caffeic acid 8. gallic acid 26 1, lysozyme; 2, cytochrome c; 3, ribonuclease A; 4, α-chymotrypsinogen N. Gonzalez et. al., J. Chromatogr A, 1012 (2003) 95. Vybrané aplikace kapilární zónové elektroforézy Separace proteinů 28 coating = navázání polymeru na vnitřní stěnu křemenné kapiláry a ovlivnění EOF – DMA-EpyM coated capillary (N,N-dimethylacrylamide-ethylpyrrolidine methacrylate) - 40/47 cm effective/total length, 50 µm ID, injection 3 kV/5 sec - BGE – 100 mM sodium acetate pH 5, voltage + 25kV Vybrané aplikace kapilární zónové elektroforézy A – acetát pH 5.5 B – citrát pH 5.5 M. Spanilá et. al., J. Sep. Sci 29 (2006) 2234. 0 2 4 6 8 0 30 60 90 120 150 180 absorbance(mAU) time (min) R C LA 0 2 4 6 8 0 30 60 90 120 150 180 absorbance(mAU) time (min) C L R B L – lysozym, C – cytochrom c, R - ribonukleáza Separace proteinů Vliv interakce složky základního elektrolytu s vnitřní stěnou kapiláry – změna pořadí separace analytů PEI – polyethyleneimine coating 29 EOF EOF - deficit metabolických enzymů vede k hromadění purinových a/nebo pyrimidinových markerů v moči - uncoated fused-silica capillary 40 / 47 cm, 50µm I.D. - separation buffer – 45mM borate, 55 mM tricine, 10 mM tartrate, 1mM CTAB, 0.44% TBAH, Ampd (pH 8.6) T. Adam et. al., Journal of Chromatography B, 767 (2002) 333. A – zdravý člověk B - deficit adenin fosforibosyl transferázy BA Vybrané aplikace kapilární zónové elektroforézy Klinická chemie – diagnostika metabolických poruch 30 Prenatální diagnostika vrozených vad – Downův syndrom - odběr plodové vody v 15.týdnu těhotenství - separace markerů Downova syndromu –STR oblasti na chromozómu 21 - 1 pík nebo 2 píky v poměru 1:1 – normální genotyp - 3 píky v poměru 1:1:1 (trisomie 21 .chromozomu) , 2 píky v poměru 2:1 – genotyp s vrozenou vadou C. Gelfi et. al., Journal of Chromatography A, 718 (1995) 405. - poly(N-acroyloyl amino ethoxy ethanol) coated capillary - BGE = TBE (89 mM Tris, 89 mM boric acid, 2 mM EDTA) pH 8.3, 2,5 μM ethidium bromid, 8% PVA A – zdravý člověk B – trisomie 21.chromozomu – poměr píků 1:1:1 C – genotyp s vrozenou vadou – poměr píků 2:1 A B C Vybrané aplikace kapilární zónové elektroforézy 31 buněčné stěny a membrány mají rozdílný obsah proteinů, lipidů a lipopolysacharidů různý náboj - fused silica (Leff = 25 cm, Ltot = 33.5 cm) - buffer was 0.0125% PEO dissolved in MES (2[-(N-morpholino)ethanesulfonic acid]), pH = 6.1 - detection at 214 nm, separation voltage +20 kV, pressure injection 200 mbar /s B. Buszewski et. al., Biomed Chromatogr , 21 (2007) 116. Helicobacter pylori Serratia marcescens Separace mikroorganismů 32 Vybrané aplikace kapilární zónové elektroforézy ✓ kontrola a čistota vzorků - syntetické či přírodní vzorky – léčiva, barviva apod. ✓ analýza komplexních směsí - analýza biologických tekutin, tkáňových extraktů, potravin, odpadních vod apod. ✓ sledování chemických přeměn - studium chemických a enzymatických reakcí, sledování kinetiky reakcí apod. ✓ fyzikálně - chemická charakterizace analytů - stanovení elektroforetické pohyblivosti, efektivních nábojů, disociačních konstant, difúzních koeficientů apod. Souhrn aplikací kapilární zónové elektroforézy 33 Glatz Z. et. al., J. Chromatogr B, 814 (2006) 23. Šedo O. et. al., Anal Chim Acta, 515 (2004) 261. EMMA - electrophoretically mediated microanalysis Derivatisation of peptide – OsO4,bipy reagent ✓ potřeba vytvořit uzavřený elektrický okruh s vysokým napětím přes separační kapiláru ✓ vhodný výběr elektrolytu – předejít zanášení zdroje a ucpání kapilár, interferencím apod. CZE-MS analýza - spojení obou technik zvyšuje potenciál v separaci, identifikaci i kvantifikaci látek ✓ látky se stejnou molekulovou hmotností nelze stanovit na MS, ale po předchozí separaci ano ✓ a obráceně – komigrující látky v jednom píku CZE lze odlišit na MS spektrech ✓ vhodné při analýze komplexních vzorků – vysoká účinnost, rychlost ✓ nízká spotřeba vzorků a médií, možnost využití online prekoncentrace Spojení kapilární elektroforézy s hmotnostní spektrometrií CZE MS 34 Iontové zdroje pro CE-MS ESI – pro polární látky, první použitý zdroj (Olivares a kol. Anal.Chem. 59 (1987) 1230) typické základní elektrolyty – kys. octová, mravenčí, uhličitan amonný + přídavek org. rozpouštědel APPI/APCI – pro málo polární a nepolární látky, lepší kompatibilita s netěkavými složkami elektrolytu MALDI – off-line spojení - sběr frakcí z CE, přímé nanášení separace z kapiláry na MALDI destičku apod. vše záleží na konstrukci iontového zdroje, geometrii a způsobu zapojení spojení obou technik Aplikace CE-MS - klinická biochemie a diagnostika - analýza tělních tekutin (komplexní vzorky) potřeba automatizovaného vyhodnocení MS spekter - analýza životního prostředí a potravin - hodnocení kvality a kontrola bezpečnosti Výhody: vysoká rychlost (high-throughput , příznivý poměr cena/výkon (vs. LC/MS)) vysoká selektivita a citlivost aplikovatelnost jedné metody na více typů vzorků (= tolerance k interferentům) Spojení kapilární elektroforézy s hmotnostní spektrometrií 35 - sledování autenticity mléka – „pančování“ ovčího a kozího mléka mlékem kravským - srovnání výskytu vybraných β-laktoglobulinů ve vzorku - CE-ESI-MS analýza, BGE – 1M kyselina mravenčí pH=1.9, - sheath liquid: voda, methanol, k. mravenčí (78:20:2 v/v), 1 µl/min kozí β-LG kozí α-LA ovčí β-LA kravský β-LG A + β-LG B ovčí β-LG A + β-LG C kravský α-LA L. Müller et. al., Electrophoresis , 29 (2008) 2088. CE-MS analýza α-LA a β-LG a, kravské mléko b, ovčí mléko c, kozí mléko Spojení kapilární elektroforézy s hmotnostní spektrometrií Separace β-laktoglobulinů v mléce 36 kozí β-LG kravský β-LG A kravský β-LG B kozí β-LG kravskýβ-LG A kravský β-LG B směs mléka kravské:kozí 50:50 směs mléka kravské:kozí 10:90 L. Müller et. al., Electrophoresis , 29 (2008) 2088. Spojení kapilární elektroforézy s hmotnostní spektrometrií - sledování autenticity mléka – „pančování“ ovčího a kozího mléka mlékem kravským - srovnání výskytu vybraných β-laktoglobulinů ve vzorku - CE-ESI-MS analýza, BGE – 1M kyselina mravenčí pH=1.9, - sheath liquid: voda, methanol, k. mravenčí (78:20:2 v/v), 1 µl/min Separace β-laktoglobulinů v mléce 37 µ-TAS – micro total analysis system lab on a chip - miniaturizace – všechny kroky analýzy v jednom -vyleptaná soustava kanálků – plastické hmoty, křemen, sklo – obsahují děliče toku kapaliny, ventily apod. - nejčastěji v oblasti analýzy biologicky významných látek – nukleové kyseliny a proteiny ✓ malá spotřeba vzorku (pL – nL) ✓ předúprava vzorku přímo na čipu ✓ přenosnost Hlavní cíl = vyvinout jednotku, která by dokázala zachytit požadovanou buňku a analyzovat její genomický, proteomický, metabolomický, glykomický či jiný profil P. Smejkal, F. Foret: Chem. Listy , 106 (2012) 104. Elektroforetická analýza na čipech ✓ problematická výroba – technologie ✓ cena 38 Kapilární zónová elektroforéza ✓ umožňuje separace od iontů po celé biomolekuly až buňky ✓ spolu s chromatografickými metodami má největší význam v separačních analýzách ✓ má široké uplatnění v rozličných odvětvích vědy a aplikovaného výzkumu ✓ díky miniaturizaci a vývoji nových detekčních technik skrývá obrovský budoucí potenciál ✓ z podstaty separace HPLC - afinita analytu ke stacionární či mobilní fázi CZE – vliv velikosti a náboje analytu při pohybu v elektrickém poli ✓ hlediska reprodukovatelnosti stanovení, náročnosti na vybavení, chemikálie, množství vzorku HPLC – citlivější metoda s vyšší reprodukovatelností, avšak časově náročnější – vysoká spotřeba organických rozpouštědel, vyšší objemy vzorků (µl) CZE – nižší opakovatelnost a reprodukovatelnost (vzhledem k přítomnosti EOF) – dávkování nl vzorku, rychlejší, menší finanční náročnost Kapilární elektroforéza vs. kapalinová chromatografie 39 Závěrem… Používá dva základní elektrolyty LEADING = vedoucí elektrolyt – největší pohyblivost v systému TERMINATING = koncový elektrolyt – nejmenší pohyblivost v systému μTE < μanalytů < μLE 40 Kapilární izotachoforéza ✓ separace probíhá za konstantního proudu – vytvoření potenciálového gradientu ✓ po dosažení ustáleného stavu se zóny pohybují stejnou rychlostí ✓ zóny na sebe těsně navazují a nerozmývají se ✓ lze v jedné analýze separovat pouze anionty nebo kationty V každém místě separačního prostoru musí být platit: ✓ podmínka elektroneutrality - součet nábojů kationtů a aniontů musí být v každém makroskopickém objemu stejný ✓ podmínka kontinuality – popisující časové změny koncentrace jednotlivých iontů v daném místě  ci * zi = 0 ✓ Kohlrauschova regulační funkce  - vystihující existenci diskontinuit v průběhu separace se migrující zóny vzorku musí koncentračně přizpůsobit původní hodnotě ω funkce v zóně vedoucího elektrolyt, dokud není dosaženo rovnovážného stavu ci (x) * zi (x) =  mi - koncentrace látek v původním vzorku nemá vliv na výslednou koncentraci látky v izotachoforetické zóně μ X μL - μC cX = cL * * μX - μC μL cx – koncentrace látky x v zóně cL – koncetrace vedoucího iontu ve vedoucí zóně μx – efektivní pohyblivost látky x μL – efektivní pohyblivost vedoucího iontu L μC – efektivní pohyblivost protiiontu C Koncentrace látek v zónách je konstantní a daná neměnnou koncentrací vedoucího elektrolytu 41 Kapilární izotachoforéza ✓ každá zóna obsahuje pouze jeden druh iontů ✓ v každé zóně je přítomen také protiion vedoucího elektrolytu ✓ koncentrace v zóně je konstantní, mimo ni nulová ✓ pořadí zón se srovná podle klesající efektivní elektroforetické pohyblivosti Samozaostřovací efekt = vlastnosti mezi zónami se mění skokem 1, kation chce přejít do zóny před sebou zóna nižšího potenciálu snížení hnací síly návrat zpět 2, kation chce přejít do zóny za sebou zóna vyššího potenciálu zvýšení hnací síly návrat zpět μ E 42 Kapilární izotachoforéza ✓ zakoncentrování stopových koncentrací analytů až o několik řádů ✓ využití prekoncentrace před kapilární zónovou elektroforézou 43 Kapilární izotachoforéza Foret, F., Křivánková, L., Boček, P.: Capillary Zone Electrophoresis, VCH Verlagsgesellschaft mbH, Weinheim, Germany, 1993. Dolník, V., Úvod do kapilární elektroforézy, Brno, 1994. High Performance Capillary Electrophoresis. A primer. Revised edition by H.H. Lauer and G. P. Rozing, Agilent Technologies, Germany 2009. L. Kvítek, A. Panáček – Základy koloidní chemie, UP Olomouc 2007. Odborné časopisy: 41 Literatura