Spektrálne Metody UV-Vis, Luminiscencia Jozef Hritz jozef.hritz@ceitec.muni.cz Lakowicz, J. R. (2006) Principles of Fluorescence Spectroscopy Nápad na praktickú aplikáciu: Kontrola čistoty mäsa na bytúnku Typické fluorofóry •Fluoroforom nazývame látku schopnú absorbovať a emitovať svetlo. •Molekuly obsahujúce konjugované π elektróny σ*-σ malokedy vedú ku luminiscencii. Veľmi vysoká energia (λ<250nm) vedie zväčša ku disociácii molekúl Emisie sú najčastejšie pre prechody π*-π, niekedy aj π*-n Interakcia fotónov a atómov: •Absorpcia može nastať, keď sa fotón zrazí s atómom alebo molekulou, pričom odovzdá svoju energiu, atom/molekula sa presunie na vyššiu energetickú úroveň, kde môže zostať určitý, ale obmedzený čas (životnosť excitovaného atómu/molekuly) •Emisia Keď sa excitovaný atom/molekula vráti na svoju pôvodnú energetickú hladinu, dojde k predaniu rozdielovej energie buď žiarením (radiačný prechod), alebo vo forme tepla (neradiačný prechod). •Molekula sa do excitovaného stavu može dostať fyzikálnymi procesmi (napr. absorbcia svetla), mechanickými procesmi (napr. trením), alebo chemickými procesmi (napr. chemické reakcie) •Prijatím tejto energie sa atomy alebo molekuly dostávajú do menej stabilních energetických stavov a prebytočnej energie sa zbavujú vyžiarením fotonu. •Luminiscenciou nazývame emisiu svetla atómu, alebo molekuly, ktorá sa odohráva z excitovaného do základného stavu elektrónu •Luminiscencia sa formálne delí na fluorescenciu a fosforescenciu v závislosti na charaktere elektronového excitovaného stavu. Druhy elektromagnetického žiarenia • Monochromatické Žiarenie obsahuje "jednu" vlnovú dĺžku (lepšie veľmi blízke vlnové dĺžky); je možné získať z polychrómneho žiarenie pomocou monochromátora (filter, hranol, mriežka). • Polychromatické Žiarenie obsahuje rôzne vlnové dĺžky a nemôže byť koherentné (žiarovka, slnko). • Koherentné Žiarenie vychádza z jedného zdroja a zachováva si rovnakú vlnovú dĺžku, fázu a amplitúdu na určitú vzdialenosť alebo po určitú dobu (laser). • Nekoherentné Žiarenie pochádza z jedného zdroja, ale nezachováva si svoj koherentný charakter ("rozchádza sa"). 5 Kmitová rovina Polarizační rovina Foton – základné vzťahy 6 Elektromagnetické spektrum Viditeľné svetlo 7 Svetelné žiárenie s vlnovou dĺžkou λ = 400 - 800 nm. Je absorbované a emitované elektrónmi v atómoch a molekulách, keď e- prechádzajú medzi energetickými hladinami. Absorpcia žiarenia 8 Interakcia látky X (atóm, molekula) so žiarením vhodnej energie E (v závislosti od počtu hladín látka absorbuje pri rôznych λ): X + hν → X* Usporiadaná množina vlnových dĺžok, ktoré látka absorbuje, sa nazýva absorpčné spektrum. Absorbované λ sú charakteristické pre určitú látku → látku je možné identifikovať alebo posúdiť jej štruktúru (kvalitatívna analýza). Miera absorpcie, t. j. množstvo absorbovaného žiarenia, je vyjadrená absorbanciou - A (kvantitatívna analýza) V spektrách sa prejavia iba prechody povolené výberovými pravidlami. Odvodenie Lambert-Beerova zákona 9 1. Transmitance a délka absorbujícího prostředí: zákon Bouguer-Lambert T = Φ/Φ0 = e –konst. x délka absorb. prostředí 2. Transmitance a koncentrace: zákon Beerův T = Φ/Φ0 = e –konst. x délka absorb. prostředí Odvození Lambert-Beerova zákona Transmitance Absorbance Bouguer-Lambert-Beerův zákon T = (Φ/Φ0); (Φ/Φ0)×100 (%) A = log(Φ0/Φ)= -log T; 0≤ A ≤∞ A = - log T = - log(Φ/Φ0)= log(Φ0/Φ) Φ0 dopadající záření,Φ propuštěné záření (zářivý tok) A = ε . l . c ; 0≤ A ≤∞ • 10 Limitace Lambert-Beerova zákona •Odchylka ελ při vysokých koncentracích (>10-2 mol/l) vlivem elektrostatických interakcí •Částečný rozptyl světla na částicích přítomných ve vzorku •Fluorescence nebo fosforescence vzorku •Nedokonale monochromatické záření •Nekoherentní světelné záření Nejpřesnější výsledky jsou získávány v rozsahu absorbancí 0,2-0,7! Od hodnot absorbance > 0,7 výrazně narůstá chyba měření! Bouguer-Lambert-Beerův zákon A = ε . l . c ; 0≤ A ≤∞ 11 A c [mol/l] opakovanie? UV-VIS spektrofotometrie 12 Zdroje záření Xe lampa (200 – 1 000 nm) H2, D2 výbojka (160 – 380 nm) W, W-X žárovka (320 – 2 400 nm) Monochromátor Hranol Mřížka Filtry Characteristics of Single and Double Monochromator UV-VIS Spectrophotometers : SHIMADZU (Shimadzu Corporation) Optical Filters, Colored galss, IR-Cut, Band-pass, Neutral Glass - Creator Optics Optické analytické metody UV-VIS spektrofotometrie Přístroje 13 Optické analytické metody UV-VIS spektrofotometrie v Biofyzikální chemii Stanovování koncentrace biologických látek 14 Peptidová vazba, λ = 200 – 215 nm Aromatické AK, λ = 280 nm Zakalené roztoky bílkovin, λ = 280 nm a λ = 330 nm, A = A280 – A330 DNA, λ = 260 nm, nebo λ = 260 nm a λ = 280 nm, A = A260 / A280 Optické analytické metody Fluorescence 15 Pauliho vylučovací princip Princip kvantové mechaniky, který říká, že žádné dva elektrony v atomu nemohou být ve stejném kvantovém stavu. V roce 1925 formuloval fyzik Wolfgang Pauli. Objav Fluorescencie Fluorescenciou nazývame jav pri ktorom je svetlo emitované atómom alebo molekulou po ohraničenej dobe nasledujúcej po absorpcii elektromagnetického žiarenia Energetické hladiny v molekule En,v,J=En+Ev+EJ En-elektrónová energia EV-vibračná energia EJ-rotačná energia Kvalitatívne porovnanie jednotlivých energetických komponent: En(UV-VIS) >> EV (IR) >> EJ(MW) Čo určuje tvar absorbčného spektra? Frank-Condonov princíp: Vertikálne prechody elektrónu, ktoré sa odohrávajú na omnoho rýchlejšej časovej škále ako pohyb jadier atómov. Pravdepodobnosť prechodu závisí od prekryvu vibračných vlnových funkcií Absorbcia 10-15s Vibrácie atómov 10-12s-10-10s Termálna relaxácia 10-15s-10-12s Fluorescenčná emisia 10-9s Typické charakteristiky fluorescenčných spektier •Stoksov posun •Nezávislosť emisného spektra • na excitačnej vlnovej dĺžke •Excitačné spektrum “rozumne sa • správajúcich molekúl” je prakticky • totožné s absorbčným spektrom •Emisné spektrum je vo väčšine • prípadoch takmer zrkadlovým • obrazom absorbčného/excitačného • spektra Kasha’s Rule Relaxation between vibrational levels are typically connected with IR radiation Jablonského diagram (10-14-10-10s (10-10-10-8s Pauliho vylučovací princip Princip kvantové mechaniky, který říká, že žádné dva elektrony v atomu nemohou být ve stejném kvantovém stavu. V roce 1925 formuloval fyzik Wolfgang Pauli. Kvantový výťažok kf = fluorescenčná rýchlostná konštanta ki = medzi-systémová výmenná rýchlostná konštanta kec = rýchlostná konštanta externej konverzie kic = rýchlostná konštanta internej konverzie kpd = predisociačná rýchlostná konštanta kd = disociačná rýchlostná konštanta Fluorescenčný spektrofotometer Fluorescenčný mikroskop Fluorescence microscopy •Subcellular fluorescence imaging –Combined with recombinantly-expressed fluorophores (GFP, etc.—Roger Tsien) has revolutionized biology. fluoromicrofigure1 kahn_fl_image http://micro.magnet.fsu.edu/primer/techniques/fluorescence/anatomy/fluoromicroanatomy.html http://www.rp-photonics.com/img/kahn_fl_image.jpg Försterov Rezonančný Transfer Energie (FRET) R0-Försterov polomer/vzdialenosť Efektívnosť FRET r – vzdialenosť medzi akceptorom a donorom κ2 – popisuje vzájomnú relatívnu orientáciu tranzitných dipólov donoru a akceptora. Pre flexibilný náhodný pohyb akceptora a donora sa κ2=2/3 •Försterov polomer (R0) hodnota v angstromoch (Å) reprezentuje hodnotu vzdialenosti pre ktorú má FRET efektívnosť 50%. Pre veľa párov dostupných fluoroforov (hlavne komerčných) sú tieto hodnoty dostupné. Napr. •https://www.thermofisher.com/cz/en/home/references/molecular-probes-the-handbook/tables/r0-values- for-some-alexa-fluor-dyes.html • Alexa.JPG Príklad: Vypočítajte efektívnosť FRETu medzi AF488 a AF647 pre ich vzdialenosť 5 nm keď viete, že ich preferovaná vzájomná orientácia je charakterizovaná κ2=0.5. Alexa 488 Alexa 647 Alexa 488 Alexa 594 MD simulácie Hanky Zigovej Monitorovanie skladania proteínov in vivo Fluorescenčná anizotropia Anizotrópia Polarizácia: Viazanie ligandu do receptoru Praktické výhody v porovnaní s inymi experimentálnymi technikami •veľmi vysoká citlivosť • è nízke nároky na množstvo meranej vzorky • è možnosť quantifikovať silné interakcie charakterizovné nízkou hodnotou disociačnej konštanty •relatívne nízka finančná náročnosť na prípravu vzorky ako aj meranie na fluorimeteri •Špecifické značenie fluorescenčnou farbičkou dosť často netriviálne Ďalšie čítanie •Lakowicz, J. R. (2006) Principles of Fluorescence Spectroscopy •http://xibalba.lcg.unam.mx/~rgalindo/bioquimica/BQPosgrado2011/V PurificacionEspeectroscopia/PrinciplesofFluorescenceSpectroscopy3rd.pdf) •