This presentation uses a free template provided by FPPT.com www.free-power-point-templates.com Separační metody v biofyzikální chemii Mgr. Markéta Procházková, Ph. D. C5855 Metody biofyzikální chemie This presentation uses a free template provided by FPPT.com www.free-power-point-templates.com Osnova •Základní analytické pojmy •Analytické metody v BFCH •Separační metody v BFCH 2 This presentation uses a free template provided by FPPT.com www.free-power-point-templates.com Základní analytické pojmy Analytická chemie •Vyvíjí a aplikuje metody a postupy k získání informace o složení a povaze analytu. •Chemická analýza → Určování druhu a struktury látek, jejich složení a jejich součástí (iontů, prvků, skupin prvků - funkčních skupin nebo celých sloučenin), a dále stanovení jejich relativního množství. •Kvalitativní analýza (důkaz) → Zjišťování druhu přítomných složek. Rozdělení podle zaměření: elementární analýza strukturní analýza (důkaz prvků či skupin) (určování struktury analyzovaného materiálu) •Kvantitativní analýza (stanovování) → Zjišťování a číselné vyjadřování obsahu složek ve vzorku, určení obsahu analytu. 3 This presentation uses a free template provided by FPPT.com www.free-power-point-templates.com Základní analytické pojmy 4 Chyby analytických metod Náhodné Soustavné Hrubé Přesnost a správnost výsledku Reprodukovatelnost, opakovatelnost metody. Principy a pravidla validace metod. This presentation uses a free template provided by FPPT.com www.free-power-point-templates.com Základní analytické pojmy Metrologické pojmy 5 Preciznost (precision) (dříve správnost) Vyjadřuje, jak moc se výsledky liší navzájem, jaký je jejich rozptyl. Závisí na rozdělení náhodných chyb a nemá vztah ke skutečné hodnotě. Obvykle se uvádí ve formě směrodatné odchylky. Opakovatelnost (repeatability) - Preciznost za podmínek opakovatelnosti. Vyjadřuje těsnost souhlasu mezi výsledky nezávislých měření stejného analytu, provedených stejnou metodou, stejným pracovníkem, na stejném přístroji, na stejném místě, za stejných podmínek v krátkém časovém intervalu. Opakovatelnost je vlastností metody, ne výsledku! Reprodukovatelnost (reproducibility) - Preciznost za podmínek reprodukovatelnosti. Vyjadřuje těsnost souhlasu mezi výsledky měření stejného analytu ve vzorcích stejného materiálu, kdy jsou jednotlivá měření prováděna za různých podmínek (pracovník, přístroj, místo, podmínky, čas, avšak stejná metoda) - ať už v rámci jedné laboratoře nebo mezi různými laboratořemi. This presentation uses a free template provided by FPPT.com www.free-power-point-templates.com Základní analytické pojmy Metrologické pojmy 6 Přesnost (accuracy) Těsnost shody mezi naměřenou hodnotou veličiny a „pravou” („skutečnou”, konvenční skutečnou, očekávanou, zjištěnou analyzováním vhodného referenčního materiálu) hodnotou měřené veličiny. Přesnost metody kombinuje preciznost a pravdivost, tj. vlivy náhodných a systematických faktorů. Pravdivost (trueness) Těsnost shody mezi průměrnou hodnotou získanou z velkého počtu výsledků měření a dohodnutou referenční hodnotou (skutečnou, konvenční skutečnou hodnotou,..). Mírou pravdivosti (skutečnosti) je vychýlení (bias). Pravdivý výsledek je zatížen zanedbatelnou systematickou chybou. Vychýlení představuje kvantifikaci systematické chyby měření. This presentation uses a free template provided by FPPT.com www.free-power-point-templates.com Základní analytické pojmy Přesnost a správnost měření 7 This presentation uses a free template provided by FPPT.com www.free-power-point-templates.com Základní analytické pojmy 8 Charakteristiky stanovení 1.Citlivost analytické metody – směrnice kalibrační křivky. 2.Charakteristická koncentrace. 3.Charakteristická hmotnost. 4.Pracovní rozsah a lineární dynamický rozsah metody (LDR). 5.Opakovatelnost (%, RSD) a reprodukovatelnost (10%). 6.Mez detekce (3σ) – SD signálu blanku. 90 – 99,9% pravděpodobnost přítomnosti analytu ve vzorku. 7.Mez stanovitelnosti (10σ). This presentation uses a free template provided by FPPT.com www.free-power-point-templates.com Základní analytické pojmy Důležité limity 9 Mez detekce (LOD - limit of detection) Koncentrace analytu, pro kterou je analytický signál statisticky významný od šumu. Podle uzance se mez detekce vyjadřuje jako trojnásobek šumu základní linie (S/N=3). Mez stanovitelnosti (LOQ - limit of quantification) Odpovídá koncentraci, při které je přesnost stanovení taková, že dovoluje kvantitativní vyhodnocení. Podle uzance se mez stanovitelnosti vyjadřuje jako desetinásobek šumu základní linie (S/N=10). ≥ This presentation uses a free template provided by FPPT.com www.free-power-point-templates.com Základní analytické pojmy 10 Lineární dynamický rozsah metody LDR, LoL ØOdezva detektoru Rozdíl v odezvě různých koncentrací látek je proporcionální – přímá linie naměřených dat v kalibrační křivce. ØLineární dynamický rozsah detektoru Maximum lineární odezvy: šum detektoru. ØNelinearita detektoru Detekce signálu je nelineární při vysokých koncentracích – chyby v kvantifikaci. Lineární dynamický rozsah koncentrace analytu LoL LoQ Hladina šumu This presentation uses a free template provided by FPPT.com www.free-power-point-templates.com Zpracování dat chemické analýzy 11 Chemometrické postupy: ØStatistické nástroje pro opakovaná měření a jejich vyhodnocení. ØStatistické testování, statistické modely, neuronové sítě. ØAnalýza rozptylu, testy odlehlých hodnot. ØKalibrace, regresní a korelační metody. ØPlánování experimentů. ØMultivariantní analýza. ØStatistické řízení jakosti. ØRegulační diagramy. This presentation uses a free template provided by FPPT.com www.free-power-point-templates.com Analytické metody Optické metody • Spektrální - metody molekulové (IČ, Raman, UV-Vis) a atomové (AAS, OES, AFS) spektrometrie, hmotnostní spektrometrie, NMR, EPR. • Nespektrální - Refraktometrie, Polarimetrie, Nefelometrie a Turbidimetrie. Separační metody • GC, HPLC, IEC, TLC • elektromigrační metody - kapilární a plošná elektroforéza, izoelektrická fokusace, izotachoforéza. Elektroanalytické metody •Potenciometrie, Konduktometrie, Voltametrie (Polarografie), Coulometrie, Amperometrie Radiometrické metody Hmotnostní spektrometrie Ostatní analytické metody 12 This presentation uses a free template provided by FPPT.com www.free-power-point-templates.com Separační metody v BFCH Separace založená na velikosti molekul. •Koncentrační gradient částic s povrchovým nábojem. •Propustnost membrány pro rozpuštěné látky. •Velikost povrchu membrány. •Pohyb částic < 1 000 Da, < < 10 000 Da, < 30 000 Da. 13 Dialýza This presentation uses a free template provided by FPPT.com www.free-power-point-templates.com Separační metody v BFCH Separace založená na velikosti molekul. •Separace na základě propustnosti přes membránu. •Šetrná technika – Minimální denaturace bílkovin. •Velikost povrchu membrány. •Centrifugace za použití vysokých otáček. •Po centrifugaci jsou proteiny oddělené od nečistot a zakoncentrovány. •Oddělení částic < 1000 Da, < 10 000 Da, < 30 000 Da. 14 Ultrafiltrace This presentation uses a free template provided by FPPT.com www.free-power-point-templates.com Separační metody v BFCH Separace založená na velikosti molekul. •Lineární hustotní gradient (sacharóza, CsCl). •Centrifugace při vysokých otáčkách (150 000g). •Sedimentace proteinů určitou rychlostí podle velikosti, hustoty, tvaru molekul (je dosažena rovnováha mezi hustotou roztoku a částicí). •Po centrifugaci jsou proteiny v gradientu rozděleny zahuštěny. 15 Centrifugace v hustotním gradientu This presentation uses a free template provided by FPPT.com www.free-power-point-templates.com Separační metody v BFCH Separace založená na velikosti molekul. •Hydrofilní gelové částice (polymer). •Uvnitř každé částice jsou póry. •Látky se rozdělují podle velikosti (molekulové hmotnosti) 16 Gelová filtrační chromatografie (molekulová vylučovací chromatografie) This presentation uses a free template provided by FPPT.com www.free-power-point-templates.com Separační metody v BFCH Optimální gel pro gelovou filtraci : •Inertní matrice gelu pro dělené složky i pro eluční roztoky. •Chemicky stabilní gel během několika kroků, při různém pH a při různé teplotě. •Mechanicky stabilní gel, aby se při větším tlaku nedeformoval. •Velikost gelových částic nesmí být ani příliš malá (rozdělení je přesnější, ale pomalejší) ani příliš velká (rozdělení je rychlejší, ale může být nepřesné). Na rychlou chromatografii tedy použijeme gel s hrubšími zrny. Na vysoký stupeň rozlišení použijeme gel s malými zrny. 17 Gelová filtrační chromatografie (molekulová vylučovací chromatografie) This presentation uses a free template provided by FPPT.com www.free-power-point-templates.com Separační metody v BFCH •Gel z polyakrylamidu (s SDS) a nebo agarózy - složitá síť polymerních molekul s póry – „síto“, kterým molekuly putují ve stejnosměrném el. poli. •Velikost pórů gelu lze ovlivnit složením a koncentrací polymeru. •Molekuly se dělí na základě své velikosti → malé se pohybují rychleji, velké pomaleji. 18 Gelová elektroforéza (ELFO) This presentation uses a free template provided by FPPT.com www.free-power-point-templates.com Separační metody v BFCH •IEF se obvykle provádí v 3-4% polyakrylamidových gelech nebo v agarose. •Do roztoku pro přípravu gelu se přidávají amfolyty v koncentraci 2 – 2,5%. •Jedná se o směs nízkomolekulárních oligoamino-oligokarboxylových kyselin, které mají rozdílné pI hodnoty. •Gradienty se tvoří nejčastěji v rozmezí pH 3-10, nebo v užším rozsahu. • 19 Izoelektrická fokusace (IEF) This presentation uses a free template provided by FPPT.com www.free-power-point-templates.com Separační metody v BFCH Princip LC: Rozdílná distribuce dělených látek mezi dvě různé nemísitelné fáze (SF a MF). 20 Kapalinová chromatografie Separační (dělící) a současně i analytická metoda, poskytuje kvalitativní a kvantitativní informace o vzorku. Dělené látky obsažené (rozpuštěné) v mobilní fázi mají různou afinitu ke stacionární fázi a jsou různou měrou ve svém pohybu zadržovány → vykazují různou retenci. This presentation uses a free template provided by FPPT.com www.free-power-point-templates.com Separační metody v BFCH Teorie LC 21 Kapalinová chromatografie t0 Mrtvý čas = retenční čas látky, která není zadržována SF. tR Retenční čas t‘R Redukovaný retenční čas (tR - t0) W(b) Šířka píku při základně W(h) Šířka píku v polovině výšky This presentation uses a free template provided by FPPT.com www.free-power-point-templates.com Separační metody v BFCH Teorie LC 22 Kapalinová chromatografie V0 Mrtvý objem = eluční objem látky která není zadržována SF VR Retenční objem V‘R Redukovaný retenční objem (V‘R - V0) W(b) Šířka píku při základně W(h) Šířka píku v polovině výšky This presentation uses a free template provided by FPPT.com www.free-power-point-templates.com Separační metody v BFCH Teorie LC, účinnost separace 23 Kapalinová chromatografie Kapacitní faktor (k‘) Kapacitní faktor – srovnání výsledků získaných z různých systémů. Je nezávislý na délce kolony a průtoku. k’ závisí na síle interakce analytu mezi mobilní a stacionární fázi, ustavení rovnováhy! k‘ ≈ 1.0, separace špatná k‘ > 30, separace pomalá k‘ = 2-10, separace optimální This presentation uses a free template provided by FPPT.com www.free-power-point-templates.com Separační metody v BFCH Teorie LC, rozdělovací izoterma 24 Kapalinová chromatografie Rozdělovací koeficient = závislost koncentrace látky ve stacionární fázi na koncentraci látky v mobilní fázi (platí pro konstantní teplotu) Rozdělovací koeficient K se: 1. Nemění s koncentrací a) Izoterma je lineární, eluční pík je symetrický 2. Mění s koncentrací → eluční píky nejsou symetrické a izoterma je zakřivená: b) Konkávní c) Konvexní This presentation uses a free template provided by FPPT.com www.free-power-point-templates.com Separační metody v BFCH Teorie LC, účinnost chromatografické kolony 25 Kapalinová chromatografie H, počet teoretických pater: Složky vzorku unášené tokem mobilní fáze vstupují do 1. patra kolony nerozdělené. Zde se ustavuje rovnováha mezi stacionární fází a mobilní fází. Po ustavení rovnováhy se změní koncentrace složek v mobilní fázi a roztok dělených látek v mobilní fázi vstupuje do 2.patra, kde se opět ustavuje rovnováha mezi fázemi. Celý proces se mnohonásobně opakuje. Na počtu pater kolony je závislá účinnost separace. This presentation uses a free template provided by FPPT.com www.free-power-point-templates.com Separační metody v BFCH Teorie LC, příčiny rozšiřování chromatografických zón 26 Kapalinová chromatografie 1. Vířivá difúze - Různé molekuly musí urazit různé vzdálenosti. 2. Podélná molekulární difúze - Molekuly putují z místa o vyšší koncentraci do místa o nižší koncentraci. 3. Odpor proti přenosu hmoty ve stacionární fázi - Různé molekuly difundují různě hluboko do stacionární fáze.. 4. Odpor proti přenosu hmoty v mobilní fázi - Rychlostní profil mobilní fáze uvnitř kanálku je parabolický. This presentation uses a free template provided by FPPT.com www.free-power-point-templates.com Separační metody v BFCH Teorie LC, Van Deemterova rovnice 27 Kapalinová chromatografie Minimum křivky odpovídá optimální průtokové rychlosti, při které daná kolona vykazuje největší účinnost a tedy minimálně rozšiřuje zóny analytů – rozšiřování píků. This presentation uses a free template provided by FPPT.com www.free-power-point-templates.com Separační metody v BFCH 28 Kapalinová chromatografie, Teorie LC, Kolony This presentation uses a free template provided by FPPT.com www.free-power-point-templates.com Separační metody v BFCH 29 Kapalinová chromatografie, hlavní typy interakcí v LC This presentation uses a free template provided by FPPT.com www.free-power-point-templates.com Separační metody v BFCH •Kapalinová chromatografie pro separaci a čištění proteinů z komplexních směsí. •Běžně se používá za nižších teplot (15-20°C). •Dle typu kolony: → Iontově výměnná chromatografie → Afinitní chromatografie (His-tag) → Chromatografie na reverzní fázi → Chromatografie na normální fázi (hydrofobní interakce) → Chirální chromatografie 30 FPLC Rychlá proteinová kapalinová chromatografie This presentation uses a free template provided by FPPT.com www.free-power-point-templates.com Separační metody v BFCH •Proteiny se pohybují kolonou rychlostí, která je dána jejich celkovými náboji v roztoku o daném pH. •Vazba proteinů díky elektrostatickým silám, pH a obsah solí mobilní fáze, která obklopuje molekuly proteinů ovlivní jejich ionizaci. •Syntetický polymer (např. pryskyřice) obsahuje nabité funkční skupiny: → Záporně nabité kuličky – katexy (COOH, vazba kationtů). → Kladně nabité kuličky – anexy (NH2, vazba aniotů). •Navázané proteiny se z vazby uvolní změnou iontové síly nebo změnou pH roztoku protékajících chromatografickou kolonou. 31 Iontově výměnná chromatografie This presentation uses a free template provided by FPPT.com www.free-power-point-templates.com Separační metody v BFCH •Založena na specifické interakci mezi izolovaným biopolymerem (proteinem, nukleovou kyselinou) a ligandem. •Ligand je kovalentně vázán na povrchu stacionární fáze (afinantu). •Specifický typ adsorpční chromatografie. •Příprava SF zahrnuje výběr vhodného nosiče, afinantu a také nalezení vhodného způsobu vazby afinantu na nosič. •Např. soustavy: Antigen-protilátka, enzym-substrát, receptor-hormon. 32 Afinitní chromatografie This presentation uses a free template provided by FPPT.com www.free-power-point-templates.com Separační metody v BFCH •Založena na specifické interakci mezi His-Tag značeným proteinem a přechodným iontem kovu. •Přechodný kov je kovalentně vázán na povrchu stacionární fáze (afinantu). 33 Metalo-afinitní chromatografie Immobilized Metal Affinity Chromatography (IMAC) - Creative Proteomics This presentation uses a free template provided by FPPT.com www.free-power-point-templates.com Separační metody v BFCH •Založena na specifické interakci mezi vybranou stacionární fází a mobilní fází. 34 Kapalinová chromatografie, RP vs. NP HPLC This presentation uses a free template provided by FPPT.com www.free-power-point-templates.com Separační metody v BFCH •Založena na specifické interakci mezi vybranou stacionární fází a mobilní fází. 35 Kapalinová chromatografie, Chirální HPLC Effective control of optical purity by chiral HPLC separation for ester-based liquid crystalline materials forming anticlinic smectic phases - EUTOPIA This presentation uses a free template provided by FPPT.com www.free-power-point-templates.com Děkuji za pozornost! 36