Úvod do molekulární medicíny
C7188
Mgr. Júlia Bohošová, Ph.D. podzim 2024
3. Biologický materiál, mikroRNA, RT qPCR
Interdisciplinární charakter biomedicínského výzkumu
příklad onkologického výzkumu
Radiolog
Klinický onkolog
Chirurg
Patolog
Molekulární biolog
Biologický materiál užívaný pro účely molekulární medicíny
Tkáň – nativní vs. fixovaná
- chirurgický resekát, biopsie
Formalin Fixed Paraffin-Embedded tissue (FFPE)
Čerstvá tkáň – s tkání je třeba zacházet velmi opatrně, po odběru se může snadno poškodit
Tekuté fixační činidlo – vzorek musí být umístěn do 10% formalínu (formaldehyd) -> změna konfigurace bílkovin, včetně
enzymů (6-24 hodin v závislosti na velikosti a typu vzorku tkáně)
Dehydratace etanolem – opakované ponoření tkáně do ethanolu o zvyšující se koncentraci, která končí 100% koncentrací
ethanol
Čistící prostředek (xylen, isopropanol) – vytěsnění etanolu a odstranění tuku z tkáně (ztěžuje pronikání vosku)
Parafínový vosk – v této fázi lze tkáň napustit parafínem o teplotě kolem 60 °C a poté ji nechat vychladnout, aby ztuhla a
dala se snadno rozřezat na řezy
Biologický materiál užívaný pro účely molekulární medicíny
Plná krev (plazma + buňky)
Plazma (tekutina po odstranění krevních elementů, obsahuje faktory hemokoagulace)
Sérum (tekutina nad sraženinou, bez faktorů krevního srážení)
Moč
Mozkomíšní mok
Kostní dřeň, bronchiální aspirát, ejakulát,
bronchoalveolární laváž, kloubní tekutiny,
mozkomišní mok, sputum, stolice, výtěry…
Banky biologického materiálu
archivace vzorků v parách kapalného dusíku při teplotě -160°C
K archivovanému vzorku nativní tkáně
uložen fixovaný parablok=morfologický korelát
Biologický materiál užívaný pro účely molekulární medicíny
Masarykův onkologický ústav & RECETOX
BioPharma Hub
Preklinické centrum a centrum molekulární medicíny Masarykovy univerzity
Biobanka – plánovaná kapacita 171 tis. vzorků při -160 ∘C a 93 tis. vzorků při -70 ∘C
Odběr klinického materiálu
Klíčový moment rozhodující a kvalitě celého výzkumu!!!!!!
Všechny odběry musí probíhat stejně, a celý proces musí být přísně kontrolován!
Zaznamenání času podvázání cév
Tzv. ischemické zdržení
Vysoké nároky na stabilizaci především při práci s RNA
Nejčastěji použiváne stabilizační činidlo RNAlater
Doba transportu na patologii
Fixace vzorku
Kontrolovaná
archivace vzorku
DNA 4oC
RNA -70oC
Laserová mikrodisekce – nástroj k získání vybraných buněčných populací
laser capture microdissection (LCM)
Izolace nukleových kyselin
Homogenizace tkáně (ultrazvuk, mechanicka, rotor-stator)
Lyze buněk (enzymaticky-proteináza K, chemicky-SDS, EDTA, fyzikálně-zahřívání…)
RNA méně stabilní než DNA!
Extrakce směsí fenol-chloroform
Srážení nukleových kyselin alkoholem
Přečištění enzymy
Purifikace nukleových kyselin chromatografií (adsorpce na silikát)
Spektrofotometrická kvantifikace a čistota nukleových kyselin
Roztok dvouřetězcové DNA má při 260nm absorbanci 1 při koncetraci 50ug/ul
Roztok jednořetězcové DNA má při 260nm absorbanci 1 při koncetraci 30ug/ul
Roztok jednořetězcové RNA má při 260nm absorbanci 1 při koncetraci 40ug/ul
Proteiny mají díky aromatickým aminokyselinám absorpční maximum při 280 nm
Poměr A260/A280 se má u nekontaminované DNA pohybovat v rozmezí 1,8 až 2,0
Poměr A260/A230<1,7 indikuje kontaminaci chaotropními solemi a fenolem
Nanodrop ND1000 – umožňuje kvantifikaci pouze v 1ul vzorku
Spektrofotometrická kvantifikace a čistota nukleových kyselin
křivky z Nanodropu
Fluorometrická kvantifikace nukleových kyselin
Nelze stanovit čistotu!
Integrita nukleových kyselin
Agilent Bioanalyzer 2100
Agilent TapeStation 2200
- miniaturiziované
zařízení implementující
kapilární gelovou
elektroforézu pro účely
analýzy NK
18S rRNA
28S rRNA
Poměr 28S/18S ~ 2,0
pro nefragmentovanou RNA
80% rRNA
10-20% tRNA
1-5% mRNA
Integrita nukleových kyselin
RIN = RNA Integrity Number (0 – 10)
Integrita nukleových kyselin
DIN – DNA integrity number
Vliv integrity RNA na analýzu expresních profilů
Vzorek č. 395-2001-1a
RIN = 8,4
Vzorek č. 03/271
RIN = 2,8
c = 0,4412 ug/ul
A260/A280 = 1,93
A260/A230 = 1,79
c = 0,2412 ug/ul
A260/A280 = 2,03
A260/A230 = 1,82 RIN = RNA Integrity Number (0 – 10)
Jako minimální RIN vzorku
byla stanovena hodnota 7.
Nekódující RNA
- Protein-kódující geny zastupují 2 % genomu
- 90 % genomu je aktivně transkribováno
- S rostoucí komplexitou organismu narůstá podíl nekódujících RNA v jeho genomu
Sana et al.; J Transl Med (2012)
Klasifikace RNA
Nové třídy nekódujících regulačních RNA
Sana et al.; J Transl Med (2012)
> 160-krát citována
Frank Slack
2005 Asociace mezi let-7, onkogenem RAS a karcinomem plic
Gyorgy Hutvagner & Philip Zamore
2002 Popis efektorové dráhy mikroRNA
Carlo Croce & George Calin
2002 Popis funkce miR-15/16 u CLL
MikroRNA
- Jednořetězcové nekódující RNA molekuly (18 – 25 nt)
- Posttranskripční regulace genové exprese
- Jednotlivé miRNA mohou regulovat až stovky
cílových genů
- Jeden gen může být regulován více miRNA
- Geny kódující miRNA jsou často klastrovány
(klastr miR-17)
- Geny miRNA jsou lokalizovány v mezigenových
oblastech, v intronových oblastech nebo antisense
řetězcích znamých genů
- Vysoce stabilní molekuly -> vhodné
biologické markery
- Deregulace některých miRNA pozorována u mnoha
nádorových onemocnění
miRNA rodiny
MikroRNA - biogeneze
Sana et al., 2011, modifiedSana et al.; Intech (2012)
IsomiRNA
„Zpracování prekurzorových struktur enzymy Drosha a Dicer není vždy identické..“
Nesprávné nasednutí enzymu – vznik sekvenčních variant respektujících prekurzor
miRNA izoformy, tzv. isomiRs
Onkogenní vs. nádorově supresorové miRNA
Caldas et al., Nature Medicine, 2005
↑miRNA ↓ miRNA
↓ nádorový suppressor ↑ onkogen
ONKOGENNÍ MIKRORNA NÁDOROVĚ SUPRESOROVÁ MIKRORNA
mikroRNA jako nádorové biomarkery
Slaby, Svoboda (Eds.) MikroRNA v onkologii, Galén, 2012 Volinia, Calin, Croce, et al. 2006 PNAS
Shluková analýza 540 vzorků z šesti typů nádorů
založená na expresi 137 miRNA
mikroRNA v tělních tekutinách
Kim et al, CMJ 2015
Silva et al., 2015 Forensic Science International: Genetics
Původ cirkulujících mikroRNA
Redova, Sana, Slaby, 2013 Future Oncology
Biotechnologické společnosti zaměřené na miRNA diagnostiku
mikroRNA jako terapeutické cíle
Výrobce Název léčiva Účinná látka Cílové onemocnění Klinická fáze Status
Santaris
Pharma/Roche
Miravirsen AntimiR-122 Hepatitida C Fáze II dokončeno
Regulus
Therapeutics
RG-101 AntimiR-122 Chronická hepatitida C Fáze II dokončeno
RG-125 AntimiR-103/107
Nealkoholická
steatohepatitida
Fáze I probíhá
RG-012
Lademirsen
AntimiR-21 Dědičná nefritida Fáze II probíhá
RGLS4326 AntimiR-17
Autozomálně dominantní
polycystické onemocnění
ledvin
Fáze I probíhá
miRagen
Therapeutics
MRG-106 AntimiR-155
Kožní T-buněčný lymfom,
mykóza fungoides
Fáze II probíhá
MRG-110 AntimiR-92 Poranění Fáze I dokončeno
MRG-201 miR-29 mimic
Keloidní jizvy /
Scleroderma
Fáze II probíhá
EnGeneIC TargomiRs miR-16 mimic
Maligní mezoteliom
pleury; nemalobuněčný
karcinom plic
Fáze I dokončeno
Mirna
Therapeutics
Inc.
MRX-34 miR-34 mimic Různé solidní nádory Fáze I ukončeno
Jaký je rozdíl mezi miRNA a siRNA?
- Funkce obou je regulace exprese
- siRNA je původem dsRNA
- siRNA souvisí s cizorodou RNA
(obvykle virovou) a je 100% komplementární
- miRNA je původně ssRNA, která formuje
vlásenkové dsRNA struktury
- miRNA reguluje post-transkripční genovou
expresi
He and Hannon, Nature Reviews Genetics, 2004
Základní metodické přístupy analýzy nukleových kyselin
Typ technologie
Amplifikační
Hybridizační
Sekvenační
Hlavní princip
Kvantitativní PCR
DNA hybridizace
Sekvenování
Real-Time PCR
nejpoužívanější a nejstandardnější metoda studia genové exprese
vs. end-point PCR
+ + +_ _ _
jamky pro
nanesení
vzorků
konec gelu
směr
migrace
DNA
fragmentů
kratší
fragmenty
DNA
delší
fragmenty
DNA
- pól
+ pól
Real-Time PCR – způsoby detekce
Real-Time PCR
nejpoužívanější a nejstandardnější metoda studia genové exprese
Real-Time PCR
absolutní vs. relativní kvantifikace
Reference – obvykle nějaký housekeepingové geny
jsou aktivní ve všech buňkách zajišťují základní funkce
buněčného metabolismu:
syntéza nukleových kyselin a proteosyntéza,transport živin a
jejich zpracování, biosyntéza cytoskeletu a organel (GAPDH,
HPRT1, ACTB, B2M,….)
Vztah integrity RNA a Ct prahového cyklu
Real-Time PCR specifická pro konkrétní mutace
Analýza mutací v genu EGFR pomocí Real-Time PCR
Analýza mutací v genu EGFR pomocí Real-Time PCR
Osimertinib se používá k léčbě lokálně pokročilého nebo
metastazujícího nemalobuněčného karcinomu plic, pokud jsou
nádorové buňky pozitivní na mutaci T790M v genu kódujícím
EGFR nebo na aktivační mutace EGFR. Mutace T790M může být
de novo nebo získaná po léčbě první linie jinými inhibitory
tyrozinkinázy EGFR, jako jsou gefitinib nebo erlotinib.
Real-Time PCR arrays
- TaqMan Low Density Array (ThermoFisher Scientific)
- 80 ng celkové RNA
- 730 miRNA
- microRNA Ready-to-USE PCR panels (Exiqon)
- 40 ng celkové RNA
- 752 miRNA
High resolution melting (HRM) – analýza tání s vysokým rozlišením
Analýza metylačního stavu promotoru pro gen MGMT pomocí HRM
Bisulfitová konverze - EpiTect Bisulfite Kit (Qiagen)
High-resolution melting (HRM) analysis - LightCycler 480 High Resolution
Melting Master kit (Roche)
Analýza metylačního stavu promotoru pro gen MGMT pomocí HRMPacientAPacientB
Umlčení genu MGMT a přínos temozolomidu u pacientů s glioblastomem
Hegi et al., 2005 The New England Journal of Medicine
páruje se s thyminem
Reverzní transkripce
- Přepis RNA do cDNA (vyšší stabilita)
- Katalyzováno reverzní transkriptázou (retroviry)
- reverzní transkriptázy využívají retroviry (např. virus Rousova
sarkomu, virus lidské imunodeficience - HIV)
- Primery: random (hexamery), oligo-dT, specifické
Reverzní transkripce - mikroRNA