Úvod do molekulární medicíny C7188 4. Metodické prístupy v molekulárni medicíne - čipové technológie Mgr. Júlia Bohošová, Ph.D. podzim 2024 (Vysokokapacitní) metodu - kvantitativní PCR/PCR arraye - microarrays (hybridizační čipy) - sekvenování nové generace (NGS) Typ technologie Hlavní princip Doplňující metody Příklad aplikace amplifikační kvantitativní PCR reverzní transkripce qPCR array, qPCR hybridizační hybridizace NK reverzní transkripce, PCR, fragmentace ... DNA microarray - exprese, SNP/CNV, arrayCGH apod. sekvenační sekvenování fragmentace, reverzní transkripce, PCR, hybridizace... sekvenování genomu, transkriptomu, vysokokapacitní screening mutací, analýza komplexních mikrobiálních vzorků apod. Hybridizace nukleových kyselin tvorba dvou řetězcových hybridů z dvou jednořetězcových a komplementárních molekul založena na schopnosti denaturace a renaturace NK (annealing) dáno komplementaritou bází, tzn. formací vodíkových vazeb mezi A a T (případně U) a mezi G a C dvojšroubovice DNA vysoká s,,//////im\>Í teplota nebo vysoké pH denaturace na jednoduché řetězce (po narušení nukleotidových párů) renaturací se obnoví dvojšroubovice DNA (znovu se spojí nukleotidové páry) Hybridizace nukleových kyselin při renaturaci se mohou tvořit hybridní molekuly DNA/DNA, RNA/RNA i DNA/RNA! rozsah renaturace odpovídá rozsahu komplementarity sekvencí (homoduplex, heteroduplex) Tri i i i i i úplná částečná hybridizace v roztoku, na membráně, in situ zadná Southernův přenos - DNA northernový přenos - RNA / ji t n i m m i ///// t n lim 11' Ul IIIIII I mutt '//II IUI II I f Fi :cr pat>c.' BuHer značena Weight Paper towels Nitrocellulose filter Gel Hybridizační sonda komplementární k sekvenci testované molekuly dvouřetězcové molekuly DNA jednořetězcové molekuly DNA molekuly RNA syntetické oligonukleotidy FISH: Fluorescenční In Sítu Hybridizace fluorescein (zelená fluorescence) rhodamin (červená fluorescence) kumarin (modrá fluorescence) - mikroskopická molekulárně-cytogenetická metoda (80. léta 20. století) - cílené vyšetření předem určených chromosomových oblastí/ genů/ telomery/ centromery atd. pacienta - použití fluorescenčních sond s vysokým stupněm komplementarity - detekce fluorescenčním mikroskopem - hodnotí se počet a poloha signálu - početní i strukturní změny v genech FISH e o M O £ o jádro zdravé buňky ehr. 9 ehr. 22 jádro nádorové buňky s translokací t(9;22)(q34;q11) fúze chromozomů 9 a 22 mezi lokusy q34, resp. q 11 (Filadelfský chromozom) OJ E öS £ >. o I .s £ m O c OJ tu 4-- l_ c o n 0 o IN "> II 1 o 3 -Q D 22q11 sonda 9q34sonda značená Cy5 značená Cy3 chr.22q11 chr.9q?4 Q. O Ol u c o € -S o T Q. denaturace & hybridizace sond Strukturní chromozómové aberace Filadelfský chromozom & fúzní protein BCR-ABL & inhibitory tyrosinkináz - 1960 - Filadelfský chromozom - 1973 - fúzní protein BCR-ABL - Tyrozinkinázová aktivita ABL je konstitutivně aktivována přiblížením genu BCR v genomu => zvýšené přežívání a proliferace leukemických buněk Variace v počtu genů Copy n um ber variation (CNV) Amplifikace nebo delece jednoho genu nebo části chromozomu -> amplifikace onkogenu -> delece nádorového supresoru HER2 receptor Herceptin Cell membrane Herceptin---- Signaling pathways CEP 17 HER-2/neu Klinicky relevantní příklady: amplifikace HER2: delece CDKN2A: amplifikace EGFR: citlivost k Herceptinu (trastuzumab) u karcinomu prsu společně s inaktivací Rb je spojena s citlivostí k inhibitorům CDK4/CKD6 citlivost k cetuximabu u karcinomů prsu a žaludku 1 normal low-level amplification! • V I high-level amplification FISH - diagnostické využití Diagnostika melanocytárních lézí- benigní vs. maligní (melanom) CNV analýza CCND1 (cyklin dependentní kinázy) a transkripčních faktorů RREB1, a počtu chromozomů - čtyřbarevná FISH Karcinom prsu rnalign benign zvýšený počet kopií genu HER2 předpovídá citlivost na trastuzumab (Mab) Karcinom plic translokace genů ALK (fúze EML4-ALK) a ROSÍ předpovídají citlivost k inhibitorům tyrosinkináz FISH - diagnostické využití Další aplikace - karcinom prsu - zvýšení počtu kopií genu HER2 je podmínkou pro nasazení MAb (trastuzumab) - karcinom plic - přítomnost translokací genů ALK, ROSÍ predikuje účinnost léčby - preimplantační genetický screening (PGS) vybraných chromosomů (chromozomy 13,15,16,18, 21, 22, Xa Y) Limitace - časově náročné, nutná optimalizace - limitovaný počet abnormalit - počet barev - není vhodná pro screening - málo citlivý na detekci ztráty chromosomů nebo delece oblastí/genů Komparativní genomová hybridizace (CGH) stanovení relativního počtu kopií mezi dvěma genomy nelze detekovat balancované translokace a inverze, obecně kvantitativní změny současná hybridizace dvou vzorků DNA značených odlišnými fluorochromy na normální metafázní chromozomy fixované na podložním skle DNA pacienta (nádorová) značena zeleně (FITC) sonda kontrolní DNA (DNA zdravého jedince) značena červeně (TRITC) m * t Z7' 21 j 21 3.Í ' 21 21p 7q 21q Balanced Translocation 7 7 Unbalanced Translocation Princip chromozómové CGH Metafáze normálních chromozomu Výsledek chromozómové CGH - vizualizován pomocí fluorescenčního mikroskopu - pro každý fluorochrom je obraz snímán kamerou do počítače - speciální software měří intenzitu obou fluorochromů podél každého chromozomu - výsledkem analýzy: CGH profil - poměr intenzit signálů obou fluorochromů - poměr 1 = nedošlo k žádné kvantitativní změně - poměr <0,75 = delece - poměr >1,25 = duplikace, amplifikace 0.8 1 1.2 IIII llll iii iid ii hill nn i i ixhiiijj (EXE [ioir«: mm pcom e ( ii l 91 II ipnaaii pnnm) ii i mood pi: pm: in i 19mm: am: hi ii in imn P»: [mm lamro ■i i amnM: pi: in linii*: ii ii IdEBTXl una [tan iiniiiii in _ it ■ ii jih i n i r mm pnnnm □Dam iiiiihiii 11 ii i mi mi IcniiiiiNii [umijrjD Nutnost kvalitního materiálu (chromozomy, DNA) Nahrazení chromozomu fragmenty DNA metoda CGH probíhající na čipu, tzv. array-CGH Čipové technologie/microarrays array dvoudimenzionální uspořádání mnoha sond (mikro, nano, ...)čip DNA RNA Gene Alternate SNPs -ChIP/LA -Expression- Splicing - miRNA Chromosome DNA Gene promoters mRNA mRNA variants microRNAs Genomová array CG H (aCGH) genoinická DNA ■ fragmenty DNA druhá pol. 90. let stejný princip jako CGH fragmenty DNA uchyceny na skle/čipu fragmenty na přesně dané pozici opačné značení kontrolní a sledované DNA než u CGH opět početní i strukturní změny v genech Genomová array CGH (aCGH) Arrav-CGH analysis 1 Mb array-CGH (NMC BAC-array with '18.000 DNA spots) ■J=l ra ■ CM o Reference DNA Test DNA jtrar : _ilvr. vmatftríd gaircú ir -czt qeiorne TJ T D IT ........... Matrix CGH ■liriHinlDNt .ip"" ................. C f ) 6 Kb array-CGH (Agíient oligo-arroy with 244.000 DNA spots) Platformy aCGH Cílené (hot spot) Chromozómové Celogenomové aCGH v onkológii kolorektální karcinom karcinom děložního hrdla 12 3 4567 8 9 10 11 it 8 12 13 14 15 16_17 18 19 20_21 22 X 1 2 345678 9 10 11 ■33ů «079 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 Genomová array CGH (aCGH) Resolution Coverage a Cytogenetics Karyotyping > 10 Mb Complete SKY > 2 Mb Complete Traditional CGH > 2 Mb (cytoband) Complete FISH (interphase) > 20 Kb Probe Specific FISH (metaphase) > 100 Kb Probe Specific h aCGH BAC 100 Kb (Spectral Genomics - 2 Mb) Complete cDNA 2 Kb Genes Only Oligo (60-mer) 0.06 Kb Complete Typy čipů podle fragmentů YAC [Yeast Artificial Chromosomes] (0,2-2 Mb) BAC [Bacterial Artificial Chromosomes] (300 kb) PAC [Pl-derived Artificial chromosomes] (130-150 kb) cDNA(2 kb) oaCGH - oligonukleotidy (0,06 kb) Rozlišovací schopnost aCGH závisí na typu použitého vektoru -tzn. na délce a množství nanášených fragmentů a na jejich skutečném zastoupení v rámci genomu. V každém případě je však řádově vyšší než u chromozómové CGH!! tilling assays menší fragmenty souvisle pokrývající genom/sledovanou oblast = vyšší rozlišovací schopnost DNA microarrays (čipy) Miniaturizované zařízení nesoucí na svém povrchu imobilizované fragmenty nukleových kyselin v přesně určeném uspořádání. Tyto fragmenty jsou sekvenčně derivované tak, aby mohly specificky hybridizovat s testovaným genetickým materiálem, který je předem speciálně označen za účelem posthybridizační detekce._______ Základní dělení DNA čipů Dle charakteru detekce pasivní - pracovní podmínky pro všechny hybridizační jednotky jsou stejné - Affymetrix, Agilent aktivní - pracovní podmínky každé hybridizační jednotky lze ovlivňovat individuálně - Nanogen Dle typu sond cDNA čipy-Agilent oligonukleotidové čipy - Affymetrix Dle počtu sond vysoko hustot ní DNA čipy (celogenomové) - Affymetrix, Agilent, nízkohustotní DNA čipy (stovky genů) - Eppendorf, Superarray,., ;(i jjjjiíljflwffl "V1'1'' STi '.'i'.V'.'f'v/.1-'^ mm. ilent vs. Affymetrix Gene Chip' Agilent Glass slide microarray Testovací RNA (cDNA) Referenční RNA (cDNA) značená Cy5 značená Cy3 Affymetrix Gene Chip Testovací RNA (cDNA) značená biotinem cDNA čipy (Agilent) - jako sondy cDNA (komplementární DNA) - transkriptom - poslední dobou vytlačovány oDNA čipy - využití cDNA knihoven (mRNA->cDNA) cDN A. knihovna PCR amftlíflkace uložené cOHA pornocí primeru s pccíf íckĎho pro daný yeti nobo utíľtor +. Ha n escrri a fixace cU NA s tmi / ^jggijr cDNA EXPRESNÍ KNIHOVNA mRNA -> reverzní transkripce -> cDNA -> fragmentace-> + univerzální vektor -> inkorporace do plasmidů -> transfekce bakterií -> uskladnění bakteriálních klonů v jamkových destičkách -> (1 bakteriální klon obsahuje plasmid s jedním cDNA fragmentem) Výroba cDNA čipů - materiály pro snadnou imobilizaci DNA sond (sklo) - povrch se musí upravit - silany na povrchu (aldehyd) + amin na 5' konci sondy -> kovalentní vazba (Shiffova baze) - na povrchu poly-L-lysin -> sonda se váže elektrostatickými silami Nanášení cDNA - Čipovač - Microarrayer - Spotter Výroba cDNA čipů Nanášecí tělesa I) Kontaktní systémy a) bez zásobníku - plné hroty (solid pins) b) se zásobníkem (250-lOOOnl) - přepraví 0,25 - 5nl, hybridizační jednotka 75-350 um - štérbinovité hroty (split pins) - pinzetovité hroty (tweezers) II) Bezkontaktní systémy a) „ink-jet" (kapacita až lOOOOnl) - piezoelektrický (4-100nl) - elektromagnetický (0,05-lOnl) b) „bubble-jet" Touch £-L rl3.CE Deliver drop □ □ EE ■ □ EE EXE • Q D H B D m m • • • • • • • ■ • • • • • • • • • * • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • m m • • • w W w • • • • • • u • • • • • v • • • • cDNA čipový experiment Hybridizujeme na jednom čipu značenou ss-cDNA získanou z testovaného a referenčního vzorku. Proto je nutno každou ss-cDNA označit rozdílným fluorochromem. Standardně: referenční ss-cDNA je Cy-3 - zeleně a testovaná ss-cDNA Cy5 -červeně Po hybridizaci následuje vymytí přebytečného materiálu a čtení (skenování) čipu pomocí fluorescenčního skeneru Cy!i Cy3 Cy5 Cy3 -srn 9000 Cy3 Snížená exprese genu Cy5 Zvýšená exprese genu l0& fi^r] 10000 4800 300 50.00 1.00 0.03 5.64 0.00 -4.91 Excitace hyhFMlizaóních jmlriEtlHfc [fyiinii Itat er iivýin i paprsky. Intenzita ziŕení emítavanähu odBsnymI íluoroclirnniy nrfjjuvMÍá alisaľtn testovane (Cyi) a r&íurenĽn[(Cyll cD NA na nŕtslušn é jednotce. Poměr CyS/Cyi je vyjádřen V fhSEurfUfcllWtílrtlHlI zobrazení Syntéza JHdrn>vÍákiirivEÍ cDNA, značené odlEä nýmil fluores. rencnímŕ lálkani Cy3 a Cy5 Biiŕiky/ikäň/ referenční vzorek Hyhriili/fiíiH C.y.) - Smícháni referenční ľdha / Cy5-\^ testovaní. ľ d ha .i 11 i -1—! L| I I I I I ■ MU .1 -i 1111 r r r _■-f— TTTTTTfT ■ ■ II I I I I I —I I I II I I I 1 Testovaný vzorek Testovaný vzore k ill ndta lEÍHťiiĽiií c.2 oDNA čipy (Affymetrix) - oligonukleotidové čipy - jednovláknové fragmenty NK o délce -25 bazí Combining databases, empirie knowledge 5' atg STOP 3' T_ Ě00 bp Probe set; - at least 11 unique oligos (25-wers) - spread over 600 bp 3'-end - spread over the whole chip - match-mismatch oligos príprava oligonukleotidovych sond mRNA sekvence daného genu -> virtuálně vyselektováno 11-20 specifických oDNA úseků reprezentujících daný gen -> reverzní transkripce do sekvence cDNA -> fotolitografická syntéza přímo na povrchu čipu z. oligos match □□□□□□□□□□□ oligu mismatch j ]□■□■□□■ -//___—____ -*«- -řť- ^ -S*- -K- -M- DNA piUtlT |BU> Hi-ÉrttT* r M-f\m\mr - TGTGAT GGTGGG AATG GGTCAGAAGGACTCCTATGTGGGTGACGAGGCC ■ ""aaTGGGTCAGAAGGACTCCTATGTG AATGGGTCAGAACGACTC C TATGTG v^j, IViln i u li celí ptnbe Ddh Výroba oDNA čipů - série masek nukleotidy s protektivní skupinou ozáření UV světlem začlenění do řetězce Klady a zápory Mnoho masek - Nákladná výroba +/- Komerční výroba + Vysoká hustota sond Lioht f h-n-, Depfotťcted featuf« Lithographic mjik M crojruy Iwjfcr) 1.28 cm +9 A /M A AH m PAA ■Im Stvoral kuk Muíitti oľ sťlutjíin: li^lil lI i njĽCťil í Linb&r nitiIuj.uL 9 ľnHi^tivi.1 i;miip . U V li«hi A C Nuckiitidfi! miliony kopií sondy 5 /jm ■ŕ S555ň>-i-y u O U Ľ u o u u o agcfl Ľ Ľ Ľ H 1 |§II S S s 5 K í) M S (i K " c ° O O 15 <3 6,5 mil hybridizačních jednotek 5 fjm bioinformatická analýza Mikročipy - diagnostické využití Agilent Oligo Microarray kit, Agilent Technologies - 60-ti nukleotidové próby JGOO □□□□ analýza exprese 70 nejdůležitějších genů spojených s recidívou karcinomu prsu AGE N DIA MAMMAPRINT Provide Physician Guidance High Risk Low Risk 1 Ultra Low Risk analýza exprese 80 genů, které klasifikují podtypy karcinomu prsu a odpověď na systémovou léčbu r Luminal AGENDIA BLUEPRINT Results and Treatment Insights HER2 Basal Přínos Žádný přínos Žádný přínos chemoterapie chemoterapie chemoterapie Přínos endokrinní Přínos endokrinní Bezpečná redukce léčby léčby endokrinní léčby Roste pomaleji Pravděpodobná odpověď na endokrinní léčbu Roste rychleji Roste rychleji Lze často úspěšně Obvykle nereagují léčit cílenou anti- na endokrinní HER2 terapií nebo anti-HER2 léčbu Nedávný převod MammaPrint z testu založeného na mikročipech na NGS! Základní zpracování dat - převod obrazové informace (digitalizovaný obraz) na numerická data - software identifikuje jednotlivé spoty - rozdělení pixelů na popředí (intenzita spotu) a pozadí - kvantitativní data/ kvalitativní (signal-to-noise ratio) Scratches Bright array elements 'bleeding' into nearby spots Background signal Pixel Spot signal Spot area to be surveyed -Kvalita čipu -Identifikace spotů -Kvantifikace signálu -Měření pozadí -Odstranění hodnot (mimo rozmezí) -Odečtení pozadí Základní zpracování dat - před statistickou analýzou chceme minimalizovat nebiologickou variabilitu (technologická) - nutná normalizace dat - porovnání např. exprese genů mezi různými hybridizačními běhy - vychází z předpokladu, že počet genů se změněnou expresí je méně než genů s nezměněnou - úprava střední hodnoty exprese (přizpůsobení distribuce všech poměrů intenzit k hodnotě celkového mediánu k hodnotě 1) Před loess normalizací Po loess normalizaci odhadnutí lokálních trendů/regrese závislé na intenzitě signálu tzv. vyhlazování Neparametrická lokální vážená regrese LOWESS odečteni od původních hodnot V: • Základní zpracování dat Vzorek j- "—I-i-*—■-:-* Sada vzorků Original data Ap Bp Cp Fp Xp Dp Ep Ar Br Cr Fr Xr Dr Er Normalised data 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 ■ i : O 0 o O 0 o 0 O 0 o 0 O 0 o —\-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-r Ap Bp Cp Fp Xp Dp Ep Ar Br Cr Fr Xr Dr Er Základní statistická analýza dat Neřízené(unsupervised) metody - vstup pouze naměřené hodnoty - shlukovací analýza - dendrogram - analýza hlavních komponent (PCA) Variables factor map (PCA) RCC-3X Z*■ ROC 25 ^^^RCj^-24 RCC-17*" / RCC-6 3 «7 ■? -> a n ^ co < Ej u-i < r) r- O r- *j T- (q - /, <> 1-- <£> ^Supervised" metody - testování rozdílů - hodnoty i další informace - Fold change - statistická významnost změny Volcano plat: AD versus c ontrcls o * downresulated 5 t * set A; reliable biomarker * s.et B: rn formative biomarker 0 * t * * v 5 ' fi A.. log; (Fold change) dat díst hclust (*, "complete") Shlukovací analýzy Hierarchické shlukování - hledáme geny/vzorky s podobným chováním - iterativní porovnávání expresních profilů - podobnost vyjádřena hierarchickým stromem - dendrogramem Metoda nejbhzsiho souseda A B C D E A 0 1 2 3 4 B 0 3 4 5 C 0 4 5 D 0 1 E 0 A, b d, e A, b c d, e A,B,C D,E 0 2 3 A,B,C 0 3 0 4 D,E 0 0 A* B* C« D< Metoda nevzdálenějšího souseda Metoda průměrné vzdálenosti Metoda Wardova im iH "í n m iú lq n ^ S1 51 t; i) t) í m n n Dobrá prognóza DF5>36m Spatná prognóza Df5<3fjm Příklad využití hierarchické shlukovací analýzy H! TJ -""AJ- ■ i ■ 1 DI_Oi_-lKH# gj_o_-oceo DLCL-do-4 r.i L"! iJ.-HF. L3LCI_ DTMa ni_Ci_-i_Oyfc. BU-j^ O :M.i.-L-jľJ-^:d^GL »^>eii BtvjĽ S y..'.-LjfJ 2-11- . : ;: -• ;:;'' ,., U=o> = : ŕíí'.H! ÍUJÍ i --=■ sThn. Fitrj; : oni- ■- - s...... Hloc.= I MjQľiiil.-il .~Ľid4 l^nslirT-_ rw-JTMů ^1 fiinji cm+iiPsnm Mapping 100K array => Genome-wide Human SNP array 5.0 (500K) => Genome-wide Human SNP array 6.0 (1.8 million) Figure 1: Overview of the Genome-Wide Human SNP Assay 5_(W>_0. ) t f t f ] Nip I Nspl Nspl Sty I íly I Í1j I I HE digestion I RE digestion Msp adaptor ligation Sty adaptor ligation Sondy navržené pro detekci SNP PCR: Ona primer amplification Umožňuje: Detekci SNP Počet kopií daného genu (amplifikace, delece, aneuploidie) Ztráta heterozygotnosti Fragmentation and end-labeiing Hybridization and wash PCR: One primer amplification Affymetrix SNP čipy How the GeneChip* HuSNP™ Array Calls Genotypes -4 ■1 0 +1 +4 f/mA mmA uuA uuA umA fmA pmA PwA pnA pwA pmB iľ pmB p\iB M M B mmB Mr,' B HUB mmB Wi Ti I' M XC A Sequence ... G G T G AT TAT Q g A C C T A C T A T . . Probe Sequence C C AC T A AT A C A T G G AT G ATA mmA Allele a c c a c T a at a c T t G G a t G a t a, pmA c c ac ta ata c C TG G at G at a pmB CCACTAATaCGTGGATGATA mmB Allele E m i : . " B 11 ■ Genomic DNA reference sequence _A -c- Tiling Quältet PMA TTGCAGTG CAAG T ACAGTAAGCTCA MMA TTGCAGTG CAAG A ACAGTAA GCTCA P MB TTGCAGTG CAAG G ACAGTAAGCTCA MMB TTGCAGTG CAAG C ACAGTAAGCTCA Pro každou alelu 5 sond + 5 párových sond s nukleotidovou záměnou (šum pozadí) BB « ■ ■ HpR ML— Přítomnost SNP Hledané alely: AA, AB, BB Intenzita signálu: počet kopií Affymetrix SNP čipy Detekce SNP Počet kopií daného genu (amplifikace, delece,...) Ztráta heterozygotnosti Normal Pattern (CN.2V Log R ratio = 0 B allele frequency shows heterozygotes (AB) at 0.5 and homozygotes (AA or BB) at 0 and 1 Deletion fCN=1): Log R ratio <0 B allele frequency shows loss of heterozygotes Duplication (CN=3): Log R ratio >0 B allele frequency shows a split' of the heterozygotes at 0.5 eaurvalent to AAB and ABB Copy neutral LOH (CN=2): Log R ratio = 0 B allele frequency shows loss of heterozygotes mu delece 15 0 .5 t Trend: More Microarray Applications DNA iGene Alternate SNPsf -ChlP/LA-Exbressiorr- Splicing - miRNA DNA \ Gene promoters /mRNA mRNA variants microRNAs RNA Key requirements Sensitity Specificity Flexibility Informatic ChIP-on-chip technologie - kombinace chromatinové imunoprecipitace a čipové technologie - které geny jsou regulovány známými transkripčními faktory/DNA vazebnými proteiny? Protein/DNA interakce Technologie čipu k detekci methylace CpG oblastí V současnosti nejpouzivanejsi EPIGENETIKA genomic DNA with 5-methyl-cytosirs? mí> wit m \ i im \\ \ \ \ Sonlcatlon Imnrvunoprec Ipitatlon with anJi-5-rnethyl-cytJOsine antibody ' i, if u Můthylatsd DNA Lůtui r.'-r-!..!,-i.r-: r \ w 1111111111 S1 Unmsthyfalsd hasii type *\ w lllllllll Bez Mab Bisulfitová konverze Methylace = C Nemethylace = C -> U -> T Hybridize wIlling array ylatfld DNA Loche -CA -O r r - L C I -g r Identify methylated cytokine across genome Mr u,. M* M, - AntGCGCTOAGGCCTGCTCCGCATATAGCGCA ■ Např. Illumina, Agilent Technologies. 1 demographics Frequency % Age Distribution Male:Female Ratio CLINICAL FEATURES Histology (%) Classic (CLA) Desmoplastlc/Nodular (DN) Large Cell/Anaplastic (LCA) CIA ON LCA Metastatic (M +) ^M+-35% Overall Survival molecular features Driver Events Cytogenetics GFI1/GFI1B activation OTX2 amplification 1q. CLA DN LCA r im+~57% O^^B- ---- - CLA ON LCA c im+~56% _ CLA ON LCA M+ -58% ::::: CLA ON LCA UYC amplification GFI1/GF11B activation KBTBD4, SMARCA4 CTDNEP1 KMT2D mutation 1|* 9*1* MTq MYCf MYCN amplification 7+ M7q None MYCN amplification I17q □ 7+ 14qt 7« 12, I n*f* Tri*mv* * ruin +"X' CLA ON LCA ^-45% CLA ON LCA ^+-45% PRDM6 activation MYCN amplification 7+ M7q \2* L8. e-ii- KBTBD4 mutation •V1' 7+ H7q CLA ON LCA Mt -50% PROMO activation KOMM. ZMYM3 KMT2C mutation f17q Trend: More Microarray Applications DNA Chromosome Gene I Alternate SNPs -ChlP/LA-Expressfcrr- Splicing - rhiRNA DNA Gene promoters mRNA \ mRNA variants/ microRNAs Key requirements Sensitity Specificity Flexibility Informatic: Technologie exonových čipu umožňuje detekci sestřihových variant známých genů sondy pro každý exon známých i predikovaných genů -> sestřihové mapy exon junction - sondy proti sestřihovým místům exon 1 exon 2 exCm J emn i pre-RNA Transcript —[ Isoform 1 Isoform 2 Isoform 3 C Probe layout: isoform ,i \ i r Microarray platform: standard expression isoform b ^] splice junction Conventional Array Probes ehe AU Exon Array Probes min III I Uli II II II II c:=*t* <=:==##** exon-centric Alternativa - analýza fúzních transkriptů Trend: More Microarray Applications DNA RNA Chromosome Gene Arte matt. SNPs - ChIP/LA-Expression- Splicing! - rrilRNA DNA Gene promoters mRNA mRNA variaVts microRNAs Key require merits Sensitity Specificity Flexibility Informatic: mikroRNA microarray - analogická technologie jako u DNA čipů AY; GeneChip miRNA Arrays (Affymetrix) 130 ng celkové RNA verze 4.0 2578 lidských miRNA + 2025 pre-miRNA, 1996 snoRNA X£ SurePrint Human miRNA Microarrays (Agilent Technologies) 100 ng celkové RNA verze 21.0 formát 8x60K 2549 lidských miRNA "^fP RNAmolecule ATP Poly A Polymerase / Poly (A) tail Poly (A) tailed RNA 3' FlashTag Ligation Mix Ligase Biotin-labeled3DNA® tttt nnnn Biotin-labeledRNA Biotin detection with Streptavidin-PE Single Feature on Affymetrix® GeneChip® miRNAArray Závěr - v současností nahrazovány NGS - limitace počtem fragmentů od již známých genů, miRNA, atd. - cena (nemůže soupeřit s NGS) - není explorativní experiment ve správném slova smyslu - použití spíše v klinické diagnostice (aCGH, SNP, DNA, methylace)