Ctirad Hofr LifeB – Laboratoř interakce a funkce esenciálních Biomolekul Fluorescenční metody ve vědách o životě – cesta od molekuly k buňce C7230 FGP – Funkční genomika a proteomika NCBR – Národní centrum výzkumu biomolekul Přírodovědecká fakulta | Masarykova univerzita ÚVODNÍ PŘEHLED 2 Otázky a odpovědi • Co je náplní přednášek? • Jaké budou praktické úlohy v cvičení? • Kde se dají získané poznatky využít? • Jaká bude organizace výuky? Proč spektroskopické metody? Poskytují kvalitativní a kvantitativní údaje, což usnadňuje srovnávání molekul a celých biologických systémů. Proč fluorescence? Umožňuje nám vidět pouhým okem, co bychom jinak neviděli. 3 Obsah přednášek I • Absorpční a fluorescenční spektroskopie v biologické analýze molekul • Vlastní fluorescence proteinů • Časově ustálená – Steady state a časově rozlišená - Time-resolved fluorescence 4 1/5 Obsah přednášek II • Zhášení fluorescence, fluorescenční rezonanční přenos energie – použití při sledování interakce a strukturních změn biomolekul • Anizotropie fluorescence a její změna při vzájemné vazbě biomolekul Obsah přednášek III • Nevlastní fluorescence - fluorescenční značky, sondy a indikátory • Fluorescenční značení DNA a proteinů • Analytické použití fluorescence pro stanovení koncentrace molekul 7 Demonstrační pokusy na přednáškách Věříme tomu, co vidíme • Praktické ukázky a demonstrace podstaty jevů jsou zařazeny do výkladu tak, aby objasnily principy • Pozorování prováděných experimentů navíc podporuje upevnění znalostí všemi smysly. 1/8 2. Praktické úlohy – cvičení C7235 • Měření spektrálních charakteristik proteinů a nukleových kyselin • Stanovení koncentrace nukleových kyselin a proteinů za použití fluorescence a UV-VIS absorpční spektroskopie • Vliv pH a teploty na spektrální vlastnosti fluorescenčních sond • Měření vlastní fluorescence proteinů • Příprava fluorescenčně značeného proteinu • Stanovení účinnosti fluorescenčního značení biomolekul • Vizualizace makromolekul při elektroforetické separaci • Využití fluorescenčního rezonančního přenosu energie (FRET) při sledování hybridizace komplementárních řetězců nukleových kyselin • Sledování změny intenzity fluorescence po relaxaci vlásenkové struktury fluorescenčně značené DNA • Fluorescenční mikroskopie vlastnoručně připravených fluorescenčních vzorků • Studium interakce biomolekul za pomocí anizotropie fluorescence – vazba proteinu a fluorescenčně značené DNA Fluorescenční značení biomolekul gelová filtrace separuje nenavázané fluorofory po značení fragmentu DNA Studium vazby DNA a proteinu Anizotropie fluorescence EmiseEmiseEmise detektor ⊥ ⊥ + − = 2II II r ΙΙ ΙΙpolarizátor analyzátor Snížení pohyblivosti po vazbě proteinu -> pomalejší změna uspořádání molekul -> zvýšení anizotropie fluorescence r Excitace t~n s 0 5 10 15 0,20 0,25 0,30 F.Anisotropie Protein c (M) Vazebná konstanta K -> ΔG Nízká anizotropie Vysoká anizotropie Experimentální uspořádání při měření anizotropie fluorescence r Záznam změny anizotropie fluorescence r po vazbě proteinu na DNA Fluorescenční mikroskopie – sledování značených biomolekul přímo v buňkách Fluorescenční emisní (A) a UV/Vis absorbční spektrum (B) fluorescenčně značené DNA Spektroskopická charakterizace fluorescenčně značené DNA A B Real-time PCR – detekce amplifikace DNA Emitor Zhášedlo F primer R primer Intenzita emitovaného záření je přímo úměrná množství amplifikované DNA. Vizualizace biomolekul při elektroforetické separaci Schematické znázornění metodických přístupů použitých při praktické výuce cvičení C7235 Webová stránka předmětů C7230 a C7235 • Učební materiály jsou uspořádány do webové stránky • Přednášky jsou průběžně aktualizovány • Webové stránky obsahují také úlohy navazujícího cvičení https://is.muni.cz/auth/el/sci/podzim2021/C7230/um/web/PBM EBprednasky.html10 Literatura 1. Lakowicz J.R.: Principles of Fluorescence Spectroscopy. Third Edition, Springer + Business Media, New York, 2006. 2. Fišar Z.: FLUORESCENČNÍ SPEKTROSKOPIE V NEUROVĚDÁCH http://www1.lf1.cuni.cz/~zfisar/fluorescence/Default.htm Grafika z knihy Principles o Fluorescence byla pro účely této přednášky laskavě poskytnuta profesorem J.R. Lakowitzem. Poděkování 11 12 3.Kde se dají využít získané znalosti? • Všude tam, kde se setkáte v praxi s fluorescencí a fluorescenční spektroskopií • Když máte vzorku málo pro klasické metody detekce, zviditelníte si vzorek pomocí fluorescence • V každodenní laboratorní praxi – např. detekce biomolekul v gelu a vizualizace fluoroforů pod mikroskopem • V navazujících cvičeních C7235 ! Kde se můžete dozvědět více? F9070 Experimentální metody biofyziky Přednášky odborníků, kteří metody skutečně používají Exkurze do výzkumných laboratoří mezinárodně uznávaných společností C02 – 2.11 Úterý od 15:00 Podzim 2023 CORE075 Do světa biomolekul jaké biomolekuly a proč se vyskytují v buňkách, jak se to vše dozvídáme, jaký je pravděpodobný původ biomolekul Připravujeme Vědecká ilustrace příprava vědeckých obrázků a prezentací. Cílem je zlepšit grafickou gramotnost a komunikaci v oblasti prezentace biomolekul. Praktický výukový kurz obsahuje přednášky, videonávody a případové studie. Pozorování více molekul současně Stain Target Color DAPI Nucleii Blue BODIPY® FL phallacidin F-actin Green MitoTracker® Red CMXRos Mitochondria Orange 15 Průtoková cytometrie - Flow Cytometry Detekce každé buňky zvlášť Rozdělení populace buněk podle velikosti a přítomnosti fluorescenčních sond a značek. Spektroskopie kolem nás 17 Fluorescence, kde bychom ji nečekali 18 Organizace výuky • Úlohy – případové studie • Celkově 4 úlohy • Za úlohy lze získat body, které se připočítávají k testu u zkoušky • V případě úspěšného splnění všech úloh dostatek bodů pro vykonání ústní zkoušky • Omezená doba možnosti řešení úloh – 48 h • Praktická cvičení v rámci navazujícího předmětu C7235 • Blokové – tři dny 9 – 15 hod • Předběžný termín cvičení 1. běh Úterý 9. 1. – čtvrtek 11.1. 2024 2. běh Úterý 16. 1. – čtvrtek 18.1. 2024 Příště: Co všechno svítí na diskotéce? • Naučit se komentovat video od 0:42 do 3:00 Introduction to Fluorescence https://youtu.be/SGFlr1jFNBM?t=42 Příprava na příští přednášku