Ctirad Hofr LifeB – Laboratoř interakce a funkce esenciálních Biomolekul Fluorescenční metody ve vědách o životě – cesta od molekuly k buňce C7230 FGP – Funkční genomika a proteomika NCBR – Národní centrum výzkumu biomolekul Přírodovědecká fakulta | Masarykova univerzita Barevné principy absorpce a fluorescence Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR1 Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR2 Co svítí na diskotéce? Kouř, 1990, Vorel, T. Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR3 Otázky • Jak poznáme ze struktury, že molekula může být fluorescenční? • Jak souvisí víno se zásadním objevem v oblasti fluorescence? • Proč jsou excitační a emisní spektra symetrická? Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR4 Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR5 Světlo je elektromagnetické vlnění • Skládá se z elektrické složky a magnetické složky, které kmitají ve fázi v na sebe kolmých rovinách. • Světlo je charakterizováno frekvencí f a vlnovou délkou l. • Frekvence f určuje kolikrát za sekundu vlnění kmitne, udává se v Hz = s-1 • Vlnová délka udává vzdálenost, kterou za jeden kmit světlo urazí, udává se v nanometrech nm = 10-9 m • Frekvence f a vlnová délka l jsou spojeny vztahem c = l f kde c je rychlost světla -vlnění (c=299 792 458 m s-1 ve vakuu) • Energie E = h f, kde h je Planckova konstanta (6.626 10-34 J s) Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR6 Elektromagnetická vlna 6 l Animace elektromagnetického vlnění http://www.edumedia-sciences.com/a185_l2-transverse-electromagnetic-wave.html z xy c = l f c je konstanta, pak jestliže se zvýší vlnová délka, musí se snížit frekvence, aby byl součin konstantní. Vlnová délka l je nepřímo úměrná frekvenci f. E = h f Čím je větší frekvence, tím je větší energie záření. Čím je vetší vlnová délka l, tím je menší energie záření. B E Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR7 Viditelné spektrum • Z celého spektra záření je pouze malá část viditelná. • Viditelné spektrum je ohraničeno vlnovými délkami 400 nm a 700 nm. http://science.hq.nasa.gov/kids/imagers/ems/visible.html 400 nm 7.5 1014 Hz 700 nm 4.3 1014 Hz Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR8 Intenzita • Intenzita – počet fotonů procházejících v daném směru jednotkovou plochou za jednotku času Intenzita je definována jako výkon na jednotku plochy. 𝐼 = 𝑃 𝑆 Výkon je definován jako energie za jednotku času. Energie fotonu je E=hf , takže celková intenzita pro n fotonů je 𝐼 = 𝑛ℎ𝑓 𝑆∆𝑡 V tomto modelu se fotony pouze počítají a nevnímají se jako vlny. Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR9 Absorpce • Látka pohlcuje světlo • Pro absorpci mono- chromatického světla platí • Lambert-Beerův zákon: • Absorbance je přímo úměrná koncentraci a tloušťce vrstvy roztoku 𝐼 = 𝐼0 ⋅ 10−𝜀⋅𝑐⋅𝑙 𝐴 = 𝜀 ⋅ 𝑐 ⋅ 𝑙 = log10 𝐼0 𝐼 Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR10 Absorbance 1 a poměr dopadajícího a prošlého světla 0.00 0.10 0.20 0.30 0.40 0.50 0.60 0.70 0.80 0.90 1.00 0 2 4 6 8 10 Abs 𝐼0 𝐼 Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR11 Absorbance 2 a poměr dopadajícího a prošlého světla 0.00 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 0 20 40 60 80 100 Abs 𝐼0 𝐼 Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR12 Absorbance 3 a poměr dopadajícího a prošlého světla 0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 Abs 𝐼0 𝐼 Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR13 Luminiscence • Emise světla z nějaké látky; nastává z elektronových excitovaných stavů • Podle původu dělíme luminiscenci na 1.fotoluminiscence 2. chemiluminiscence 1.fluorescence 2.fosforescence Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR14 FLUOrescence • Emise z excitovaných singletových stavů • Prakticky: fluorescenci pozorujeme během buzení a po jeho vypnutí rychle mizí • Doba dohasínání t (Lifetime) je průměrný čas, který uplyne od excitace po emisi – je řádově 1 – 10 nanosekund • pozn. : světlo urazí za 1 ns 30 cm Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR15 FOSFOrescence • Emise z excitovaných (zakázaných) tripletových stavů • Prakticky: fosforescence má mnohem delší dobu dohasínání než fluorescence Doba dohasínání řádově milisekundy až sekundy pozn. : světlo urazí za tu dobu 300 až 300 000 km Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR16 Komentovaný úvod – fluorofor Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR17 Jak poznáme ze struktury, že molekula může být fluorescenční? •molekula je planární •molekula je aromatická obsahuje sytém konjugovaných vazeb Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR18 Frank-Condonův princip o nepohyblivosti „lenosti“ jader při absorpci Absorpce fotonu elektronem – excitace elektronů molekuly je velmi rychlý proces v řádu femtosekund (10-15s). Protože atomové jádro je mnohem těžší než elektron, během absorpce fotonu se nepohybuje. Po absorpci fotonu - excitaci se celá molekula nachází v nestabilním stavu - „je horká“ a vibruje, aby se zbavila energie „ochladila se“. Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR19 Absorpce a emise energie molekulou Energie 0 1 2 0 1 2 Vzdálenost Základní stav Excitovaný stav Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR20 Zářivé a nezářivé přechody mezi elektronovými vibračními stavy molekuly • Délka svislé šipky udává velikost změny energie při přechodu. • Vodorovná osa udává dobu přechodu – čím delší čas potřebný na přechod, tím více vpravo. Delší čas = nižší pravděpodobnost přechodu. absorpce fluorescence fosforescence l t  10-15 s t  10-8 s t  10-3-100 s absorpce fluorescence fosforescence T1 S2 vnitřní konverze mezisystémová konverze S1 vibrační relaxace EnergieE=hf Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR21 Vznik absorpčního ~ excitačního spektra Excitační~ absorpční spektrum udává pravděpodobnost, že při dané vlnové délce dojde k excitaci fluoroforu = jeho elektronů dopadajícím světlem. Spektrum = pravděpodobnost přechodu Výukový materiál společnosti Invitrogen Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR22 Vznik emisního spektra • Emisní spektrum určuje pravděpodobnost, že dojde k emisi fluorescence o dané vlnové délce = barvě. Emisní spektrum závisí na fluoroforu a je typickou charakteristikou fluoroforu. Výukový materiál společnosti Invitrogen Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR23 Nezávislost tvaru emisního spektra na excitačním světle • Tvar emisního spektra se nemění, když se mění vlnová délka excitačního světla. • Mění se pouze intenzita. Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR24 Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR25 Stokesův posun • Emitované světlo má vždy menší energii – větší vlnovou délku l než je energie absorbovaného světla – menší l. • Rozdíl mezi maximem absorpčního a maximem fluorescenčního emisního spektra je specifická charakteristika daného fluoroforu. • Stokesův posun = lem - lex Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR26 Vznik Stokesova posunu Tepelná nebo disipační energie na molekulární úrovni označuje tepelnou energii obsaženou ve vibracích atomů a molekul. Teplo je celkovou vibrační energií všech atomů a molekul tvořících látku. Když molekuly získají více tepla, dodává jim více energie, což způsobuje jejich rychlejší vibrace a zvětšuje mezimolekulární prostor mezi nimi. Moving Molecules - The Kinetic Molecular Theory of Heat | Cool Cosmos (caltech.edu) Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR27 Stokesův zákon Vlnová délka emitovaného světla je větší nebo rovna vlnové délce excitačního světla lem ≥ lex Změna vlnové délka je způsobena tím, že po absorpci záření často dochází k částečné ztrátě energie moleku – tepla při přechodu z vyšších excitovaných elektronových stavů do metastabilního nejnižšího excitovaného stavu. Důsledek – Energie fluorescenčního – emitovaného světla je nižší, než energie absorbovaná excitačním zářením. lEx 520 nm lEm 560 nm Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR28 Experiment Sira G. G. Stokese Slunce Modré sklo okna v kostele Propouští světlo s l < 400 nm Excitační filtr Roztok chininu Sklenice vína Propouští světlo s l > 400 nm Emisní filtr G.G.Stokes 1852, Cambridge Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR29 Co se stane, když zaměníme filtry? Při záměně filtrů , tj. jestliže dáme sklenici vína do dráhy slunečních paprsků, procházející světlo nemá dost krátkou vlnovou délku tj. dostatečnou energi a již nemůže roztok chininu excitovat. Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR30 Animovaný úvod do principů fluorescence • https://www.youtube.com/watch?v=SGFlr1jFNBM Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR31 Příklady fluoroforů • Fluorofory nebo fluoreoscenční barviva jsou molekuly, které fluoreskují. Fluorescenci vykazují zejména aromatické sloučeniny – polyaromatické uhlovodíky nebo heterocykly). • chinin, fluorescein, rhodamin B – nemrznoucí směsi pro chlazení motoru, fluorescenční značení brzdové kapaliny • POPOP – scintilátory • Acridinová oranž, ethidium bromid – DNA • Umbeliferon – ELISA • Antracén, perylén – znečištění životního prostředí olejiJ.R. Lakowicz, Principles of Fluorescence Spectroscopy, Third Edition,Springer, 2006 Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR32 Využití fluorescence v geografii Fluorescein byl použit k důkazu, že řeky Rýn a Dunaj jsou propojeny podzemními proudy. Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR33 Kvantový výtěžek Kvantový výtěžek Q je poměr počtu emitovaných a absorbovaných fotonů. • Udává účinnost s jakou budící fotony vyvolávají fluorescenci. • Kvantový výtěžek může být maximálně 1. • Ve skutečnosti je nižší díky nezářivým přechodům molekul z excitovaného stavu do základního stavu. • Největší kvantové výtěžky mají rhodaminové flourofory (~1) a fluorescein (0.95) http://www.iss.com/resources/reference/data_tables/FL_QuantumYieldStandards.html • Charakteristické je snižování kvantového výtěžku s teplotou – teplotní zhášení fluorescence. Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR34 Excitační spektrum Závislost intenzity fluorescence na excitační vlnové délce při neměnné - konstantní vlnové délce emitovaného záření. lEx scan lEm= konst. Nepřekrývá se rozsah s konstantní l. Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR35 Emisní spektrum Intenzita fluorescence při různých vlnových délkách emitovaného záření při neměnné - konstantní vlnové délce excitujícího světla. lEx konst lEm= scan Nepřekrývá se rozsah s konstantní l. Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR36 Neměnnost tvaru emisního spektra při různém excitačním světle Tvar emisního spektra je nezávislý na vlnové délce excitace. Neměnnost tvaru fluorescenčního spektra je důsledkem toho, že doba trvání excitovaného stavu a kvantový výtěžek složitých molekul v roztoku nezávisí na vlnové délce budícího záření. Výukový materiál společnosti Invitrogen Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR37 Zákon zrcadlové symetrie mezi excitačním a emisním spektrem Struktura vibračních hladin u základního a excitovaného stavu elektronu je stejná, proto absorpce a emise z odpovídajících si vibračních hladin může nastat se stejnou pravděpodobností. To má za následek zrcadlovou symetrii absorpčního spektra a emisního fluorescenčního spektra. Praktické využití: Při velmi malé koncentraci vzorku můžeme z fluorescenčního emisního spektra zjistit jak asi vypadá absorpční spektrum, aniž by se použilo o několik řádů větší množství vzorku. Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR38 Zrcadlová symetrie excitačního a emisního spektra 0 2 0 2 0 1 2 0 1 2 Vzdálenost Abs Emis. 0 2 0 10 1 0 2 0 0 Vlnová délka l Základ. stav Excit. stav Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR39 Excitační a flourescenční emisní spektrum reálného roztoku Při měření reálných vzorků se zrcadlová symetrie narušuje vlivem ionizace fluoroforu při různém pH, komplexace fluoroforu s dalšími molekulami v roztoku, nebo jednoduchým příspěvkem dalších nefluorescenčních molekul k absorpčnímu ~ excitačnímu spektru. Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR40 Odpovědi • Jak poznáme ze struktury, že molekula může být fluorescenční? planární, aromatická • Jak souvisí víno se zásadním objevem v oblasti fluorescence? víno je emisní filtr • Proč jsou excitační a emisní spektra symetrická? Jaké je rozdělení energetických hladin po excitaci. stejné Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR41 Příště – jak se měří fluorescence? • Co je potřeba, abychom mohli změřit spektrum fluoroforu? • Jak můžeme detekovat fluorescenční molekuly v gelu?