Ctirad Hofr LifeB – Laboratoř interakce a funkce esenciálních Biomolekul Fluorescenční metody ve vědách o životě – cesta od molekuly k buňce C7230 FGP – Funkční genomika a proteomika NCBR – Národní centrum výzkumu biomolekul Přírodovědecká fakulta | Masarykova univerzita Ustálená – Steady State fluorescence Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR1 Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR2 Podvodní DISCO Videoukázku doporučila Marie Landováhttps://youtu.be/78de8IoRY0M Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR3 Ustálená fluorescence 1. Definice 2. Citlivost fluorescence na okolí 3. Vlivy na fluorescenční emisní spektrum 4. Zhášení fluorescence Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR4 Ustálená a časově rozlišená fluorescence Ustálená fluorescence – Steady State se měří při buzení kontinuálním zářením a dostáváme potom časově průměrovanou střední hodnotu intenzity nebo polarizace fluorescence. Časově rozlišená fluorescence – Time-resolved se měří pomocí pulzní excitace,délka pulzu je obvykle kratší než doba dohasínání fluorescence vzorku, nebo fázově modulovaného budícího záření a umožňuje analyzovat časové závislosti měřených parametrů, především anizotropie fluorescence. Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR5 Vliv prostředí na absorpční a emisní spektra V roztocích dochází vlivem elektrostatických interakcí dipól-dipól, nebo dipól-indukovaný dipól mezi molekulami fluoroforu a rozpouštědla k solvataci fluoreskujících molekul. Protože molekuly mají v základním a v excitovaném stavu obecně různé dipólové momenty i polarizovatelnosti, dochází při měření fluorescence v roztocích ke změnám v optických spektrech vlivem různé solvatace molekul. Doba potřebná pro molekulární relaxace (10-10s) je mnohem delší, než je rychlost elektronového přechodu – absorpce (10-15s) , ale obvykle kratší, než doba života excitovaného stavu (10-8s) . K emisi proto dochází ze stavu, kdy již bylo dosaženo rovnovážné konfigurace. Protože část absorbované energie se spotřebuje na relaxaci molekul rozpouštědla kolem molekuly fluoroforu v excitovaném i základním stavu, je energie emitovaného fluorescenčního záření menší, než by odpovídalo čistě elektronovému přechodu. Z. Fišar: http://www1.lf1.cuni.cz/~zfisar/fluorescence/Default.htm Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR6 Elektrický dipól Je tvořen dvojicí nábojů o opačné polaritě ve vzdálenosti l. Dipólový moment m = q . l vektor směřující od záporného náboje ke kladnému náboji. Jednotkou je Debye; 1D = 3.3 x 10-30 C.m q+ q- m l Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR7 Molekulové dipóly Molekula je dipólem, když se rozložení kladného a záporného náboje nepřekrývá. V případě, kdy není molekula středově symetrická je rozložení náboje nepravidelné a molekula je dipólem. Molekula, která má dipólový moment je polarizovaná. Molekuly (zpravidla zrcadlově symetrické – CO2), které nejsou dipóly se jimi mohou stát, když se molekula nachází v elektrickém poli – vzniká indukovaný dipól. Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR8 Dipólový moment molekul Molekula je dipólem, jestliže je rozdělení náboje nepravidelné a molekula není středově symetrická. Dipolový moment středově symestrických molekul je nulový. Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR9 Interakce dipólů Polarizované molekuly upřednostňují uspořádání s minimální energií dipólů (head to tail) Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR10 Polarizovatelnost molekul Schopnost molekul vytvořit indukovaný dipól vlivem elektrického pole. Velikost indukovaného dipólu je přímo úměrná intenzitě elektrického pole E Indukovaný dipól m* m* = a E a je polarizovatelnost molekul Čím větší je polarizovatelnost molekuly, tím větší má vliv elektrické pole na molekulu. Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR11 Změna dipólu při interakci molekul http://www.theochem.ruhr-uni-bochum.de/~legacy.akohlmey/cpmd-vmd/part3.html Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR12 Interakční energie dvou dipólů Interakce mezi dvěma dipóly m1 a m2 3 0 2 21 4 )cos31( r V  mm − −= q2 q1 rl1  l2 -q2 -q1 Pro dipól-dipólovou interakci je potenciální energie V závislá na vzájemné orientaci. ve stupních 0 45 90 135 180 1-(cosx)^2 -2 -1 0 1 Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR13 Závislost potenciální energie na poloze dipólů Minimální energie je při  = 0° přitažlivé interakce (opačné náboje jsou u sebe)  < 54.7 ° Maximální energie je při  = 90° odpudivé interakce (stejné náboje jsou u sebe)  > 54.7 ° Nulová potenciální energie je při „magickém“ úhlu  = 54.7° + - + + - + - + - + - Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR14 Interakce dipól-indukovaný dipól Polární molekula s dipólovým momentem m1 může indukovat dipólový moment v polarizovatelné molekule Indukovaný dipól interaguje s permanentním dipólem první molekuly a dochází k vzájemnému přitahování Indukovaný dipól (modré šipky) následuje změny v orientaci permanentního dipólu (žluté šipky) 6 0 2 2 1 r V  am −= Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR15 Co se stane s fluoroforem v roztoku? http://mentalfloss.com/article/62220/what-do-they-use-dye-chicago-river-green-st-patricks-day Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR16 Solvatace fluoroforu po absorpci a před emisí fluorescence V roztocích dochází vlivem elektrostatických interakcí dipól-dipól, nebo dipól-indukovaný dipól mezi molekulami fluoroforu a rozpouštědla k solvataci fluoreskujících molekul. Protože molekuly mají v základním a v excitovaném stavu obecně různé dipólové momenty i polarizovatelnosti, dochází při měření fluorescence v roztocích ke změnám v optických spektrech vlivem různé solvatace molekul. Doba potřebná pro molekulární relaxace (10-10s) je mnohem delší, než je rychlost elektronového přechodu - absorpce (10-15s) , ale obvykle kratší, než doba excitovaného stavu (10-8s) . K emisi proto dochází ze stavu, kdy již bylo dosaženo rovnovážné konfigurace. Protože část absorbované energie se spotřebuje na relaxaci molekul rozpouštědla kolem molekuly fluoroforu v excitovaném i základním stavu, je energie emitovaného fluorescenčního záření menší, než by odpovídalo čistě elektronovému přechodu. Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR17 Faktory ovlivňující emisní spektrum a kvantový výtěžek • Polarita prostředí (rozpouštědla) • Viskozita prostředí – rozpouštědla • Rychlost relaxace molekul rozpouštědla • Konformační změny fluorescenční sondy • Neměnnost lokálního prostředí molekuly • Vnitřní přenos náboje (uvnitř molekuly) • Protonový přenos a reakce excitovaných stavů • Interakce sonda – sonda • Změny v rychlostech zářivých a nezářivých procesů Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR18 Vliv polarity rozpouštědla • Dipólový moment molekuly v excitovaném stavu mE je větší než v základním stavu mG. • Po excitaci se molekuly rozpouštědla orientují (relaxují) okolo mE, což snižuje energii excitovaného stavu. • Čím větší je polarita rozpouštědla, tím větší je vliv orientace dipólů a tím větší energie se spotřebuje na jejich orientaci a zbude pak menší energie na emitované světlo, tj. tím vetší je jeho vlnová délka. Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR19 Interakce excitovaného fluoroforu a rozpouštědla Čím větší je polarita rozpouštědla, tím větší je vliv orientace dipólů, tím menší je energie emitovaného záření a tím větší je posun l emitovaného světla. Nejcitlivější na polaritu rozpouštědla jsou fluorofory, které jsou samy polární. Nepolární fluorofory jsou méně citlivé. Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR20 Dipólový moment a tvar molekul Změna dipólového momentu je větší u delších fluoroforů. Aminonaftalenové deriváty s fenylovou skupinou vykazují větší citlivost na rozpouštědlo a větší dipólové momenty v excitovaném stavu pravděpodobně díky větší separaci náboje podél delšího aromatického systému. Změna dipólového momentu po excitaci je větší u delších molekul. Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR21 Rozdílný vliv polarity rozpouštědla na absorpční a emisní spektrum Se zvyšující se polaritou rozpouštědla se mění fluorescenční spektrum mnohem více než absorpční spektrum. ABS Zvyšování molární koncentrace metanolu v hexanu v rozsahu 0-340 mM (0 -> 6) Absorpční spektrum 2-acetylantracenu v čistém hexanu (0), 200mM roztoku metanolu v hexanu (1) a čistém metanolu (2). 2-acetylantracen Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR22 Sondy na sledování polarity okolí Přidání polárních skupin k fluoroforu zvyšuje jeho citlivost na polaritu rozpouštědla. Přidání polárnějších skupin také zvyšuje Stokesův posun. Větší vzdálenost polárních skupin způsobuje posun emisního spektra k vyšším vlnovým délkám. Deriváty DOP (2,5-difenyloxazolu) a jejich emisní spektra Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR23 Proč je emisní spektrum citlivější na polaritu prostředí než absorpční spektrum? Protože absorpce je rychlejší než emise a ta je zase pomalejší než relaxace molekul časová posloupnost: Absorpce (10-15s) -> relaxace okolí (10-10s) -> emise (10-8s) Absorpce nemůže zachytit změny v lokálním prostředí molekuly, protože proběhne rychleji než k nim dojde před absorpci a po ní je okolí molekuly stejné. naproti tomu při emisi už je molekula fluoroforu obklopena relaxovaným – změněným prostředím. 24 Závislost emisního spektra na polaritě rozpouštědla Podle zvyšující se polarity: H – hexan CH- cyklohexan T- toluen EA – etylacetát Bu – n-butanol polarita Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR25 Prodan v různém prostředí - rozpouštědle Prodan (N,N-Dimethyl-6-propionyl-2-naphthylamine) C - Cyklohexan D - dimetylformamid DMSO –dimetylsufloxid E - Etanol CH3CH2OH G – Glycerol OH OH OH OH N CH3 CH3 O H polarita Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR26 Změna emisního spektra po vazbě molekul Citlivosti fluorescenčních sond na okolní prostředí se využívá při sledování vazby a kvantifikaci množství biologických molekul. Kvantový výtěžek se často zvyšuje při vazbě fluoroforů na proteiny nebo DNA. Toho se využívá při sledování vazby. • ANS na HSA • Prodan na protein • DAPI na DNA • EtBr na DNA Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR27 Fluorescence ANS po vazbě na sérový albumin Změna polarity prostředí způsobuje posun fluorescenčního spektra do viditelné oblasti spektra z původní fluorescence v UV oblasti. ANS (1-anilinonaftalén-8-sulfonát sodný): • MW = 321,33 • rozpouštědlo pro zásobní roztok: dimetylformamid (DMF) • rozpouštědlo pro spektroskopická měření: metanol (MeOH) • dlouhovlnné absorpční maximum v metanolu: lexmax = 372 nm (molární extinkční koeficient: 7800 cm-1M-1) • fluorescenční emisní maximum v metanolu: lemmax = 480 nm • kvantový výtěžek fluorescence je závislý na okolním prostředí a je zvláště citlivý na přítomnost vody; emise je závislá na rozpouštědle • podrobný popis vlastností ANS lze nalézt v práci [Slavík J.: Anilinonaphthalene sulfonate as a probe of membrane composition and function. Biochim. Biophys. Acta 694, 1-25 (1982)] Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR28 Co se stane, když se naváže PRODAN na BSA? Posune se maximum vlnové délky z 520 nm zelené světlo na 460 nm modré světlo a přesto, že se zvýší intenzita emise, nepozorujeme ji, protože lidské oko má nižší citlivost na modré světlo než zelené světlo. Postupnou vazbu PRODANu na BSA lze lépe sledovat jako úbytek emise volného fluoroforu. 460 nm 520 nm Samotný PRODAN PRODAN + BSA Citlivost oka Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR29 Vazba DAPI na DNA DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindole ) Ex. 355 nm / Em. 461 nm Vazba do malého žlábku. Největší nárust intenzity při vazbě v blízkosti AT bohatých oblastí. Použití při značení DNA u preparátů pro fluorescenční mikroskopii – citlivost řádově ng DNA. Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR30 Další mechanismy spektrálního posunu • Vodíkové můstky v rozpouštědle • Vnitřní přenos náboje (uvnitř molekuly) • Rychlost relaxace molekul rozpouštědla • Interakce sonda – sonda • Konformační změny fluorescenční sondy • Změny v rychlostech zářivých a nezářivých procesů * Čárkované šipky znamenají, že přechody mohou být zářivé nebo nezářivé Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR31 Závislost emise fluorescence na teplotě • Snížení teploty zpravidla způsobuje zvyšování viskozity rozpouštědla a tím se zvyšuje také čas potřebný k orientaci molekul rozpouštědla • Čím nižší je teplota, tím méně molekul se vrací do základního stavu s relaxovanými okolními molekulami rozpouštědla – tím méně se energie spotřebovává a tím je posun menší Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR32 Závislost emisního spektra na teplotě Snížení teploty prodlužuje čas potřebný k relaxaci rozpouštědla. Snížení teploty má podobný vliv jako snížení polarity rozpouštědla. Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR33 Interakce sonda-sonda excimerová fluorescence Molekuly fluoroforu mohou se sebou vzájemně vytvářet excitovaný komplex excimer. Excimer je zkráceně excitovaný dimer. V případě dvou různých molekul se jedná o exiplex. Pro vytvoření excimeru je nutné, aby byly molekuly v kontaktu. Emisní pás excimerové fluorescence je posunut k delším vlnovým délkám ve srovnání s fluorescencí izolovaných molekul. Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR34 Použití excimerů při detekci inserčních mutací Oligonukleotid s připojenými pyrenovými zbytky na místě jedné báze Když se váže na WT nemutovanou DNA, jeden pyrenový zbytek se interkaluje, druhý je vně dvoušroubovice Když se váže na DNA s mutací, která obsahuje jednu bázi navíc, dojde k vytvoření excimeru. Excimerová emise ukazuje, že se jedná o inserčního mutanta. Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR36 Dynamické zhášení Snížení intenzity fluorescence dynamickým zhášením je popsáno Sternovou-Volmerovou rovnicí: F0/F = t0/t = 1 + kq t0 Cq kde je F0 – intenzita fluorescence nebo kvantový výtěžek fluorescence za nepřítomnosti zhášedla, F - totéž za přítomnosti zhášedla o koncentraci Cq, t0 – doba dohasínání fluorescence bez zhášedla, t - doba dohasínání za přítomnosti zhášedla, kq – bimolekulární zhášecí konstanta (= bimolekulární rychlostní konstanta určená difúzí vynásobená účinností zhášení). Hodnota kq udává koncentraci zhášedla, při které se sníží intenzita fluorescence na polovinu. Nejčastějším zhášedlem fluorescence i fosforescence je molekulární kyslík (O2). Dále fluorescenci zhášejí (v důsledku mezisystémové konverze) atomy halogenů jako je bróm a jód. Často používaným zhášedlem je také akrylamid. Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR37 Statické zhášení Vytváří se komplex fluoroforu a zhášedla, který už nefluoreskuje Platí pro něj také Sternova-Volmerova rovnice: F0/F = 1 + Ka t0 Cq Kde Ka je asociační konstanta fluoroforu a zhášedla Typickými statickými zhášedly jsou: Báze nukleových kyselin Guanin Nikotinamid Těžké kovy Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR38 Rozdílná teplotní závislost dynamického a statického zhášení Oba druhy zhášení ukazují stejnou závislost na koncentraci zhášedla. Při statickém zhášení se pouze „zneviditelní“ část fluoroforů, které vytvoří komplexy. Nemění se doba dohasínání fluorescence t. Při dynamickém zhášení se doba dohasínání mění t0>t. Statické zhášeníDynamické zhášení Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR39 Závislost obou druhů zhášení na teplotě Dynamické zhášení se s rostoucí teplotou zvyšuje. Zvyšuje se pohyblivost molekul zhášedla, které takto za stejný čas „uhasí“ více molekul fluoroforu. Statické zhášení se s rostoucí teplotou snižuje, protože dochází snadněji k disociaci slabě vázaných komplexů flouroforu a zhášedla. Dynamické zhášení Statické zhášení Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR40 Využití zhášení při lokalizaci fluoroforu V membráně Jestliže je fluorofor P1 zanořen v membráně, je pro zhášedlo Q nedostupný a ke zhášení téměř nedochází. S rostoucí koncentrací zhášedla se intenzita fluorescence téměř nemění. Na povrchu Jesltiže je fluorofor P2 na povrchu, dochází k účinnému zhášení. S rostoucí koncentrací zhášedla intenzita fluorescence velmi výrazně klesá. Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR41 Literatura Lakowicz J.R.: Principles of Fluorescence Spectroscopy. Third Edition, Springer + Business Media, New York, 2006. Fišar Z.: FLUORESCENČNÍ SPEKTROSKOPIE V NEUROVĚDÁCH http://www1.lf1.cuni.cz/~zfisar/fluorescence/Default.htm Poděkování Grafika z knihy Principles o Fluorescence byla pro účely této přednášky laskavě poskytnuta profesorem J.R.Lakowitzem. Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR42 Příště – časově rozlišená fluorescence Co navíc nám řekne časově rozlišená fluorescence než ustálená fluorescence? Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR43 Spectraviewer – tips & tricks Fluorescence SpectraViewer