Ctirad Hofr
LifeB – Laboratoř interakce a funkce esenciálních Biomolekul
Fluorescenční metody ve vědách o životě – cesta od molekuly k buňce
C7230
FGP – Funkční genomika a proteomika
NCBR – Národní centrum výzkumu biomolekul
Přírodovědecká fakulta | Masarykova univerzita
Časově rozlišená fluorescence
Time-Resolved Fluorescence
Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR2
Potrait of Lotte 18 years in 5 minutes
Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR3
Potrait of Vince 20 years in 20 seconds
Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR4
Přehled
• Definice časově rozlišené (ČR) fluorescence
• Typy měření ČR fluorescence
• Praktické aplikace ČR fluorescence
Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR5
Ustálená a časově rozlišená fluorescence
• Časově rozlišená fluorescence se měří pomocí pulzní excitace
(délka pulzu je obvykle kratší než doba dohasínání fluorescence
vzorku) nebo fázově modulovaného budícího záření a umožňuje
analyzovat časové závislosti měřených parametrů.
• Ustálená fluorescence (Steady State) se měří při buzení
kontinuálním zářením a dostáváme potom časovou střední
hodnotu intenzity či polarizace fluorescence.
Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR6
Proč měřit časově rozlišenou fluorescenci?
• Udává nám informaci o poklesu intenzity fluorescence v čase
• Měření je relativní, nezáleží na skutečné hodnotě intenzity
• Je závislá na vlastnostech okolí
• Dává informace o dynamice – rotaci molekul
Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR7
Jak dlouho trvá fluorescence?
Náhodné dohasínání zpět do základního stavu:
každá molekula emituje 1 foton
Populace molekul excitovaných
zábleskem (pulsem)
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
0 500 1000
Čas (ps)
I(t)
t=1/e=37%
Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR8
Časový průběh fluorescence
• Nejjednodušší je exponenciální pokles pro sférické částice
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
-2 0 2 4 6 8 10 12
Čas (ns)
0I
I
𝐼(𝑡) = 𝐼0 𝑒 ൗ−𝑡
𝜏
Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR9
Čas dohasínání fluorescence t
• t je střední doba mezi excitací molekuly (absorpcí fotonu) a
emisí světla při návratu molekuly do základního stavu
Jaká je intenzita fluorescence v čase t po absorpci fotonu?
• Doba dohasínání t = 2 ns, potom
v tomto čase t = t má fluorescence
37% z původní intenzity v čase 0 0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
-2 0 2 4 6 8 10 12
37%
Doba dohasínání 2 ns
37% z intenzity v čase 0
Čas (ns)
0
0.0001
0.001
0.01
0.1
1
log I(t)
0
)(
I
I t
𝐼(𝑡) = 𝐼0 𝑒 ൗ−𝑡
𝜏
Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR10
Proč měřit dobu dohasínání
fluorescence t ?
• Absolutní měření – doba dohasínání nezávisí na koncentraci
vzorku
• Doba dohasínání je závislá na okolním prostředí a může být
použita k určení jeho polarity, pH, teploty, koncentrace iontů,
přítomnosti zhášedla
• Přidává další rozměr při fluorescenčním mapování – zvyšuje jeho
selektivitu
• Umožňuje měřit rotační korelační čas molekul – rotační
pohyblivost
Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR11
Hlavní způsoby měření časové závislosti
fluorescence
• Pulzní metoda (time-domain) zdrojem excitačního záření je
krátký pulz
• Metoda fázově modulovaného budícího záření (frequency
domain) zdrojem excitačního záření je sinusově modulované
světlo
Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR
Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR13
Pulzní metoda
• Vzorek je excitován krátkým pulzem
s trváním mnohem kratším než doba dohasínání t
• Závislost intenzity fluorescence na čase (dohasínání) je použita
pro výpočet doby dohasínání t
Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR14
Počítání fotonů: Time-Correlated Single Photon
Counting TCSPC
• Při každém pulzu excitačního světla může
být zaznamenán jeden emitovaný foton.
• Typické uspořádání je, že jeden foton
připadá na 100 excitačních pulzů.
• Měří se čas mezi excitačním pulzem a
zaznamenaným fotonem.
• Vytváří se histogram, který znázorňuje
časovou distribuci fotonů.
• Pro vyhodnocení křivky dohasínání je
potřeba mít soubor alespoň 4000 fotonů.
Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR15
Zdroje pro TCSPC
Laserové diody
Šířka pulzu FWHM = 70 ps
(full width at half of maximum; plná šířka v polovině maxima)
Rychlost opakování pulzu 40 MHz
LED (Light Emitting Diode)
FWHM = 1,4 ns (plná šířka v polovině maxima)
Rychlost opakování pulzu 40 MHz
Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR16
Detektor - fotonásobič
Boční okno 24 mm2
Fotokatoda
Fokusační elektroda
Násobiče elektronů (dynody)
Foton
Fotoelektron
Anoda
Vakuum 10-4 Pa
Poskytnuto HORIBA Jobin Yvon
Light Detectors: Photomultiplier Tube (R928 Side-on)
Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR17
Rychlý detektor (MCP PMT)
• Rychlost je nejdůležitější při sledování časové
závislosti fluorescence.
• V současnosti jsou nejrychlejší mikrokanálové
deskové fotonásobiče - MicroChannel Plate
PhotoMultiplier Tube.
• Mají rychlou odezvu, elektron putuje
v detektoru méně než 1 ns.
Ve srovnání s klasickým fotonásobičem je
odezva 10 krát rychlejší.
Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR18
Princip přístroje s TCSPC
0
2000
4000
6000
8000
10000
12000
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
TIME, CHANNELS
PHOTONCOUNTS
MCA
S
CFDSYNC
0
2000
4000
6000
8000
10000
12000
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
TIME, CHANNELS
PHOTONCOUNTS
IBH 5000U
TAC rate 1MHz
Coaxial Delay 50 Ns
Sync delay 20 ns
TBX-04
nanoLED
 ≤ 2%
statistical
single photon
events
periodic pulses
Kumulativní
histogram
TAC
Time to amplitude
converter
V
detektor
zdroj
vzorek
Constant fraction
discriminator
Poskytnuto HORIBA Jobin Yvon
Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR19
Praktické určení t
𝐼(𝑡) = 𝐼0 𝑒 ൗ−𝑡
𝜏
𝐼(𝜏) = 𝐼0 𝑒−1 = 𝐼0 ⋅ 0.37
Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR20
Princip skládání – konvoluce signálů
1
10
100
1000
10000
100000
-10 -5 0 5 10
ČAS, KANÁLY
početfotonů
1
10
100
1000
10000
100000
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
TIME, CHANNELS
PHOTONCOUNTS
-10 -5 0 5 10
TIME, CHANNELS
PHOTONCOUNTS
1
10
100
1000
10000
100000
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
TIME, CHANNELS
PHOTONCOUNTS
1
10
100
1000
10000
100000
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
TIME, CHANNELS
PHOTONCOUNTS
d-4
d-3
d-2
d-1
d 0
Dohasínání po pulzu d
Intenzita je funkcí času: I(t)= exp (-t/t)
Intenzita zdroje světla je také funkcí času L(t)
Konvoluce fluorescence: F(t)= I(t) L(t)
Složený signál
dohasínání
Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR21
Časově rozlišená fluorescence fluoresceinu
• Fluorescein v roztoku pH 9.0
• Excitace 450 nm
• Pulzní LED s opakovací frekvencí 20 MHz
IRF Instrument Response Function signál
zdroje a odezva přístroje
IRF je křivka odpovídající nejkratšímu
možnému času dohasínání, který lze na
daném přístroji měřit
IRF
Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR22
Záznam skutečného měření
Modrá křivka je IRF, červená naměřená data a zelená fit jednokomponentním modelem.
Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR23
Více fluoroforů v systému: multiexponenciální
dohasínání
• i poměrné zastoupení fluoroforu
• ti doba dohasínání daného fluoroforu
• Celková intenzita je dána součtem
(konvolucí) příspěvků od každého fluoroforu
• Při analýze je nutno použít dekonvoluce –
rozklad signálu na příspěvky jednotlivých
fluoroforů
𝐼(𝑡) = 𝛼1 𝑒 ൗ−𝑡
𝜏1 + 𝛼2 𝑒 ൗ−𝑡
𝜏2. . . +𝛼 𝑁 𝑒 ൗ−𝑡
𝜏𝑁
𝐼(𝑡) = 𝛼𝑖 exp ( − 𝑡/𝜏𝑖)
Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR24
Rozlišení skládání signálů dvou fluoroforů
(dekonvoluce)
• Při určování příspěvků od jednotlivých
fluoroforů někdy není možno přesně určit
 a t, protože ke stejnému proložení
můžeme použít jejich různé kombinace
• Různé dvojice i a ti mohou dát velmi
podobný tvar křivky dohasínání
Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR25
Rozlišení skládání signálů dvou fluoroforů
(dekonvoluce)
Fluoroforem je tryptofan.
V proteinu je tryptofan jenom jeden, přesto je časová závislost
dohasínání vícexponenciální.
Je to dáno různými konformacemi proteinu v roztoku.
Tryptofan se nachází ve více různých lokálních prostředích.
Poskytnuto HORIBA Jobin Yvon
Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR26
Co dělat, když jsou tam fluorofory dva
každý v jiném prostředí?
Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR27
Dynamické zhášení
Snížení intenzity fluorescence dynamickým zhášením je popsáno Sternovou-Volmerovou
rovnicí:
F0/F = t0/t = 1 + kq t0 Cq
kde je F0 – intenzita fluorescence nebo kvantový výtěžek fluorescence za nepřítomnosti
zhášedla,
F - totéž za přítomnosti zhášedla o koncentraci Cq, t0 – doba dohasínání fluorescence bez
zhášedla, t - doba dohasínání za přítomnosti zhášedla, kq – bimolekulární zhášecí konstanta
(= bimolekulární rychlostní konstanta určená difúzí vynásobená účinností zhášení).
Hodnota kq udává koncentraci zhášedla, při které se sníží intenzita fluorescence na polovinu.
Nejčastějším zhášedlem fluorescence i fosforescence je molekulární kyslík (O2). Dále
fluorescenci zhášejí (v důsledku mezisystémové konverze) atomy halogenů jako je bróm a
jód. Často používaným zhášedlem je také akrylamid.
Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR28
Statické zhášení
Vytváří se komplex fluoroforu a zhášedla, který už nefluoreskuje
Platí pro něj také Sternova-Volmerova rovnice:
F0/F = 1 + Ka t0 Cq
Kde Ka je asociační konstanta fluoroforu a zhášedla
Typickými statickými zhášedly jsou:
Báze nukleových kyselin
Guanin
Nikotinamid
Těžké kovy
Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR29
Rozdílná teplotní závislost dynamického a
statického zhášení
• Oba druhy zhášení ukazují stejnou závislost na
koncentraci zhášedla.
• Při statickém zhášení se pouze „zneviditelní“
část fluoroforů, které vytvoří komplexy.
• Nemění se doba dohasínání fluorescence t.
• Při dynamickém zhášení se doba dohasínání
mění t0>t.
Statické zhášeníDynamické zhášení
Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR30
Závislost obou druhů zhášení na teplotě
Dynamické zhášení se s rostoucí teplotou zvyšuje.
Zvyšuje se pohyblivost molekul zhášedla, které takto
za stejný čas „uhasí“ více molekul fluoroforu.
Statické zhášení se s rostoucí teplotou snižuje,
protože dochází snadněji k disociaci slabě vázaných
komplexů flouroforu a zhášedla.
Dynamické zhášení Statické zhášení
Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR31
Využití zhášení při lokalizaci fluoroforu
V membráně
Jestliže je fluorofor P1 zanořen
v membráně, je pro zhášedlo Q nedostupný
a ke zhášení téměř nedochází.
S rostoucí koncentrací zhášedla se intenzita
fluorescence téměř nemění.
Na povrchu
Jestliže je fluorofor P2 na povrchu,
dochází k účinnému zhášení.
S rostoucí koncentrací zhášedla
intenzita fluorescence velmi výrazně klesá.
Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR33
Metoda fázově modulovaného budícího záření
1. Vzorek je excitován sinusově modulovaným světlem
s vysokým frekvenčním rozsahem srovnatelným
s převrácenou hodnotou doby dohasínání
2. Když dojde k excitaci vzorku modulovaným zářením,
emitované záření fluorescence odpovídá modulační frekvenci
budícího absorbovaného záření
3. Emise je časově zpožděna ve srovnání s budícím zářením,
což se projeví fázovým posunem. Fázový posun je použit
k výpočtu doby dohasínání fluorescence t
Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR34
Stupně / Čas
0 2p (360°)/T
Intenzita
-2
-1
0
1
2
fázový posunF
b
a
B
A
4p (720°)/2T 6p (1080°)/3T
Modulace excitace b/a (výška peaku/střední intenzita)
Modulace emise B/A
Relativní modulace m 𝑚 =
𝐵/𝐴
𝑏/𝑎
Určení času dohasínání z fázového posunu F
tan Φ = 𝜔𝜏Φ 𝑚 =
1
1 + 𝜔2 𝜏 𝑚
2
Určení času dohasínání z modulace m
excitační záření
emise fluorescence
Určení doby dohasínání metodou fázové
modulace
Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR35
( )
( )
M =
-1.5
-1
-0.5
0
0.5
1
1.5
TIME
AMPLITUDE
-1.5
-1
-0.5
0
0.5
1
1.5
TIME
AMPLITUDE
-1.5
-1
-0.5
0
0.5
1
1.5
TIME
AMPLITUDE
-1.5
-1
-0.5
0
0.5
1
1.5
TIME
AMPLITUDE
-1.5
-1
-0.5
0
0.5
1
1.5
TIME
AMPLITUDE
f
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
1 10 100 1000
Frequency, MHz
f
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
1
M
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
1 10 100 1000
Frequency, MHz
f
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
1
M
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
1 10 100 1000
Frequency, MHz
f
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
1
101001000
Frequency,MHz
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
1
M
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
1 10 100 1000
Frequency, MHz
f
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
1
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
1 10 100 1000
Frequency, MHz
f
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
1
𝑚 =
𝐵/𝐴
𝑏/𝑎
%
-1.5
-1
-0.5
0
0.5
1
1.5
TIME
AMPLITUDE
Princip měření pomocí fázové modulace
Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR36
Praktický příklad výpočtu
F = 68°
tan Φ = 𝜔𝜏Φ
𝑚 =
1
1 + 𝜔2 𝜏 𝑚
2
;
m = 0.4
𝜏Φ =
tan Φ
𝜔
𝜏 𝑚 =
1
𝜔2
1
𝑚2
− 1
𝜔 = 2𝜋 ⋅ 𝑓
Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR37
Závislost parametrů získaných metodou
fázové modulace na t
• Čím je kratší doba dohasínání t,
tím více se posunuje průnik křivek k vyšším
frekvencím.
• Pro delší dobu dohasínání t = 10 ms je
nutno použít modulační frekvence 10 kHz
až 1 MHz.
• Pro kratší dobu dohasínání t = 100 ps je
nutno použít modulační frekvence až 2GHz
tedy 10 000 krát větší.
Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR38
Časově rozlišená fluorescence fluoroforů v
rozdílném prostředí
• Protein se dvěma fluorofory – tryptofany
• Flourofory mají ve stejném prostředí
stejnou hodnotu t
• Po přidání zhášedla se sníží doba
fluorescence fluoroforu na povrchu t2
• Výsledkem je „prohnutá“ křivka
• Úkolem dekonvoluce je pak určit t1, t2
a poměrné příspěvky fluoroforů 1,2
𝐼(𝑡) = 𝛼1 𝑒 ൗ−𝑡
𝜏1 + 𝛼2 𝑒 ൗ−𝑡
𝜏2
Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR39
Změna rotačního korelačního času při
multimerizaci proteinu
• Časové závislosti polarizované
fluorescence lze použít při
sledování změny dynamiky
systému molekul
• Sledování multimerizace
fosfofruktokinázy
0 10 20 30 40
Čas (ns)
log r (t)
q = 5 ns
q = 20 ns
M
T
Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR40
Fluorescence LifeTime Imaging Microcsopy – FLIM
• Sledování časové závislosti fluorescence v 2D prostoru.
• Umožňuje rozlišit prostředí, ve kterém se fluorofory nacházejí.
• Umožňuje sledovat zhášení flouroforů, ať už vlivem prostředí,
zhášedla nebo interakce s jinými molekulami.
Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR41
Příklad detailního zobrazení FLIM
Závislost doby dohasínání fluorescence NADH je dvou-exponenciální
s hodnotou 0.4 ns pro volnou a 3 ns pro navázanou molekulu NADH.
Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR42
FLIM zlepšuje rozlišení obrazu
• Buňky (artery endothelial cells) obarveny třemi
různými fluorofory
• Nukleové kyseliny byly obarveny DAPI
• F-aktin byl obarven Bodipy FL-phallacidin
• Mitochondrie byly obarveny Mito-Tracker Red CMX Ros
• Obraz intenzity fluorescence neumožňuje rozlišit tři použité fluorofory
• Obraz časově rozlišené fluorescence umožňuje určit rozmístění
všech tří fluoroforů na základě času dohasínání fluorescence.
Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR43
Použití FLIM při sledování interakce proteinů
Rychlejší dohasínání v
přítomnosti zhášejícího proteinu
Normální - pomalé dohasínání
FRET-FLIM mikroskopie byla využívána při charakterizaci vytváření
dimeru transkripčního faktoru C/EBPα uvnitř jádra živých buněk
GHFT1-5
H. Wallrabe and A. Periasamy, Imaging protein molecules using FRET and FLIM microscopy, Current Opinion in Biotechnology,
Volume 16, Issue 1, Analytical biotechnology, 2005, Pages 19-27.
Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR44
Interakce nebo kolokalizace?
Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR45
Využití časově rozlišené fluorescence při
proteomické analýze
Gel barvený
Sypro-Ruby
Intenzita je doplněna o pseudobarevné časové rozlišení, aby mohly být oba parametry zviditelněny současně.
Časové rozlišení fluorescence může pomoci při analýze proteinů v překrývajících se pásech.
Intenzita Časové rozlišení
Upraveno podle materiálů Materialů Photonic
Research Systems Ltd. www.prsbio.com
Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR46
Literatura
• Lakowicz J.R.: Principles of Fluorescence Spectroscopy.
Third Edition, Springer + Business Media, New York, 2006.
• Fišar Z.: FLUORESCENČNÍ SPEKTROSKOPIE V NEUROVĚDÁCH
http://www1.lf1.cuni.cz/~zfisar/fluorescence/Default.htm
• Poděkování:
Grafika z knihy Principles o Fluorescence byla pro účely této
přednášky laskavě poskytnuta profesorem J.R. Lakowitzem.
Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR48
Spectraviewer – tips & tricks
• Fluorescence SpectraViewer
Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR49
2. domácí úkol
• Spectraviewer
http://www.thermofisher.com/cz/en/home/life-science/cell-
analysis/labeling-chemistry/fluorescence-spectraviewer.html