Ctirad Hofr
LifeB – Laboratoř interakce a funkce esenciálních Biomolekul
Fluorescenční metody ve vědách o životě – cesta od molekuly k buňce
C7230
FGP – Funkční genomika a proteomika
NCBR – Národní centrum výzkumu biomolekul
Přírodovědecká fakulta | Masarykova univerzita
Absorpční spektroskopie při biologické analýze
molekul
https://youtu.be/Ursa6E22y6w?si=ZcxQJj4mzFT9d1ox Úvodní ukázku laskavě doporučila Zuzana Páleníčková
Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR3
Přehled
Stanovení koncentrace DNA
Určení koncentrace proteinů
Cirkulární dichroismus při stanovení struktury biomolekul
Jak funguje sledování 3D filmů
Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR4
UV spektroskopie DNA a proteinů
• Všechny atomy absorbují v UV oblasti spektra, protože toto záření
má dostatečnou energii k excitaci vnějších elektronů
• UV spektroskopie je používána k určení koncentrace DNA a
proteinů a k určení poměru DNA/proteinů v roztoku
• Ke stanovení koncentrace biologických molekul se využívá
Lambert-Beerův zákon
5
Lambert-Beerův zákon
• Látka pohlcuje světlo
• Pro absorpci monochromatického světla
• Lambert-Beerův zákon:
Absorbance je přímo úměrná koncentraci a tloušťce vrstvy roztoku
lc
II −
= 
100 I
I
lcA 0
10log== 
=molární extinční koeficient látky, c-koncentrace, l-délka optické dráhy
Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR
6
Absorpční spektrum DNA
• Spektrum DNA je tvořeno příspěvky
jednotlivých bazí
• Nejvíce absorbují heterocyklické puriny
A,G; méně C,T
• Absorbance DNA se měří v maximu
tj. při 260 nm
• Poměr A260/A280 je pro čistou DNA 1.8
• Poměr menší než 1.8 ukazuje
na přítomnost proteinů nebo nečistot l(nm)260
Abs
280
Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR
7
Přibližné určení koncentrace nukleových kyselin
• Jestliže má roztok NK Abs 260=1 v 1 cm kyvetě, pak je koncentrace
• dvouřetězcové dsDNA 50 mg/ml
• jednořetězcové ssDNA 30 mg/ml
• jednořetězcové RNA 40 mg/ml
• Odtud můžeme vypočítat molární koncentraci pomocí průměrné
Mr nukleotidů (320)
• Takto vypočtená koncentrace se vztahuje na 1 nukleotid!
• Pro přepočet koncentrací platí 320 mg/ml ~ 1 mM
• Jedná se molární koncentraci nukleotidů v roztoku!
Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR
8
Určování extinkčního koeficientu oligonukleotidů
• Měřením – Analytické stanovení – Fosforová analýza
• Výpočtem – nejpřesnější na základě sekvence s uvážením vlivu
sousední báze
lcA = 
Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR
9
Fosforová analýza při stanovení koncentrace DNA
• Přesná analytická metoda
• Určuje koncentraci fosfátových skupin
• Před analýzou je nutno štěpit DNA
• Umožňuje určit  také u analogů DNA a při modifikaci DNA např.
fluorescenčními značkami, které ovlivňují výrazně 
• Využívá kolorimetrie – stupeň zbarvení roztoku je přímo úměrný množství
PO4 tj. množství DNA (ang. Ammonium molybdate test)
Murphy, J.H. and Trapane, T.L.,1996, Analytical Biochemistry, 240, 273-282.
Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR
10
Výpočet extinkčního koeficientu DNA
• Extinkční koeficienty jednotlivých bází přispívají
k výslednému  celé DNA podle pravidla nejbližšího souseda
• Interakce sousedních bází ovlivňují míru absorpce
• Výpočet extinkčního koeficientu oligonukleotidu o délce
n nukleotidů
Warshaw, M.M. and Tinoco, I. (1966) Optical properties of sixteen dinucleoside phosphates. J. Mol., Biol., 20: 29-38.
Cantor, C.R. and Warshaw, M.M. (1970) Oligonucleotide interactions. Biopolymers, 9:1059-1103 Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR
11
Příklad výpočtu
• M13 sekvenační primer 5'- gTA AAA CgA Cgg CCA gTg -3'
= (368 000) – (185 400)
= 182 800 M-1cm-1
Samostatné báze Nejbližší soused
Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR
12
Kalkulátory extinkčních koeficientů DNA/RNA
oligonukleotidů
Výpočet 
OligoAnalyzer™ Tool
https://eu.idtdna.com/calc/analyzer
http://www.basic.northwestern.edu/biotools/oligocalc.html
Oligonucleotide Properties Calculator
Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR
Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR13
Jak určit koncentraci z optické hustoty?
Jednotka optické hustoty OD
OD jednotka optické hustoty („optical density“)
1 OD je množství DNA nebo proteinu, které když se rozpustí
v jednom mililitru, má absorbanci 1, jestliže se měří v kyvetě
s optickou dráhou 1 cm.
Měření optické hustoty OD se často používá
v biologii jako jednoduché metody k určení koncentrace, protože v
rozsahu Abs 0...1 platí přibližně lineární vztah mezi koncentrací
biologického materiálu a hodnotou absorbance.
Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR
15
Příklad výpočtu koncentrace DNA
 = 182 800 M-1cm-1
Celkem po syntéze 8,5 OD260
Přidáme 500 µl H2O
Jaká je molární koncentrace DNA?
c = 93 mM
Molární koncentrace celých řetězců!
Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR
16
Hypochromní efekt při tvorbě DNA
• Dvouřetězcová DNA absorbuje DNA méně,
než jednořetězcová a ta méně než samotné nukleotidy
• Využití: Sledování rozplétání komplementárních řetězců
Snižování absorbance :
Abs (nukleotidy) >Abs (ssDNA) >Abs (dsDNA)
Abs
l(nm)
Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR
17
Sledování tání DNA
• Denaturační křivka DNA - závislost absorbance (260nm)
na teplotě
• Teplota tání Tm - teplota, při které je právě polovina molekul
zdenaturována
Abs(260)
Teplota (°C)
Tm
+
Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR
18
Kalkulátor teplotní stability DNA
Výpočet teploty tání a její závislosti na koncentraci oligonukleotidu
a solí
Measurement of protein using bicinchoninic acid
http://www.basic.northwestern.edu/biotools/oligocalc.html
Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR
Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR19
Určete jak se změní Tm při zvýšené koncentraci
Sekvence TTA GGG CCC TAA
vytváří duplex s komplementárním řetězcem
Určete hodnotu Tm vypočtenou metodou
Nearest Neighbor.
Změna koncentrace oligonukleotidu
c = 50 nM, 500 nM, 5000 nM
Změna koncentrace soli
c = 50 mM, 500 mM, 1000 mM
20
21 Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR
Směs proteinů
22
Absorpční spektrum proteinů
• Spektrum proteinů je tvořeno příspěvky jednotlivých aminokyselin
• Nejvíce absorbují tryptofan, tyrosin a cystein
• Absorbance proteinu se měří při 280 nm
Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR
23
Spektroskopické stanovení koncentrace
proteinu
Analytické určení
Bradfordova metoda - změna absorpčního maxima v přítomnosti
proteinu
Výpočet extinkčního koeficientu
na základě sekvence aminokyselin
Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR
24
Bradfordova metoda určování koncentrace proteinu
• Metoda je založena na jevu posunu absorpčního maxima
kyselého roztoku Coomasie Brilliant Blue G-250 z 465 nm
na 595 nm při vazbě na protein. Změna je způsobena iontovými
a hydrofobními interakcemi s proteinem, které stabilizují záporně
nabitou formu barviva, což má za následek změnu barvy roztoku.
• Coomassie Brilliant Blue - váže bazické a aromatické
aminokyselinové zbytky v proteinech
(arginin (ARG), fenylalanin (PHE), tryptofan (TRY) a prolin (PRO))
• Rozsah použití metody je řádově 0.1 – 1.25 mg/ml
(V tomto rozsahu nedochází k výrazné změně extinkčního koeficientu komplexu protein/Coomassie)
Bradford, MM. Analytical Biochemistry 72: 248-254. 1976.
Stoscheck, CM. Quantitation of Protein. Methods in Enzymology 182: 50-69 (1990).
Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR
25
Coomasie
Další názvy:
Coomassie Blue, Brilliant Blue, Brilliant Blue G,
Acid Blue 90, C.I. 42655, Brilliant Blue G 250,
or Kunasty Blue
Původně byla tato látka používána
v textilním průmyslu k barvení vlny
Jméno podle Afrického města
Kumasi v Ghaně
Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR
26
Praktické provedení stanovení koncentrace proteinu
• Připraveny standardy BSA (hovězí sérový
albumin nebo Imunoglobulin G) v rozsahu
0.125…1.5 mg/ml
• Po přidání roztoku Coomasie (např. 980 ml
+ 20 ml roztoku proteinu) a krátké inkubaci
(5 min) se měří Abs při 595 nm
• Na základě kalibrační křivky se stanoví
koncentrace vzorku
• Nejpřesnější stanovení v oblasti
0.2 – 0.7 mg/ml
• Interference s detergenty
Tween 20 od 0.06%
Triton X100 od 0.125 %
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
0 0,5 1 1,5 2
protein (mg/ml)
Abs(595nm)
Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR
27
BCA metoda
• BCA = Bicinchoninic acid
▪Barevná reakce založena
na interakci Cu kationtů
s BCA a peptidovou vazbou
▪Purpurové zbarvení
detekovatelné při 562 nm
▪Lineární rozsah 1-30 ug při inkubaci
37°C, 30 min.
▪Lépe toleruje detergenty: SDS do 1%
▪Redukční činidla ovlivňují výsledky, nutno zajistit jejich stejnou koncentraci
v pufru a standardech
Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR
Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR28
BCA Protein Assay Reagent – bicinchoninic acid
https://youtu.be/xBQXQW_Vfoo?si=-m1PkE-Er_MsEBSu
29
Kvalitativní analýza proteinů
Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR
30
Absorpční densitometrie gelů
• Při analýze molekul v gelu je možno získat současně informace
o kvalitě i kvantitě
• Měří se množství absorbovaného světla v závislosti na 2D poloze
• Stanovení koncentrace DNA a proteinu po barvení gelu Coomasie nebo stříbrem
Zdroj světla
Detektor
Optická hustota
(Abs)
Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR
31
Výpočet extinkčního koeficientu proteinu
Celk = počet(Tyr).Tyr + počet(Trp).Trp + počet(Cystein).Cystein
• Extinkční koeficienty pro proteiny měřené ve vodě při 280 nm:
Tyr = 1490, Trp = 5500, Cystein = 125
Gill, S.C. and von Hippel, P.H. (1989). Anal. Biochem. 182:319-326(1989).
http://www.expasy.org/tools/protparam.html
Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR
Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR
33
Bělení prádla I
Ultramarine -
Wikipedia
Lazurit – Wikipedie (wikipedia.org)
Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR
34
Bělení prádla II
Absorption in the visible region (video) | Khan Academy
https://youtu.be/5HMMfiyszjo?t=202
ultramarine artificial - Cultural Heritage
Science Open Source (chsopensource.org)
Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR
Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR35
Mrknutí v 3D brýlích před zrcadlem
36
Cirkulární polarizace
Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR
37
Cirkulární dichroismus ve strukturní analýze molekul
• Cirkulární dichroismus je způsoben asymetrií molekulárních struktur
• Součástí biologických molekul jsou opticky aktivní molekuly cukrů
a aminokyseliny
• V případě uspořádání monomerních jednotek do šroubovice dochází
k výraznému zesílení optické aktivity celé makromolekuly
• Optická aktivita roztoků biologických molekul je použita k popisu jejich
struktury a zejména strukturních změn
Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR
38
Princip CD
• Látka je opticky aktivní, jestliže stáčí rovinu polarizovaného světla
• Rovinně polarizované světlo si můžeme rozložit na levotočivou a pravotočivou složku kruhově
polarizovaného světla.
• Jestliže levotočivá složka kruhově polarizovaného světla prochází prostředím jinou rychlostí (má jiný
index lomu n) než pravotočivá je složka kruhově polarizováného světla => dojde ke stočení roviny
polarizovaného světla
• Levotočivá složka kruhově polarizovaného světla je absorbována jinak než pravotočivá složka kruhově
polarizováného světla => dojde ke změně
z rovinně polarizovaného světla na elipticky polarizované
• Cirkulární dichroismus je definován jako rozdíl extinkčního koeficientu pro levo- a pravo-točivou
složku kruhově polar. světla CD = D =L- P
• často se měří elipticita q − ve stupních
• Stočení roviny polarizovaného světla a charakterizace elipticky
polarizovaného světla dává informaci o struktuře molekul v roztoku
Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR
Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR39
Rozklad rovinně polarizovaného světla na kruhově polarizované složky
40
Změna polarizace v asymetrickém prostředí
• V prostředí, kde se levotočivě kruhově pol. světlo pohybuje jinak než pravotočivě, dochází ke
změně vzájemného posunu kruhově polarizovaných složek, což způsobí stočení roviny
polarizace.
• V případě že se liší také absorpce levo- a pravo- kruh. pol. světla vzniká elipticky
polarizované světlo
Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR
41
Elipticita
Elipticita je úhel, který charakterizuje míru změny planárně polarizovaného
světla na elipticky polarizované.
Jestliže je světlo rovinně polarizováno q = 0
Jestliže je světlo kruhově polarizováno q = 45 °
)(298.3
][
180
)(
4
303.2
tan
PL
PL
LR
LR
EE
EE
q

q
q
−=
−=
+
−
=ER vektor elektr.
Intenzity pravotočivě
pol. složky
EL vektor elektr.
Intenzity levotočivě
pol. složky
Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR
42
Princip CD
• Látka je opticky aktivní, jestliže stáčí rovinu polarizovaného světla
• Rovinně polarizované světlo si můžeme rozložit na levotočivou a pravotočivou složku kruhově
polarizovaného světla.
• Levotočivá složka kruhově polarizovaného světla prochází prostředím jinou rychlostí (má jiný index
lomu n) než pravotočivá je složka kruhově polarizováného světla => dojde ke stočení roviny
polarizovaného světla
• Levotočivá složka kruhově polarizovaného světla je absorbována jinak než pravotočivá složka kruhově
polarizováného světla => dojde ke změně z rovinně polarizovaného světla na elipticky polarizované
• Cirkulární dichroismus je definován jako rozdíl extinkčního koeficientu pro levo- a pravo-točivou
složku kruhově polar.
světla CD = D =L- P
• často se měří elipticita q − ve stupních
• Stočení roviny polarizovaného světla a charakterizace elipticky
polarizovaného světla dává informaci o struktuře molekul v roztoku
Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR
Laskavě poskytnuto prof. Vorlíčkovou
Schéma přístroje na měření cirkulárního dichroismu
Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR
1. Fotonásobič
2. Kyvetový prostor
3. Modulátor
Tekutý krystal, který je piezoelektricky
střídavým proudem stlačován a
roztahován a tak střídavě moduluje
doprava a doleva kruhově
polarizovaný paprsek
5. Monochromátor
10. Lampa
44
Využití CD spektroskopie
• Určování sekundární struktury biomakromolekul
• Stanovení poměrného zastoupení jednotlivých konformací (a šroubovice,
b list u proteinů)
• Sledování již nepatrných strukturních změn
• Strukturní přechody DNA (A, B, Z) a proteinů
• Určování teplotní stability
• Sledování interakce protein – protein, protein-DNA
• Sledování terciální struktury proteinů
Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR
45
CD spektroskopie DNA
https://www.ibp.cz/cs/vyzkum/oddeleni/biofyzika-nukleovych-kyselin/informace-o-oddeleni
Vorlíčková, M., Kypr, J. and Sklenář, V.: NUCLEIC ACIDS: (c) SPECTROSCOPIC
METHODS, Encyklopedia of Analytical Science, vol. 6, sec. ed., Elsevier, Oxford,
(2005) 391-399
Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR
Cirkulární dichroismus v analýze optické čistoty léčiv
• Optická čistota léčiva (chirální organické látky) je významným aspektem sledovaným ve farmacii – předpisy FDA.
• U některých léčiv jsou biologicky aktivní i racemické směsi enantiomerů (např. Advil (u nás Ibuprofen) – obsahuje oba
enantiomery Ibuprofenu), ale u většiny známých chirálních léčiv je biologicky aktivní pouze jeden z jejich enantiomerů - ten, který
je schopný lépe se vázat na aktivní centrum enzymu nebo jiné cílové molekuly.
• K analýze optické čistoty chirálních léčiv se často využívají metody HPLC s použitím chirálních kolon, ale tyto metody jsou drahé
(cena chirální kolony cca 55 000 Kč), časově náročné (délka analýzy cca 60 - 120 min) a většinou vyžadují použití velkého
množství vzorku (100 – 500 mg). Výhodou metod jako jsou optická rotační disperze a cirkulární dichroismus je rychlost analýzy
(1 – 10 min) a použití menšího množství vzorku (10 - 50 mg).
• Metoda Cirkulárního dichroismu pro analýzu optické čistoty léčiva (její varianty VCD a ECD) byla proto nedávno zařazena
do Amerického lékopisu - prosinec 2016, USP kapitoly <782> a <1782> a také do Českého lékopisu – 2017, kapitola 2.2.41 .
• Příkladem chirálních organických molekul, u kterých hraje optická čistota důležitou roli v jejich biologické aktivitě, a u nichž lze
velmi dobře využít metodu CD, jsou například tyto látky: Alanin, Thalidomid, Ibuprofen, Warfarin, Metamfetamin, Amfetamin,
Pseudoefedrin a Diazepam.
• Zajímavé je, že u drog jako jsou Metamfetamin, Amfetamin a Pseudoefedrin jsou biologicky aktivní pouze S (-) enantiomery (tedy
levotočivé), zatímco u biologicky aktivních léčiv je tomu většinou naopak a zpravidla bývají biologicky aktivnější R (+) enantiomery
(tedy pravotočivé).
• Významnost analýzy optické čistoty chirálního léčiva nám, bohužel, velmi dobře dokazuje jeden z největších farmaceutických
omylů - případ léčiva Thalidomid. Léčivo zvané Contergan bylo doporučené a hojně používané proti ranním nevolnostem
u těhotných žen. Tento lék však způsobil smrt mnoha plodů a deformaci předních končetin mnoha narozených dětí. Léčivo totiž
přišlo na trh (v Německu v roce 1957) jako racemická směs dvou enantiomerů a až o mnoho let později se zjistilo, že pouze
R-enantiomer má požadované léčivé účinky, zatímco S-enantiomer způsobuje teratogenní deformace plodu.
CD spektrum léčiva Warfarin
(Zdroj: Jasco Applications Book, Circular dichroism and polarimeters)
Vypracovala a laskavě
poskytla Markéta Procházková
Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR
47
Jak funguje sledování 3D filmů
• Na plátno se promítají obrazy pro levé a pravé oko současně
• Na brýlích je na skle pro každé oko jiný polarizátor (je lineární
nebo cirkulární?)
• Složením různých obrazů pro každé oko vzniká prostorový obraz
Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR
Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR48
Mrknutí v 3D brýlích před zrcadlem
Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR49
Výsledný obraz
Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR50
Příště: přenos síly (energie) na dálku